基于KASP技术的稻瘟病抗性基因Pi9分子标记的开发与评价

【目的】开发抗稻瘟病基因Pi9的荧光分子标记,为抗稻瘟病水稻品种分子育种提供简便、可靠的基因分型检测方法。【方法】利用PCR克隆测序,并比对供体亲本与受体亲本之间抗稻瘟病基因Pi9序列的差异,开发1个基于SNP位点的高通量KASP分子标记。【结果】利用该标记对水稻杂交群体278个单株进行基因分型检测,结果发现141个单株的基因型为T/T,137个单株的基因型为C/C,分型结果与SSR分子标记检测结果一致;通过在岑溪稻瘟病高发区进行稻瘟病鉴定,验证了Pi9-KASP分子标记有较强可靠性。【结论】基于SNP位点开发的Pi9-KASP分子标记可以高效应用于水稻抗稻瘟病品系的种质资源鉴定及分子标记辅助选择育种中。     

基于PARMS技术的抗稻瘟病基因Pigm分子标记的开发

【目的】建立抗稻瘟病基因Pigm的荧光分子标记,为抗稻瘟病水稻品种分子育种提供简便、可靠的基因分型检测方法。【方法】利用抗稻瘟病基因Pigm基因序列与其等位基因Pi2、Pi9及感病品种日本晴中等位基因序列差异,结合PARMS技术(Penta-primer amplification refractory mutation system),建立Pigm基因的荧光分子标记。【结果】利用荧光分子标记PM-Pigm对48份水稻亲本材料进行检测,仅在谷梅4号中检测到Pigm荧光信号,并采用广西收集到的两个稻瘟病菌株ZB1和ZB13对48份水稻亲本进行了苗瘟抗性鉴定,验证分子标记有较强可靠性。【结论】Pigm荧光分子标记PM-Pigm能快速检测水稻是否包含Pigm抗性基因,为抗稻瘟病水稻分子标记辅助育种提供简便、可靠的基因筛选技术。     

聚合抗褐飞虱基因bph20（t）和bph21（t）

【目的】筛选聚合抗褐飞虱和抗稻瘟病基因水稻材料,为培育新型抗褐飞虱兼抗稻瘟病的水稻新种质提供参考。【方法】利用常规育种、分子标记辅助育种和抗病虫鉴定相结合的手段,将抗稻褐飞虱基因bph20（t）和bph21（t）以及广谱高抗稻瘟病基因Pi9聚合到优良保持系博ⅢB的遗传背景中。【结果】bph20（t）的分子标记RM540和BYL7、bph21（t）的分子标记RM5348和RM222未在稻褐飞虱抗、感亲本间扩增出特异条带,无明显的多态性,不能用于该育种群体抗褐飞虱基因bph20（t）和bph21（t）的检测。Pi9的显性分子标记pB8以及共显性分子标记PB9-1在稻瘟病抗、感亲本之间可扩增获得特异条带,具有多态性,可用于Pi9基因的检测。经抗虫鉴定并利用标记PB9-1对BC6F2群体的22株材料进行PCR扩增,含有Pi9基因杂合体的有10株,纯合体有6株,不含Pi9基因的有7株。用源自广西南宁田间感褐飞虱和稻瘟病菌株进行多次抗病虫鉴定,筛选获得一批抗褐飞虱材料,其中抗性与抗虫亲本BPH54相当的材料有6份,在这6份材料中含有Pi9基因且抗稻瘟病的材料有5份,对稻褐飞虱的抗性与供体亲本BPH54水平相当。【结论】通过常规育种、分子检测和抗虫鉴定相结合的办法,筛选获得5份聚合褐飞虱抗性基因（bph20和bph21）和抗稻瘟病基因Pi9的抗或高抗水稻中间材料,为选育新的双抗保持系和不育系提供种质材料。     

聚合抗褐飞虱基因bph20（t）和bph21（t）及抗稻瘟病基因Pi9水稻株系筛选

【目的】筛选聚合抗褐飞虱和抗稻瘟病基因水稻材料,为培育新型抗褐飞虱兼抗稻瘟病的水稻新种质提供参考。【方法】利用常规育种、分子标记辅助育种和抗病虫鉴定相结合的手段,将抗稻褐飞虱基因bph20（t）和bph21（t）以及广谱高抗稻瘟病基因Pi9聚合到优良保持系博ⅢB的遗传背景中。【结果】bph20（t）的分子标记RM540和BYL7、bph21（t）的分子标记RM5348和RM222未在稻褐飞虱抗、感亲本间扩增出特异条带,无明显的多态性,不能用于该育种群体抗褐飞虱基因bph20（t）和bph21（t）的检测。Pi9的显性分子标记pB8以及共显性分子标记PB9-1在稻瘟病抗、感亲本之间可扩增获得特异条带,具有多态性,可用于Pi9基因的检测。经抗虫鉴定并利用标记PB9-1对BC6F2群体的22株材料进行PCR扩增,含有Pi9基因杂合体的有10株,纯合体有6株,不含Pi9基因的有7株。用源自广西南宁田间感褐飞虱和稻瘟病菌株进行多次抗病虫鉴定,筛选获得一批抗褐飞虱材料,其中抗性与抗虫亲本BPH54相当的材料有6份,在这6份材料中含有Pi9基因且抗稻瘟病的材料有5份,对稻褐飞虱的抗性与供体亲本BPH54水平相当。【结论】通过常规育种、分子检测和抗虫鉴定相结合的办法,筛选获得5份聚合褐飞虱抗性基因（bph20和bph21）和抗稻瘟病基因Pi9的抗或高抗水稻中间材料,为选育新的双抗保持系和不育系提供种质材料。     

水稻抗稻瘟病基因Pi2的KASP标记开发与应用

【目的】水稻稻瘟病抗性基因Pi2对稻瘟病生理小种具有广谱抗性,开发Pi2的KASP分子标记并对其评价,为抗稻瘟病水稻品种分子育种提供简便、可靠的基因分型检测方法。【方法】利用593份自然群体中筛选出的不同抗性和亲缘关系的2份材料H-74和H-78,针对Pi2基因核心区域的SNP位点开发成KASP标记Pi2-C3。【结果】利用标记Pi2-C3对自然群体中的84份材料进行KASP基因分型,结果表明,该标记可以准确地将不同水稻材料的Pi2位点分为抗病基因型、杂合基因型和感病基因型,是一种高效鉴定抗稻瘟病基因Pi2的方法。利用标记Pi2-C3对阳江市病圃材料进行检测,结合表型调查结果发现,检测到含有Pi2基因的46份材料均表现出不同程度的稻瘟病抗性,表明该标记可以用于检测材料在病圃的发病情况。【结论】本研究采用KASP技术,开发了能准确检测Pi2基因的特异性分子标记Pi2-C3,并建立一套水稻Pi2基因的KASP基因分型体系,对提高抗性育种效率,改良抗稻瘟病水稻品种具有重要应用价值。     

吉林省主要水稻品种稻瘟病抗性分析及分子辅助改良

为深入研究已经克隆的部分稻瘟病抗性基因在吉林省主要水稻品种和优良品系的分布,并为分子标记辅助选择培育稻瘟病抗性品种提供理论依据。根据已经克隆的10个稻瘟病抗性基因序列设计特异引物,对目前吉林省主要推广的13个水稻品种和15个主要品系进行稻瘟病抗性基因筛选。根据稻瘟病抗性基因筛选结果,进一步进行聚类分析、杂交组合配制及分子标记辅助选择,共获得24株理想的多基因聚合F4单株,并进行苗期稻瘟病接种鉴定。结果表明,Pi2、Pi36、Pi37、Pikh、Piz-t和Pi-ta等稻瘟病抗性基因在目前吉林省主要推广水稻品种中分布较为广泛,而Pi9、Pib、Pi21和Pi-d2分布较少。同时发现,品种间稻瘟病抗性基因有较好的互补性,可以有效地进行多基因聚合。因此,在吉林省通过分子标记辅助选择培育抗性优良的稻瘟病新品种是一种有效可行的途径。     

分子标记辅助选育抗褐飞虱和抗稻瘟病的水稻恢复系

【目的】通过分子标记辅助选择培育兼抗褐飞虱和稻瘟病的水稻新恢复系,为杂交水稻抗病虫害育种提供新的种质资源。【方法】利用常规回交育种、分子标记辅助选择和抗病虫鉴定相结合的手段,将广谱高抗稻瘟病基因Pi9导入携带抗稻褐飞虱基因Bph14和Bph15的优良恢复系桂恢1561中。【结果】在BC_2F_3中检测到17个株系聚合了Bph14、Bph15和Pi9的纯合基因,其中GH18-1、GH18-7、GH18-10和GH18-18等4个株系农艺性状与轮回亲本桂恢1561相似,褐飞虱及稻瘟病抗性均达到抗级水平。【结论】通过常规的回交选育、分子标记和抗性鉴定相结合的方法,筛选获得4份聚合了褐飞虱抗性基因(Bph14、Bph15)和抗稻瘟病基因Pi9的抗性水稻中间材料,为选育新的双抗病虫害水稻恢复系提供种质资源。     

6个稻瘟病抗性基因在浙江省主栽水稻品种中的分布和抗性评价

【目的】检测浙江省40份水稻栽培品种和6份稻瘟病菌生理小种鉴别品种中6个抗性基因分布情况,同时鉴定品种苗瘟抗性水平,探讨携带抗性基因和抗性水平相关性。【方法】利用功能性分子标记检测品种中Pi1、Pi9/Piz、Pi2/Pizt、Pikh、Pikm、Pita,6个稻瘟病抗性基因的分布情况。用2015-2017年田间采集到的141个稻瘟菌菌株鉴定46个水稻品种苗瘟抗性水平。【结果】6个抗性基因在浙江省栽培品种中分布频率不同,其中Pita基因分布最广,占47.83%;其次是Pikh,占41.30%;抗性基因Pi2/Pizt和Pikm在栽培品种中分布频率相等,均为34.78%;抗性基因Pi9/Piz在栽培品种中分布较少,仅有21.74%;抗性基因Pi1仅在稻瘟病菌生理小种鉴别品种TTP中检测到。抗性水平鉴定结果显示22个品种的抗性频率在60%以上,两个品种的抗性频率达到80%以上。【结论】浙江40份水稻栽培品种和6份稻瘟病菌生理小种鉴别品种携带抗性基因和其抗性水平部分相关。     

新疆水稻主要育成品种13个稻瘟病的抗性基因分布

【目的】明确新疆主要育成水稻品种中稻瘟病抗性基因的分布状况,为稻瘟病抗性育种提供依据。【方法】研究以31份新疆选育的水稻品种为材料,利用13个抗稻瘟病基因的特异性分子标记,进行PCR鉴定,初步建立新疆主要育成品种的抗性基因分布情况。【结果】31份供试材料中均无Pi21基因存在;表现为广谱抗性的Pi9、Pita、Pib和Pikm基因所占比例偏少,分别占9.68%、22.58%、6.45%、12.90%;表现为广谱抗性的Pi2、Pigm、Pil、Pikh/Pi54、Pi63和表现为生理小种特异性抗性的Pia、Pid2、Pid3/Pi25基因广泛存在,所占比率67.74%~100%;不同水稻品种抗性基因数量分布在5~11个,含11个抗性基因的品种是新稻23号,其聚合了除Pi21和Pid2外其余所有抗性基因。【结论】新疆主要水稻育成品种中广泛存在具有光谱抗性的Pi2、Pigm、Pil、Pikh/Pi54、Pi63和表现为生理小种特异性抗性的Pia、Pid2、Pid3/Pi25基因,利用特异性分子标记可以有效快速鉴定品种中的抗性基因的存在和分布情况。     

陕西省水稻种质资源中Pi9基因的分布状况

【目的】明确陕西省主要稻种资源中Pi9基因的分布状况,为稻瘟病抗性育种提供依据。【方法】利用抗稻瘟病抗性基因Pi9的显性标记PB8和共显性标记PB9-1对2012年长江上游国家水稻区域试验材料62份、陕西省水稻区域试验材料99份及陕西省水稻研究所原始材料圃331份材料进行Pi9基因位点检测。【结果】在161份区试材料中,13份为抗性基因纯合体,18份为抗性基因杂合体,其余为感性基因纯合体。331份材料原始材料中,18份为抗性基因纯合体,15份材料未检测出条带,其余均为感性基因纯合体。【结论】陕西省主要水稻种质资源中Pi9基因所占比例较少。     

水稻稻瘟病抗性基因在抗性育种中的研究进展

【目的】 从水稻稻瘟病抗性的机理、抗性基因的定位、克隆以及抗性基因在育种中的应用,为水稻抗性基因的鉴定和抗性育种提供参考。【方法】 汇总和对比分析国内外的相关文献,分析不同抗性基因在水稻抗稻瘟病中的应用研究进展。【结果】 已有大约100个抗性基因被鉴定出和500个抗病基因相关的数量性状位点;在水稻基因组中被鉴定和定位的基因中,已有37个基因被成功克隆;在不同的育种方法中,基因工程育种是水稻稻瘟病抗性育种中最直接的方法。【结论】 水稻稻瘟病抗性基因的鉴定是抗性育种的基础,抗性基因的充分利用有利于快速有效的选育出新的具有广谱和持久抗性的抗病品种。     

水稻抗稻瘟病Pib基因的分子标记辅助选择与应用

 【目的】为探索抗稻瘟病Pib基因的分子标记用于水稻抗稻瘟病辅助选育,36个四川地方稻瘟病菌株被用来检测Pib基因的抗性。同时利用检测感病等位基因Pib的显性标记Lys145,并结合前人报道的检测抗病等位基因Pib的显性标记Pibdom组成一套水稻抗稻瘟病基因Pib显性分子标记。【方法】利用这套水稻抗稻瘟病基因Pib显性分子标记对122个杂交稻亲本或材料进行分子鉴定,并分别采用稻瘟病菌株05-12（ZB13）和05-30（ZC15）单小种接种试验进行致病性测试。【结果】所检测的122个杂交稻亲本或材料中,只有7个杂交稻亲本或材料含抗病基因Pib,且对稻瘟病菌菌株ZB13和ZC15表现抗病反应。此外,利用这套水稻抗稻瘟病基因Pib显性分子标记对600个杂交F2代单株进行早期筛选,得到185个抗病基因Pib纯合的单株,田间抗性调查结果与抗病基因分子检测结果一致。【结论】该套显性分子标记可应用于水稻抗稻瘟病基因Pib的分子标记辅助选育。     

利用Pi9基因序列标记辅助选择改良籼稻稻瘟病抗性

利用广谱抗稻瘟病基因Pi9基因序列设计的特异分子标记Pi9–a,通过回交育种和分子标记辅助选择技术,改良8份受体水稻材料(丰源B、Ⅱ32B、天龙香103、香丰187、明恢63、轮回422、R747、25H003)的稻瘟病抗性。结果表明:分子标记Pi9–a对8份受体亲本与Pi9供体亲本75–1–127间进行的多态性检测中,除香丰187外,其余7个组合间均存在稳定明显的多态;对4个BC1F1群体进行随机取样的基因型和表型鉴定中,Pi9–a对抗稻瘟病表型选择的效率均为100%。     

水稻骨干恢复系川恢907抗稻瘟病基因聚合与精准改良

【目的】精准改良骨干恢复系川恢907稻瘟病抗性,为培育抗稻瘟病杂交水稻新品种提供优良恢复系。【方法】本文通过多代回交与分子标记辅助选择技术相结合,以五山丝苗为抗稻瘟病基因Pi2供体,精准改良骨干恢复系川恢907(含有抗稻瘟病基因Pik和Pita)的稻瘟病抗性。【结果】经T检验,改良后聚合了Pi2、Pik和Pita 3个抗稻瘟病基因的新川恢907与原始材料间的主要农艺性状无显著差异;基于NY/T 1433-2014中48对SSR引物对其进行指纹图谱鉴定,二者之间无差异;经稻瘟病病圃田间抗性鉴定,新川恢907稻瘟病叶瘟1级、颈瘟1级,综合抗病指数1.0,抗稻瘟病。【结论】通过抗病基因聚合,显著提高了川恢907的稻瘟病抗性,保持了川恢907的原有优良特性。     

水稻抗稻瘟病基因Pi35基因内特异SNP共显性分子标记开发及应用研究

Pi35是具有广谱持久抗性的水稻抗稻瘟病基因,在水稻抗病育种中具有重要作用。通过将不同等位基因测序及序列比对鉴定到1个Pi35基因内特异SNP位点并开发了一套鉴定该SNP的分子标记引物研究结果表明,利用该引物对水稻DNA进行PCR扩增,可快速判断待测水稻Pi35的基因型。该方法简便快速、成本低廉,可广泛应用于分子标记辅助选择育种或者水稻种质资源Pi35基因型鉴定。     

基于PARMS技术的抗稻瘟病基因Piz-t分子标记的开发与利用

稻瘟病是水稻生产中的主要病害之一，严重影响着水稻的产量。利用抗稻瘟病基因选育抗病品种是控制稻瘟病大面积发生最经济有效的途径。Piz-t是Piz位点的一个主效抗稻瘟病基因，具有广谱稻瘟病抗性，对于改良水稻品种稻瘟病抗性具有重要的应用价值，但是缺少高通量的鉴定技术。本研究利用Piz-t与其等位基因Pi2、Pi9、Pigm、Pi50的序列差异，开发了一套基于PARMS检测技术(Penta-primer amplification refractory mutation system)的荧光分子标记。利用该方法检测了98份水稻资源，鉴定到2个携带抗稻瘟病基因Piz-t的水稻品种，并对育种后代材料进行检测，结果表明该方法能够准确的检测出育种后代材料中Piz-t基因型，以及是否纯和，为水稻抗稻瘟病分子标记辅助育种提供简便、可靠、低价高通量的基因鉴定技术。     

32份粳稻骨干亲本抗稻瘟病基因的分子检测

为明确Pi-ta和Pi9稻瘟病抗性主效基因在32份粳稻骨干亲本中的分布状况,利用抗稻瘟病基因Pi-ta和Pi9的分子标记对32份粳稻骨干亲本进行检测。结果表明,在32份骨干亲本中,Pi-ta抗性基因检出率为46.88%,Pi9抗性基因检出率为12.50%,同时检测到Pi-ta和Pi9抗病基因,检出率为3.12%,不含有Pi-ta和Pi9抗病基因的材料占比为43.75%。在骨干亲本中,Pi-ta单个基因的检出率较高,Pi9单个基因的检出率较低,同时含有Pi-ta和Pi9抗病基因的材料较少,因此可见,多个抗稻瘟病基因的聚合育种是今后水稻抗病育种的重点。     

以三明显性核不育系转导稻瘟病抗性基因Pi9改良恢复系的效果

【目的】将广谱抗稻瘟病基因Pi9导入恢复系双抗明占,以提高其组合抗病能力。【方法】通过构建Pi9基因的三明显性核不育系载体作中间"架桥",结合分子标记辅助选择,每个回交世代选择有Pi9标记基因带型的显性核不育株与双抗明占回交,至BC4F1代筛选获得检测有Pi9标记基因带型可育株自交纯合Pi9基因,获得卸载了核不育基因的双抗明占抗病近等基因系。【结果】获选的6个改良系经田间抗性鉴定有5个抗稻瘟病能力得到显著提升,进行配合力测验及农艺性状比较分析,改良系Y25-1一般配合力表现最好,抗病能力强,主要农艺性状与双抗明占相近,可作为抗病的双抗明占推广应用。【结论】通过水稻三明显性核不育系作中间"架桥",导入Pi9基因可有效提高双抗明占及其组合抗稻瘟病能力。     

利用BSA-Seq方法鉴定谷丰B抗稻瘟病基因

【目的】挖掘和鉴定谷丰B稻瘟病抗性基因,了解谷丰B稻瘟病抗性遗传模式。【方法】以谷丰B和日本晴杂交获得F1和F2代遗传群体,接种稻瘟菌不同生理小种并分析抗病遗传模式;在F2群体中挑选极端抗/感单株构建DNA混合池,利用群体分离分析法(BSA)定位关联区域。【结果】谷丰B对KJ201、 RB22、 CHNOS、RB6、2Y838-1、501-3和IR16-1等菌株均表现高抗性,表明谷丰B基因组可能携带了广谱高抗稻瘟病基因。谷丰B和日本晴杂交,F1群体表现抗501-3和IR16-1,F2群体的抗病/感病分离比不符合3∶1,推测谷丰B基因组存在多个位点影响稻瘟病抗性。对F2群体的极端抗病、感病混合池及亲本DNA进行全基因组测序,鉴定了1 756 964个单核苷酸多态性(SNPs)标记。分析子代△SNP-index,定位到2个与抗病性显著关联区间,分别为Chr.6:10 082-11397 kb和Chr.11:120-266 kb。其中,6号染色体的关联区间与Pi2/9抗病位点等位,区间内含有4 006个SNPs和623个插入缺失(InDels)标记;11号染色体的关联区间含有752个SNPs和195个InDels标记。【结论】谷丰B对强致病力501-3菌株抗性可能是由第6号和11号染色体上的基因共同控制。研究结果为谷丰B抗性基因的精细定位及基因克隆奠定了基础,并为水稻抗稻瘟病分子标记辅助选择提供标记资源。     

水稻抗稻瘟病基因Pi1和Pi2聚合系的获得及其抗性评价

[目的]获得水稻抗稻瘟病基因Pi1和Pi2聚合系,并对其进行抗性评价。[方法]以GD-7为稻瘟病抗性基因供体,扬稻6号为受体,通过回交转育结合分子标记辅助选择,选育出10个Pi1基因和Pi2基因双基因纯合且农艺性状优良的水稻新品系,在湖北省水稻品种区域试验的稻瘟病抗性鉴定点恩施和宜昌分别对这些品系的稻瘟病抗性进行了田间鉴定。[结果]这些品系的抗性综合指数在0.8~2.0,抗级为1,表现为抗,而受体亲本扬稻6号的抗性综合指数分别为8.8和8.5,抗级为9,表现为高感,其中一个品系R587与不育系广占63S配制的杂交组合的抗性综合指数分别为2.5和3.5,抗级为3,表现为中抗,而对照扬两优6号的抗性综合指数分别为7.9和8.2,抗级为9,表现为高感。[结论]通过分子标记辅助选择聚合Pi1基因和Pi2基因能显著提高聚合系及其相应杂交组合的稻瘟病抗性。