基于KASP技术的稻瘟病抗性基因Pi9分子标记的开发与评价

【目的】开发抗稻瘟病基因Pi9的荧光分子标记,为抗稻瘟病水稻品种分子育种提供简便、可靠的基因分型检测方法。【方法】利用PCR克隆测序,并比对供体亲本与受体亲本之间抗稻瘟病基因Pi9序列的差异,开发1个基于SNP位点的高通量KASP分子标记。【结果】利用该标记对水稻杂交群体278个单株进行基因分型检测,结果发现141个单株的基因型为T/T,137个单株的基因型为C/C,分型结果与SSR分子标记检测结果一致;通过在岑溪稻瘟病高发区进行稻瘟病鉴定,验证了Pi9-KASP分子标记有较强可靠性。【结论】基于SNP位点开发的Pi9-KASP分子标记可以高效应用于水稻抗稻瘟病品系的种质资源鉴定及分子标记辅助选择育种中。     

水稻抗稻瘟病基因Pi2的KASP标记开发与应用

【目的】水稻稻瘟病抗性基因Pi2对稻瘟病生理小种具有广谱抗性,开发Pi2的KASP分子标记并对其评价,为抗稻瘟病水稻品种分子育种提供简便、可靠的基因分型检测方法。【方法】利用593份自然群体中筛选出的不同抗性和亲缘关系的2份材料H-74和H-78,针对Pi2基因核心区域的SNP位点开发成KASP标记Pi2-C3。【结果】利用标记Pi2-C3对自然群体中的84份材料进行KASP基因分型,结果表明,该标记可以准确地将不同水稻材料的Pi2位点分为抗病基因型、杂合基因型和感病基因型,是一种高效鉴定抗稻瘟病基因Pi2的方法。利用标记Pi2-C3对阳江市病圃材料进行检测,结合表型调查结果发现,检测到含有Pi2基因的46份材料均表现出不同程度的稻瘟病抗性,表明该标记可以用于检测材料在病圃的发病情况。【结论】本研究采用KASP技术,开发了能准确检测Pi2基因的特异性分子标记Pi2-C3,并建立一套水稻Pi2基因的KASP基因分型体系,对提高抗性育种效率,改良抗稻瘟病水稻品种具有重要应用价值。     

基于PARMS技术的抗稻瘟病基因Piz-t分子标记的开发与利用

稻瘟病是水稻生产中的主要病害之一，严重影响着水稻的产量。利用抗稻瘟病基因选育抗病品种是控制稻瘟病大面积发生最经济有效的途径。Piz-t是Piz位点的一个主效抗稻瘟病基因，具有广谱稻瘟病抗性，对于改良水稻品种稻瘟病抗性具有重要的应用价值，但是缺少高通量的鉴定技术。本研究利用Piz-t与其等位基因Pi2、Pi9、Pigm、Pi50的序列差异，开发了一套基于PARMS检测技术(Penta-primer amplification refractory mutation system)的荧光分子标记。利用该方法检测了98份水稻资源，鉴定到2个携带抗稻瘟病基因Piz-t的水稻品种，并对育种后代材料进行检测，结果表明该方法能够准确的检测出育种后代材料中Piz-t基因型，以及是否纯和，为水稻抗稻瘟病分子标记辅助育种提供简便、可靠、低价高通量的基因鉴定技术。     

新疆水稻主要育成品种13个稻瘟病的抗性基因分布

【目的】明确新疆主要育成水稻品种中稻瘟病抗性基因的分布状况,为稻瘟病抗性育种提供依据。【方法】研究以31份新疆选育的水稻品种为材料,利用13个抗稻瘟病基因的特异性分子标记,进行PCR鉴定,初步建立新疆主要育成品种的抗性基因分布情况。【结果】31份供试材料中均无Pi21基因存在;表现为广谱抗性的Pi9、Pita、Pib和Pikm基因所占比例偏少,分别占9.68%、22.58%、6.45%、12.90%;表现为广谱抗性的Pi2、Pigm、Pil、Pikh/Pi54、Pi63和表现为生理小种特异性抗性的Pia、Pid2、Pid3/Pi25基因广泛存在,所占比率67.74%~100%;不同水稻品种抗性基因数量分布在5~11个,含11个抗性基因的品种是新稻23号,其聚合了除Pi21和Pid2外其余所有抗性基因。【结论】新疆主要水稻育成品种中广泛存在具有光谱抗性的Pi2、Pigm、Pil、Pikh/Pi54、Pi63和表现为生理小种特异性抗性的Pia、Pid2、Pid3/Pi25基因,利用特异性分子标记可以有效快速鉴定品种中的抗性基因的存在和分布情况。     

聚合抗褐飞虱基因bph20（t）和bph21（t）及抗稻瘟病基因Pi9水稻株系筛选

【目的】筛选聚合抗褐飞虱和抗稻瘟病基因水稻材料,为培育新型抗褐飞虱兼抗稻瘟病的水稻新种质提供参考。【方法】利用常规育种、分子标记辅助育种和抗病虫鉴定相结合的手段,将抗稻褐飞虱基因bph20（t）和bph21（t）以及广谱高抗稻瘟病基因Pi9聚合到优良保持系博ⅢB的遗传背景中。【结果】bph20（t）的分子标记RM540和BYL7、bph21（t）的分子标记RM5348和RM222未在稻褐飞虱抗、感亲本间扩增出特异条带,无明显的多态性,不能用于该育种群体抗褐飞虱基因bph20（t）和bph21（t）的检测。Pi9的显性分子标记pB8以及共显性分子标记PB9-1在稻瘟病抗、感亲本之间可扩增获得特异条带,具有多态性,可用于Pi9基因的检测。经抗虫鉴定并利用标记PB9-1对BC6F2群体的22株材料进行PCR扩增,含有Pi9基因杂合体的有10株,纯合体有6株,不含Pi9基因的有7株。用源自广西南宁田间感褐飞虱和稻瘟病菌株进行多次抗病虫鉴定,筛选获得一批抗褐飞虱材料,其中抗性与抗虫亲本BPH54相当的材料有6份,在这6份材料中含有Pi9基因且抗稻瘟病的材料有5份,对稻褐飞虱的抗性与供体亲本BPH54水平相当。【结论】通过常规育种、分子检测和抗虫鉴定相结合的办法,筛选获得5份聚合褐飞虱抗性基因（bph20和bph21）和抗稻瘟病基因Pi9的抗或高抗水稻中间材料,为选育新的双抗保持系和不育系提供种质材料。     

水稻抗稻瘟病Pib基因的分子标记辅助选择与应用

 【目的】为探索抗稻瘟病Pib基因的分子标记用于水稻抗稻瘟病辅助选育,36个四川地方稻瘟病菌株被用来检测Pib基因的抗性。同时利用检测感病等位基因Pib的显性标记Lys145,并结合前人报道的检测抗病等位基因Pib的显性标记Pibdom组成一套水稻抗稻瘟病基因Pib显性分子标记。【方法】利用这套水稻抗稻瘟病基因Pib显性分子标记对122个杂交稻亲本或材料进行分子鉴定,并分别采用稻瘟病菌株05-12（ZB13）和05-30（ZC15）单小种接种试验进行致病性测试。【结果】所检测的122个杂交稻亲本或材料中,只有7个杂交稻亲本或材料含抗病基因Pib,且对稻瘟病菌菌株ZB13和ZC15表现抗病反应。此外,利用这套水稻抗稻瘟病基因Pib显性分子标记对600个杂交F2代单株进行早期筛选,得到185个抗病基因Pib纯合的单株,田间抗性调查结果与抗病基因分子检测结果一致。【结论】该套显性分子标记可应用于水稻抗稻瘟病基因Pib的分子标记辅助选育。     

水稻抗稻瘟病基因Pi-ta、Pi-b、Pigm和Pi54在骨干亲本中的分布以及对穗颈瘟抗性的作用

【目的】为了分析不同抗性基因和基因组合对穗颈瘟抗性的变化。【方法】利用水稻稻瘟病抗病基因Pi-ta、Pi-b、Pigm和Pi54的功能或紧密连锁标记,对经过多年抗性筛选的80份骨干亲本材料进行基因型分析,并进行连续两年穗颈瘟接种鉴定。【结果】在80份试验材料中,只有4份携带Pi-b基因,5份携带Pi54基因,8份携带Pi-b+Pi54基因组合、10份携带Pi-b+Pi54+Pigm基因组合,只有Pi-b+Pi54+Pigm基因组合没有出现高感材料。连续两年穗颈瘟接种鉴定结果与基因型的相关性分析显示,单个抗病基因的抗病能力在逐步减弱,甚至丧失。【结论】在水稻品种选育中,聚合抗性强、抗谱互补的基因是增强水稻抗病能力的有效途径。     

聚合抗褐飞虱基因bph20（t）和bph21（t）

【目的】筛选聚合抗褐飞虱和抗稻瘟病基因水稻材料,为培育新型抗褐飞虱兼抗稻瘟病的水稻新种质提供参考。【方法】利用常规育种、分子标记辅助育种和抗病虫鉴定相结合的手段,将抗稻褐飞虱基因bph20（t）和bph21（t）以及广谱高抗稻瘟病基因Pi9聚合到优良保持系博ⅢB的遗传背景中。【结果】bph20（t）的分子标记RM540和BYL7、bph21（t）的分子标记RM5348和RM222未在稻褐飞虱抗、感亲本间扩增出特异条带,无明显的多态性,不能用于该育种群体抗褐飞虱基因bph20（t）和bph21（t）的检测。Pi9的显性分子标记pB8以及共显性分子标记PB9-1在稻瘟病抗、感亲本之间可扩增获得特异条带,具有多态性,可用于Pi9基因的检测。经抗虫鉴定并利用标记PB9-1对BC6F2群体的22株材料进行PCR扩增,含有Pi9基因杂合体的有10株,纯合体有6株,不含Pi9基因的有7株。用源自广西南宁田间感褐飞虱和稻瘟病菌株进行多次抗病虫鉴定,筛选获得一批抗褐飞虱材料,其中抗性与抗虫亲本BPH54相当的材料有6份,在这6份材料中含有Pi9基因且抗稻瘟病的材料有5份,对稻褐飞虱的抗性与供体亲本BPH54水平相当。【结论】通过常规育种、分子检测和抗虫鉴定相结合的办法,筛选获得5份聚合褐飞虱抗性基因（bph20和bph21）和抗稻瘟病基因Pi9的抗或高抗水稻中间材料,为选育新的双抗保持系和不育系提供种质材料。     

陕西省水稻种质资源中Pi9基因的分布状况

【目的】明确陕西省主要稻种资源中Pi9基因的分布状况,为稻瘟病抗性育种提供依据。【方法】利用抗稻瘟病抗性基因Pi9的显性标记PB8和共显性标记PB9-1对2012年长江上游国家水稻区域试验材料62份、陕西省水稻区域试验材料99份及陕西省水稻研究所原始材料圃331份材料进行Pi9基因位点检测。【结果】在161份区试材料中,13份为抗性基因纯合体,18份为抗性基因杂合体,其余为感性基因纯合体。331份材料原始材料中,18份为抗性基因纯合体,15份材料未检测出条带,其余均为感性基因纯合体。【结论】陕西省主要水稻种质资源中Pi9基因所占比例较少。     

32份粳稻骨干亲本抗稻瘟病基因的分子检测

为明确Pi-ta和Pi9稻瘟病抗性主效基因在32份粳稻骨干亲本中的分布状况,利用抗稻瘟病基因Pi-ta和Pi9的分子标记对32份粳稻骨干亲本进行检测。结果表明,在32份骨干亲本中,Pi-ta抗性基因检出率为46.88%,Pi9抗性基因检出率为12.50%,同时检测到Pi-ta和Pi9抗病基因,检出率为3.12%,不含有Pi-ta和Pi9抗病基因的材料占比为43.75%。在骨干亲本中,Pi-ta单个基因的检出率较高,Pi9单个基因的检出率较低,同时含有Pi-ta和Pi9抗病基因的材料较少,因此可见,多个抗稻瘟病基因的聚合育种是今后水稻抗病育种的重点。     

分子标记辅助选育抗褐飞虱和抗稻瘟病的水稻恢复系

【目的】通过分子标记辅助选择培育兼抗褐飞虱和稻瘟病的水稻新恢复系,为杂交水稻抗病虫害育种提供新的种质资源。【方法】利用常规回交育种、分子标记辅助选择和抗病虫鉴定相结合的手段,将广谱高抗稻瘟病基因Pi9导入携带抗稻褐飞虱基因Bph14和Bph15的优良恢复系桂恢1561中。【结果】在BC_2F_3中检测到17个株系聚合了Bph14、Bph15和Pi9的纯合基因,其中GH18-1、GH18-7、GH18-10和GH18-18等4个株系农艺性状与轮回亲本桂恢1561相似,褐飞虱及稻瘟病抗性均达到抗级水平。【结论】通过常规的回交选育、分子标记和抗性鉴定相结合的方法,筛选获得4份聚合了褐飞虱抗性基因(Bph14、Bph15)和抗稻瘟病基因Pi9的抗性水稻中间材料,为选育新的双抗病虫害水稻恢复系提供种质资源。     

宁夏自育水稻品种及部分引进品种的稻瘟病抗性基因分子标记检测

为明确宁夏水稻种质资源中含有的抗稻瘟病基因型及基因数量,为水稻抗稻瘟病分子标记辅助选择育种奠定基础。采用与抗稻瘟病基因Pita、Pi-kh、Pib、Pi2、Pi-km、Pi9、Pi5紧密连锁的7个分子标记,对25份宁夏自育水稻品种和55份引进水稻品种的抗稻瘟病基因进行分子检测。结果表明,宁夏自育水稻品种的抗稻瘟病基因较少,68%的材料仅含1~2个抗瘟基因,缺乏Pita、Pi2基因;抗病性鉴定也证实,只有8份材料达到中等抗性,主要含有Pib、Pi-km、Pi9抗瘟基因。37%的引进品种含3~6个抗稻瘟病基因,主要抗瘟基因有Pib、Pi-kh、Pi-km、Pi2、Pi9和Pita,这些材料均可为宁夏水稻抗稻瘟病的分子标记辅助选择育种提供抗病基因。     

宁夏水稻品种抗稻瘟病基因Pi-ta、Pi-b和Pi9的检测分析

为明确宁夏水稻品种中抗稻瘟病基因Pi-ta、Pi-b和Pi9的分布情况,为宁夏水稻抗穗颈瘟病的分子标记辅助选择育种奠定基础。利用Pi-ta、Pi-b和Pi9 3个与抗稻瘟病基因紧密连锁的功能标记,对94份宁夏水稻品种进行抗稻瘟病基因的分子检测。结果表明,宁夏水稻品种中含Pi-ta抗性基因的占46.8%,含Pi-b抗性基因的占93.6%,含Pi9抗性基因的占27.7%,同时含有Pi-ta和Pi-b抗性基因的占44.7%,同时含有Pi-ta、Pi-b和Pi9抗性基因的占12.8%。根据报道,Pi-ta、Pi-b基因的联合效应与穗颈瘟抗性正相关系数为0.71,表明从宁夏水稻品种中选育抗穗颈瘟品种是有基因基础的。     

水稻抗稻瘟病基因分子检测及抗性评价

为预防单一稻瘟病基因抗性容易丧失,培育持久性抗稻瘟病水稻新品种,本研究利用4份保持系、6份恢复系和3份常规稻品种为受体亲本,以75-1-127(含有稻瘟病基因Pi9)和U19(含有抗稻瘟病基因Pi25)为供体亲本,经过多代选择,获得了48份田间高代材料。叶瘟抗性鉴定结果表明,48份高代株系材料中5份表现抗,25份表现为中抗,其余均表现为中感及以上。分子标记辅助选择结果表明,19份高代株系含有抗稻瘟病基因Pi9,5份含有抗稻瘟病基因Pi25。     

基于PARMS技术的水稻粒形基因GW8分子标记的开发

【目的】开发水稻粒宽调控基因GW8的荧光分子标记,为快速、准确鉴定其基因型提供技术支持。【方法】通过与宽粒亲本GW8基因序列进行比对可知,窄粒杂交稻亲本美B的GW8基因序列在第二内含子有2个碱基缺失差异的特性之一,据此结合五引物扩增受阻突变体系技术,建立GW8基因荧光分子标记PM-GW8。【结果】利用荧光分子标记PM-GW8对42份籼稻亲本材料进行鉴定,仅在美B中检测到有2个碱基缺失的荧光信号。对亲本材料的谷粒宽度进行测量,其中美B的粒宽相对其他品种较窄,验证了该分子标记检测GW8的基因型与粒宽表型相符合。【结论】GW8荧光分子标记PM-GW8能快速检测水稻是否存在2个碱基缺失的GW8基因,为利用分子标记辅助选择改良水稻粒宽提供高效、可靠的基因分型技术。     

华南常用籼稻亲本稻瘟病抗性评价及抗性基因鉴定

[目的]评价分析华南地区常用籼稻亲本稻瘟病抗性及抗性基因,为水稻稻瘟病抗性育种提供理论依据.[方法]利用人工接种鉴定对52份华南地区常用籼稻亲本进行稻瘟病抗性分析,同时利用分子标记检测稻株携带的抗性基因,分析亲本材料稻瘟病抗性与其所携带稻瘟病抗性基因间的关系.[结果]从52份适应华南生态条件的籼稻亲本材料中筛选获得4份广谱抗源(2份抗谱为100.0%,2份抗谱为92.9%);常规稻较恢复系和保持系具有更高的稻瘟病抗性.ZA1、ZA9和ZB9生理小种较ZB1和ZB5生理小种表现出更强的致病力,具有较低的抗性频率.Pi-ta和Pi54基因的出现频率最高,均为0.42;其次是Pib基因,出现频率为0.37;Pi-km基因的出现频率较低,仅0.06;所有籼稻亲本材料中均未检测出Pi9基因.携带Pib+Pi54+Pi-km和Pi-ta+Pib+Pi54三基因稻株的抗性高于所有单基因或双基因稻株.[结论]华南常用籼稻亲本材料中存在着优良的稻瘟病广谱抗源,可利用这些抗源拓宽育种材料的遗传背景,培育抗病优良品种.多个抗性基因聚合能有效提高稻株对稻瘟病不同生理小种的抗性,在育种实践中应加强多基因聚合材料的创制和利用研究.     

云南粳型地方稻资源抗稻瘟病鉴定评价

【目的】鉴定和筛选获得云南粳型地方稻抗稻瘟病种质资源,明确其稻瘟病抗性及抗病基因分布,为合理利用水稻抗稻瘟病种质资源及其布局提供参考。【方法】采用病圃自然鉴定与人工接种相结合的方法,对150份云南粳型地方稻资源的稻瘟病抗性进行鉴定,并利用9个已克隆基因（Pid4、Pi25、Pi35、Pi36、Pikm、Pigm、Pi37、Pi56、Pi33）和2个已定位基因（Pi27、Pi23）对供试稻种资源进行基因型检测,明确抗病基因在抗稻瘟病材料中的分布。【结果】从150份水稻材料中共鉴定出抗稻瘟病（叶瘟或穗颈瘟）材料45份,45份材料中携带Pi25、Pi23、Pikm、Pi35、Pi36、Pi33、Pi27、Pi37、Pid4、Pigm抗性基因的材料分别有34份（75.6%）、25（55.6%）、25份（55.6%）、22份（48.9%）、14份（31.1%）、14份（31.1%）、12份（26.7%）、10份（22.2%）、6份（13.3%）和5份（11.1%）,未检测到含有Pi56的材料。45份抗性材料含有的抗性基因数量介于1~7,大部分含有3~5个,其中携带3个抗性基因材料13份占28.9%,携带4个抗性基因材料8份占17.8%,携带5个抗性基因材料11份占24.4%。抗病能力较强的材料黑壳谷携带6个抗病基因（Pi25、Pi35、Pi36、Pikm、Pi37和Pi33）,光壳花糯携带5个抗病基因（Pi35、Pi36、Pikm、Pi37和Pi33）。【结论】研究获得45份云南粳型抗稻瘟病地方稻材料,鉴定获得2份（黑壳谷和光壳花糯）全生育期抗叶瘟和穗颈瘟材料,这2份抗性材料均携带Pi35-Pi36-PikmPi37-Pi33基因组合,可作为抗稻瘟病分子育种的优异抗源材料。     

6个稻瘟病抗性基因在浙江省主栽水稻品种中的分布和抗性评价

【目的】检测浙江省40份水稻栽培品种和6份稻瘟病菌生理小种鉴别品种中6个抗性基因分布情况,同时鉴定品种苗瘟抗性水平,探讨携带抗性基因和抗性水平相关性。【方法】利用功能性分子标记检测品种中Pi1、Pi9/Piz、Pi2/Pizt、Pikh、Pikm、Pita,6个稻瘟病抗性基因的分布情况。用2015-2017年田间采集到的141个稻瘟菌菌株鉴定46个水稻品种苗瘟抗性水平。【结果】6个抗性基因在浙江省栽培品种中分布频率不同,其中Pita基因分布最广,占47.83%;其次是Pikh,占41.30%;抗性基因Pi2/Pizt和Pikm在栽培品种中分布频率相等,均为34.78%;抗性基因Pi9/Piz在栽培品种中分布较少,仅有21.74%;抗性基因Pi1仅在稻瘟病菌生理小种鉴别品种TTP中检测到。抗性水平鉴定结果显示22个品种的抗性频率在60%以上,两个品种的抗性频率达到80%以上。【结论】浙江40份水稻栽培品种和6份稻瘟病菌生理小种鉴别品种携带抗性基因和其抗性水平部分相关。     

稻瘟病抗性基因Pi-km的分子标记的选择

【目的】比较稻瘟病抗性基因Pi-km的不同分子标记,筛选能真实反映其表型的分子标记用于辅助育种选择。【方法】本研究利用与稻瘟病抗性基因Pi-km紧密连锁的1个SNP标记及Pi-km基因内部的2个Indel标记,对62份2012年长江上游国家水稻区域试验材料和97份陕西省水稻区试材料进行了基因型分析,并结合这些材料的稻瘟病抗性的田间鉴定结果,分析了基因型与抗病性之间的关系,对不同的分子标记辅助育种选择进行了评价。【结果】2类标记检测的基因型不完全一致,基于Pi-km基因序列设计的标记比与其连锁的标记作为辅助育种选择更准确。【结论】Pi-km基因的稻瘟病抗性与基因型有关,基因型为M1-M2-的材料比其他基因型材料抗病性趋势更强。     

利用Pi9基因序列标记辅助选择改良籼稻稻瘟病抗性

利用广谱抗稻瘟病基因Pi9基因序列设计的特异分子标记Pi9–a,通过回交育种和分子标记辅助选择技术,改良8份受体水稻材料(丰源B、Ⅱ32B、天龙香103、香丰187、明恢63、轮回422、R747、25H003)的稻瘟病抗性。结果表明:分子标记Pi9–a对8份受体亲本与Pi9供体亲本75–1–127间进行的多态性检测中,除香丰187外,其余7个组合间均存在稳定明显的多态;对4个BC1F1群体进行随机取样的基因型和表型鉴定中,Pi9–a对抗稻瘟病表型选择的效率均为100%。