基于MALDI-TOF-MS质谱技术对蜂蜜中芽孢杆菌的鉴定与分型

[目的]对分离自不同产地和品种的蜂蜜中的芽孢杆菌属进行鉴定分型,探索利用蜂蜜中芽孢杆菌特征指纹图谱对蜂蜜产地和品种进行溯源的可行性。[方法]从44种不同产地和品种蜂蜜中分离出44株芽孢杆菌,3株铜绿假单胞菌。采用基质辅助激光解析-电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)条件对分离的芽孢杆菌进行鉴定分型和聚类分析。[结果]44株芽孢杆菌中鉴定出蜡样芽孢杆菌(B.cereus)31株,短小芽孢杆菌(B.pumilus)5株,枯草芽孢杆菌(B.subtilis)3株,地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)2株,炭疽芽孢杆菌(B.anthracis)1株,土壤短芽孢杆菌(Brevibacillus agri.)2株。通过多次重复试验,表明从同一份样品或同一品牌蜂蜜样品中能稳定分离到芽孢杆菌,获得的蛋白指纹图谱具有极好的稳定性。[结论]MALDI-TOF-MS可根据获得的芽孢杆菌蛋白指纹图谱将芽孢杆菌划分为不同类型,可作为一种新的根据蜂蜜中芽孢杆菌的特征指纹图谱进行溯源的方法。     

多功能芽孢杆菌的分离、筛选及活性测定

从小麦、禾本科杂草根际取样,分离固氮芽孢杆菌,并测定各菌株的抑菌活性及降解有机磷农药的能力,筛选多功能芽孢杆菌菌株.结果表明,分离筛选的11株固氮芽孢杆菌主要包括胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、蜡状芽孢杆菌(B.cereus)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)和短小芽孢杆菌(B.pumilus);其中7株菌株对立枯丝核菌和禾谷丝核菌两种病原菌具有明显的抑菌活性;5株菌株能有效降解甲胺磷和甲基对硫磷两种有机磷农药.巨大芽孢杆菌BM3和地衣芽孢杆菌BL6具有明显的固氮、抑菌和降解有机磷农药等多种功能活性.     

土壤微生物菌肥在盐碱地造林中的作用

从我国内蒙古磴口地区的甘草、紫花苜蓿、樟子松、苦豆、刺槐、紫穗槐、沙棘等盐碱地植物根际土壤中分离出固氮微生物10株,从中筛选出3株固氮芽孢杆菌.经鉴定,1株(96-10)为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium),2株(96-02;96-05)为蜂房芽孢杆菌(Baeillus alve).以草炭为载体制备成微生物菌剂,分别在内蒙古磴口地区和陕西榆林试验区,对10种树种进行了田间施肥试验,获得一定的效果.     

土壤中磷细菌的筛选和鉴定

用卵黄平板 (有机磷 )和磷灰石平板 (无机磷 )从土壤中筛选出具有解磷能力的菌株 ,根据其解磷圈大小判断其解磷能力。结果获得 8株具有较强解磷能力的芽孢杆菌 ,它们分别属于蜡质芽孢杆菌 (Bacilluscereus)、栗褐芽孢杆菌 (Bacillusbadius)和巨大芽孢杆菌 (Bacillusmegaterium)。     

纳豆芽孢杆菌的分离鉴定及纳豆激酶高产菌株的筛选

分别从北京、大连和日本三个产地的纳豆食品中分离纯化得到了9个具有纳豆芽孢杆菌典型菌落特征的芽孢杆菌单菌落,与模式菌株纳豆芽孢杆菌N1株分别从菌落形态、个体形态和生理生化试验三方面进行对比鉴定,结果表明,其中5株芽孢杆菌为纳豆芽孢杆菌。将这5株纳豆芽孢杆菌分别在酪素平板上划线初选,得到了298株具有蛋白酶活力的菌株,从中筛选出活性最高的5株命名为:NB、NC、ND、NE和NF,测定各株发酵液的纳豆激酶酶活力,结果表明NB、NC和ND3株具有较高纳豆激酶活性,酶活力分别达到了1041.37、1125.13和1804.64IU·mL-1。     

大曲中细菌和酵母菌的分离及其Biolog微生物系统分析鉴定

[目的]初步探讨Biolog微生物自动分析系统在大曲细菌、酵母菌鉴定中的应用。[方法]利用稀释平板法,采用营养琼脂培养基和麦芽汁培养基,分别对单粮型大曲样品中的细菌和酵母菌进行分离培养。对分离纯化的细菌和酵母菌,经菌落观察和镜检后,利用Biolog微生物自动分析系统对其进行鉴定。[结果]从大曲单个菌落样品中分别分离出7株纯化的细菌菌株和4株纯化的酵母菌株,经Biolog微生物自动分析系统,确定其中5株细菌分别为:M1为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、M2为青岛芽孢杆菌(Bacillus qingdaonen-sis)、M3为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、M4为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、M5为巨大芽孢杆菌(Bacillus megateri-um);确定其中2株酵母菌分别为:N1为产香酵母(Zygosaccharomyces cidri);N2为布拉酵母菌(Saccharomyces boulardii)。[结论]该研究为大曲中的微生物分析奠定了基础。     

动物微生态制剂猪肠源芽孢杆菌的分离与鉴定

本次试验的菌种是从宁夏平罗县边远农村基本自然生长的健康肉猪的小肠、大肠和盲肠中分离获得的,共分离出28株菌株.通过对这28株菌株的菌落形态观察、革兰氏染色和芽孢染色镜检,筛选出12株芽孢杆菌(Bacillus)菌株进行了生理化学鉴定,其中有11株分属于芽孢杆菌的3个种.确定8株为蜡状芽孢杆菌(B.cereus),1株为枯草芽孢杆菌(B.subtilis),2株为短芽孢杆菌(B.brevis).这11株菌株的各项鉴定结果均符合芽孢杆菌属和相应种的菌落形态、革兰氏染色和芽孢染色特征以及生理生化鉴定标准.     

Isolation of Bacteria and Yeasts from Daqu Samples and its Identification by Biolog Automatic Analyzer for Microbes

[目的]初步探讨Biolog微生物自动分析系统在大曲细菌、酵母菌鉴定中的应用.[方法]利用稀释平板法,采用营养琼脂培养基和麦芽汁培养基,分别对单粮型大曲样品中的细菌和酵母菌进行分离培养.对分离纯化的细菌和酵母菌,经菌落观察和镜检后,利用Biolog微生物自动分析系统对其进行鉴定.[结果]从大曲单个菌落样品中分别分离出7株纯化的细菌菌株和4株纯化的酵母菌株,经Biolog微生物自动分析系统,确定其中5株细菌分别为:M1为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、M2为青岛芽孢杆菌(Bacillus qingdaonensis)、M3为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、M4为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、M5为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium);确定其中2株酵母菌分别为:N1为产香酵母(Zygosaccharomyces cidri);N2为布拉酵母菌(Saccharomyces boulardii).[结论]该研究为大曲中的微生物分析奠定了基础.     

腐乳中产生物胺菌株的筛选鉴定及产生物胺能力评价

为筛选腐乳样品中产生物胺的菌株,以24种市售腐乳样品为研究对象,通过生物胺初筛培养基显色反应进行初筛,再采用高效液相色谱(HPLC)定量分析其产胺能力,获得61株具有氨基酸脱羧酶活性的菌株。选取产生物胺总量较高的20株菌,经16S rDNA分析,这20株菌均为芽孢杆菌属,其中包括6株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、5株巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、3株长形赖氨酸芽胞杆菌(Lysinibacillus macrolides)、2株蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)和4株热带芽孢杆菌(Bacillus tropicus)。还分析了温度、氨基酸浓度、NaCl浓度、乙醇浓度、pH值对产胺量较高的枯草芽孢杆菌和热带芽孢杆菌产胺能力的影响。结果表明:NaCl浓度8%和乙醇浓度10%对生物胺的合成有显著的抑制作用,可应用于腐乳生产中,能有效控制腐乳中生物胺的含量。     

辣椒枯萎病主要致病菌的分离鉴定及农用拮抗菌筛选

[目的]分离鉴定辣椒枯萎病主要致病菌,探寻能够有效抑制该致病菌的生防菌株.[方法]采用植物病害组织致病菌划线分离方法分离致病菌,经形态学以及ITS区域PCR检测,确定菌株属性,通过平板拮抗筛选,确定对该致病菌具有拮抗作用的农用生防菌株.[结果]初步鉴定该致病菌为尖孢镰刀(Fusarium oxysporum),将该致病菌与11株农用微生物芽孢杆菌和3株农用微生物木霉菌进行拮抗试验,发现枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、海洋芽孢杆菌(Bacillus marinus)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)6株芽孢杆菌对该致病菌拮抗效果明显,长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)与哈茨木霉(Trichoderma harzianum)2株木霉菌对该致病菌具有明显的拮抗效果.[结论]筛选到了8株能够有效抑制该病原菌的生防菌株,为以后研究生防肥料奠定了基础.     

磷钾生物菌肥的菌种筛选及应用研究

从保存的47株菌中,根据解磷和解钾能力强、菌株间无拮抗性的原则,确定了3株菌作为菌肥生产菌,分别为巨大芽孢杆菌(Bacillus megatherium)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)。以3株菌作为生物菌肥生产菌株,对其进行发酵培养,将发酵液施于吊兰土壤进行植株种植试验,结果表明施肥的植株在根长、株高、叶长、鲜重等明显优于空白对照组。     

外源微生物强化蓖麻对铅的吸收与积累研究

采用温室盆栽(土壤Pb浓度为300 mg·kg-1)试验,将3株Pb抗性菌株——蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)分别接种于蓖麻根际,研究铅抗性菌株对蓖麻吸收积累铅的影响.结果表明,蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和铜绿假单胞菌处理的植物地上部Pb吸收量分别比对照增加40%、18%和19%(P＜0.05).这说明上述细菌对蓖麻积累Pb均有促进作用,外源微生物对强化蓖麻修复铅污染土壤具有一定的潜力.     

小麦全蚀病拮抗微生物的分离及其拮抗性能研究

从开封北郊的麦田土壤中分离筛选出11株对小麦全蚀病菌(Gaeumannomyces graminis var.tritici)有拮抗作用的细菌,通过对它们进行生理生化检验,确定为4个种,即:巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringien-sis)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)。分别利用平板拮抗和小麦活体拮抗对分离到的11株拮抗菌株的拮抗能力进行检测。结果表明,菌株的平板拮抗能力较强,在活体试验中,可以降低病害的发病强度。     

白掌根腐病生防菌的筛选与鉴定

采用对峙培养法,从土壤中筛选出对白掌根腐病菌有拮抗作用的2株细菌菌株C3和S1;通过盆栽防治试验,结果显示2株拮抗细菌C3和S1对白掌根腐病的防效分别为55%和50%;通过16Sr DNA序列分析,拮抗细菌菌株C3和S1与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的序列相似性达99%;通过构建系统发育树,菌株C3与枯草芽孢杆菌在同一分支上,而菌株S1不在同一分支上。因此,初步将拮抗细菌菌株C3和S1分别鉴定为枯草芽孢杆菌和芽孢杆菌(Bacillus sp.)。     

黑胫病烟株真菌分离鉴定与芽孢杆菌拮抗比较

针对连作烟田土传病害发病率高,尤其是黑胫病烟株残体遗留大田,致次年病害发生的情况,为了探明烟株残体所含真菌,以及在生物防治背景下生防芽孢杆菌对真菌的拮抗效果,对黑胫病烟株茎秆样本进行了髓部残片真菌分离培养,从形态学和系统学对真菌进行了鉴定,并使用4株生防芽孢杆菌与真菌进行了拮抗比较。真菌菌丝体无色透明,可见厚垣孢子,18S rDNA序列与Mariannaea punicea CBS 239.56同源,鉴定为马利亚霉属紫窝尺蛾菌。贝莱斯芽孢杆菌RJW-5-5、枯草芽孢杆菌1号、解淀粉芽孢杆菌YF-6和甲基营养型芽孢杆菌LW-6这4株生防芽孢杆菌对Mariannaea punicea的拮抗抑制率分别为24.12%、21.51%、17.99%和16.81%;拮抗占位空间具体表现为贝莱斯芽孢杆菌RJW-5-5(56.58 mm)>甲基营养型芽孢杆菌LW-6(56.08 mm)>枯草芽孢杆菌1号(53.50 mm)>解淀粉芽孢杆菌YF-6 (52.45 mm)。4株生防芽孢杆菌对马利亚霉属紫窝尺蛾菌(Mariannaea punicea)均有较好的拮抗效果,综合评价贝莱斯芽孢杆...     

重金属胁迫下2株芽孢杆菌芽孢的形成及生物学特征

为探明芽孢杆菌芽孢形成过程中重金属离子胁迫的生物学特征,选择枯草芽孢杆菌和简单芽孢杆菌各1株,通过芽孢染色法判断2株芽孢杆菌芽孢形成时间,同时选择4种重金属离子(Pb~(2+)、Cd~(2+)、Cr~(6+)、Hg~(2+))对2株芽孢杆菌在芽孢形成过程中进行胁迫培养,测定芽孢形成过程中的生长曲线、DNA、RNA、可溶性糖、蛋白质、多酚氧化酶(PPO)和过氧化氢酶(CAT)含量。结果表明:2株芽孢杆菌芽孢形成时间有很大差异,枯草芽孢杆菌芽孢形成的初始时间为43h,简单芽孢杆菌为16h。2株芽孢杆菌在芽孢形成过程中对4种重金属离子的耐受能力有一定差异,枯草芽孢杆菌对重金属的敏感性为Cr~(6+)Cd~(2+)Hg~(2+)≈Pb~(2+),简单芽孢杆菌为Hg~(2+)≈Cd~(2+)Cr~(6+)Pb~(2+);简单芽孢杆菌芽孢形成前期DNA、RNA含量较高,后期呈逐渐下降趋势,枯草芽孢杆菌一直呈下降趋势;可溶性糖含量逐渐增加,后期上升速率大于前期;蛋白质含量呈先下降后上升再下降趋势,PPO含量呈上升趋势,CAT含量呈先上升后下降趋势。     

施用侧孢短芽孢杆菌对烤后烟叶钾含量及烟株生理特征的影响

为探究施用侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)对烤后烟叶钾含量及烟株生理特征的影响,在烟苗移栽期设置不施用侧孢短芽孢杆菌(T1)、侧孢短芽孢杆菌浸根(T2)、侧孢短芽孢杆菌灌根(T3)及侧孢短芽孢杆菌浸根+灌根(T4)4个处理,测定烤后烟叶钾含量、叶片光合色素含量、抗氧化酶活性及抗病性等指标的变化。结果表明：侧孢短芽孢杆菌的最佳施用方式为浸根+灌根,该处理烤后上部及中部叶的钾含量较T1处理分别显著(P<0.05)提高29.86%、67.36%,根系钾含量显著提高16.58%～28.85%,烟株气候斑病、炭疽病、赤星率、叶斑病的发病率和病情指数显著降低,烟叶的叶绿素、类胡萝卜素含量,及超氧化物歧化酶、过氧化物酶活性分别显著提高13.21%～18.81%、21.01%～35.41%、9.63%～18.31%、11.62%～13.81%,叶片丙二醛含量显著降低20.76%～30.99%。综上,在烟苗移栽期以浸根+灌根方式施用侧孢短芽孢杆菌可增强烟株的抗性,提高烤后烟叶的钾含量。     

烟草黑胫病拮抗芽孢杆菌的筛选及生防效果评价

为了防治烟草疫霉对烟草引起的病害,从不同烟田健康烟株根际土壤中筛选分离42株根际细菌,经平板对峙初筛、细菌发酵液115℃处理后复筛得到10株对烟草黑胫病病原菌(Phytophthora parasitica)具有较好抑制效果的芽孢杆菌。经分子生物学鉴定可将其分为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、枯草芽孢杆菌(B. subtilis)和贝莱斯芽孢杆菌(B. velezensis)3类。选取枯草芽孢杆菌GJ1、解淀粉芽孢杆菌GJ7和贝莱斯芽孢杆菌GJ11对各类芽孢杆菌进行纤维素酶和蛋白酶分泌特性检测、烟草根际土壤、根和茎定殖能力检测以及田间试验,得出这3种芽孢杆菌均可分泌纤维素酶和蛋白酶,均能在烟草根际土壤、根和茎中定殖,在根际土壤中定殖能力为GJ1GJ7GJ11,在根和茎中定殖能力均为GJ7GJ1GJ11。GJ1、GJ7、GJ11对烟草黑胫病田间相对防治效果分别为33.33%、80.00%、28.60%,初步确定拮抗芽孢杆菌田间防治效果取决于其在烟草内定殖能力。     

烟草青枯菌拮抗放线菌和细菌的田间试验

从健康烟草根围土壤中分离、筛选得到对烟草青枯病菌拮抗效果较好的放线菌和细菌。经鉴定两株拮抗放线菌均属链霉菌属(Streptomyces),分别是绿色类群橄榄绿链霉菌(S.olivaceoviridis)、粉红孢类群玫瑰暗黄链霉菌(S.roseofulvus);拮抗细菌分别为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、球形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sphaericu)。在贵州省麻江县烟田进行田间试验,3次平均相对防效从大到小依次为粉红孢类群玫瑰暗黄链霉菌(63.65%)、球形赖氨酸芽孢杆菌(60.03%)、蜡样芽孢杆菌(43.85%)、绿色类群橄榄绿链霉菌(41.76%)、40%硫酸链霉素(17.11%)。     

厨余垃圾堆肥腐熟降解菌株的筛选与鉴定

本研究旨在筛选厨余垃圾高效腐熟降解菌.采用秸秆平板培养基、刚果红培养基进行菌株的初筛,利用秸秆降解试验、滤纸崩解试验以及酶活性的指标进行复筛.结果表明,通过初筛获得了5株降解菌,其中菌株Y 1、Y3的水解圈直径(H)与菌落直径(D)的比值(H/D)较大,分别为4.4、3.8,秸秆降解率分别达到42.50％、40.94％,而且2株菌株纤维素酶活性协同性较高.通过形态学和16S rDNA序列分析进行菌株种属的鉴定,菌株Y1、Y3均属于芽孢杆菌菌属(Bacillus),其中菌株Y1为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),菌株Y3为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis).