接头分子在TLRs信号传导中的作用研究进展

接头分子在Toll样受体(Toll like receptors,TLRs)识别病原相关分子模式或损伤相关分子模式、发动和调节先天与后天免疫反应的信号传导网络中发挥着重要的生物学作用,与Toll样受体相结合后,其下游激酶和转录因子传导信号,激活细胞内核转录因子调控作用元件。TLRs接头分子的共同特征是含有TIR结构域,不同TLRs家族成员可依赖于一个或多个接头分子传导信号。对目前已确认的MyD88、MAL/TIRAP、TRIF、TRAM和SARM 5种接头分子在TLRs信号传导途径中的调控作用进行综述,以期为研究接头分子在TLRs信号传导中的作用机制提供参考。     

鼠伤寒沙门氏菌感染诱导鸡盲肠及脾脏TLR基因差异表达

为研究鼠伤寒沙门氏菌感染后不同时间鸡盲肠和脾脏组织TLR4、TLR5、TLR15和TLR21 mRNA的表达规律,选用沙门氏菌阴性济宁百日鸡36只,随机分为2组,饲喂于隔离器中,2日龄分别接种1.23×108cfu鼠伤寒沙门氏菌和PBS溶液,接种后第1、3和7天采集盲肠和脾脏组织样品,应用荧光定量PCR检测感染后各时间、各组织中TLR4、TLR5、TLR15和TLR21的表达量。结果显示,1)济宁百日鸡感染鼠伤寒沙门氏菌后盲肠中TLR4、TLR5、TLR15和TLR21表达量均发生显著变化(P0.05);2)脾脏中TLR21和TLR4的表达量分别在接种后第1天和第3天显著上调(P0.05),而TLR5和TLR15的表达量差异不显著;3)感染后各时间点脾脏中TLR5的表达量显著低于盲肠(P0.01),而TLR4、TLR15和TLR21表达量均显著高于盲肠(P0.05)。鼠伤寒沙门氏菌感染后,鸡TLRs在盲肠和脾脏中发挥着不同的调控作用,而且这种表达调控表现出一定的时序性。     

柔嫩艾美耳球虫杨陵株3-1E基因的克隆与序列分析

根据GenBank发表的鸡柔嫩艾美耳球虫(Ei meriatenella)3-1E基因的ORF设计一对引物,用RT-PCR方法从E.tenella杨陵(YL)株总RNA中扩增3-1E基因,并将扩增产物与pMD18-T easy载体进行连接并测序,用DNAstar 5.0软件对测序结果进行分析。结果表明,2009年分离的E.tenellaYL株3-1E基因与其他虫株相比,核苷酸有9个位点发生变化,其中7个位点的变化引起了相应氨基酸位点的改变,其他2个位点的变化未引起氨基酸的改变。对2006年和2009年分离的YL株3-1E基因的核苷酸进行了比对,结果发现,有两个核苷酸位点发生了变化。系统发育树分析表明,E.tenellaYL株3-1E基因同种间与E.tenella甘肃株遗传关系最近,同属间与E.acervulina法国株遗传关系最近。     

安徽3株柔嫩艾美耳球虫cox1基因部分序列的比对分析

为研究柔嫩艾美耳球虫不同地理株的线粒体细胞色素c氧化酶第1亚基(cox1)基因与球虫种群之间的遗传关系,以安徽3个地区的3株柔嫩艾美耳球虫为研究对象,通过卵囊的分离与纯化获得纯种虫株,然后应用PCR技术对柔嫩艾美球虫3个地理株的cox1序列进行扩增,并与GenBank上登录的鸡柔嫩艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫、布氏艾美耳球虫和堆形艾美耳球虫虫株的相应序列进行比对分析。结果显示,每个虫株都成功扩增出800 bp左右的cox1部分有效序列(pcox1),与柔嫩艾美耳球虫pcox1序列种内无差异,pcox1相应序列种间的差异程度为9.9%～14.9%。表明柔嫩艾美耳球虫的cox1序列可作为艾美耳球虫种间遗传变异研究的标记,为进一步研究艾美耳球虫的群体遗传学特性和耐药性奠定了基础。     

7种抗球虫药对柔嫩艾美耳球虫荣昌株的疗效试验

旨在探究7种抗球虫药对柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)荣昌株的治疗效果。采用笼饲法,将180只罗曼粉雏公鸡饲喂至13日龄随机分为9个试验组,即沙咪珠利组(EZL)、地克珠利组(DIC)、磺胺氯吡嗪钠组(SUS)、尼卡巴嗪组(NIC)、氯羟吡啶组(CLP)、氨丙啉组(AML)、癸氧喹酯溶液组(DQ)、感染对照组(PC)和空白对照组(NC),每组20只鸡,除NC组外,其余各组鸡在14日龄经口接种5×10⁴个柔嫩艾美耳球虫荣昌株孢子化卵囊,各用药组于接种前一天混饲或饮水给药直至试验结束。试验期间观察各组鸡只的临床表现,通过其增重情况、存活率、病变值、卵囊值等计算药物组的抗球虫指数(ACI)。结果显示,EZL和DQ组鸡几乎未表现出临床症状,且在盲肠病变计分和卵囊产量明显低于其他各试验组,其ACI分别为184.00和189.50;SUS和NIC组鸡相对增重率较高,其抗球虫指数分别为136.00和124.06;DIC、CLP和AML组鸡的各项指标均较差,其ACI分别为123.50、106.50和88.38。EZL和DQ对柔嫩艾美耳球虫荣昌株敏感,DIC、SUS和NIC效果较差,CLP和AML无效。     

鸡SPOP和MyD88基因分子特征及其组织表达特性分析

【目的】掌握SPOP和MyD88基因分子特征及其在鸡不同组织发育过程中的表达特征,为后续研究其调控鸡组织生长发育机理及开展抗病育种提供参考依据。【方法】通过RT-PCR克隆鸡SPOP和MyD88基因编码区（CDS）序列,运用ExPASy、SOPMA、SWISS-MODEL及PSORT II Prediction等在线软件进行生物信息学分析,并以实时荧光定量PCR检测这2个基因在鸡胚14胚龄（E14 d）及出壳后1 d（H1 d）、7 d（H7 d）和14 d（H14 d）各组织中的表达情况。【结果】鸡SPOP、MyD88基因CDS序列长为1125和900 bp,分别编码374和299个氨基酸残基。SPOP蛋白分子式为C₁₈₆₆H₂₉₂₆N₄₉₆O₅₅₉S₂₈,相对分子量为42 kD,理论等电点（pI）为5.58,为相对不稳定蛋白;MyD88蛋白分子式为C₁₅₀₂H₂₃₉₄N₄₁₀O₄₃₈S₁₈,相对分子量为33 kD,pI为5.93,为相对不稳定蛋白。鸡SPOP和MyD88蛋白二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主,主要定位于细胞质（占60.9%）。与人类和哺乳动物相比,鸡SPOP蛋白的3个功能结构域（MATH、BTB-POZ和BACK）较保守,而MyD88蛋白的2个功能结构域（Death和TIR）存在多处氨基酸位点变异。SPOP和MyD88基因在鸡不同发育阶段各组织中均有表达,但以肺脏中的相对表达量最高,且二者间的表达差异极显著（P<0.01,下同）。从E14 d发育至H14 d,SPOP基因在眼球和肺脏中的表达整体上呈上升趋势,且至H14 d时肺脏中的表达趋于稳定,在脑组织、心脏和肌胃中的表达呈先上升后下降的变化趋势,在肝脏中的表达呈先下降后上升再下降的变化趋势;MyD88基因在眼球、肝脏和肺脏中的表达均呈先上升后下降再上升的变化趋势,在肌胃和胸肌中的表达呈下降趋势,至H14 d时降至最低值。【结论】SPOP和MyD88基因在鸡胚不同发育阶段肺脏、眼球和肌胃中的表达相对较高,SPOP基因的表达水平均极显著高于MyD88基因,且二者的相对表达量呈负相关,即SPOP基因负调控MyD88基因的表达。     

Pyogenic bacterial infections in humans with MyD88 deficiency

MyD88 is a key downstream adapter for most Toll-like receptors (TLRs) and interleukin-1 receptors (IL-1Rs). MyD88 deficiency in mice leads to susceptibility to a broad range of pathogens in experimental settings of infection. We describe a distinct situation in a natural setting of human infection. Nine children with autosomal recessive MyD88 deficiency suffered from life-threatening, often recurrent pyogenic bacterial infections, including invasive pneumococcal disease. However, these patients were otherwise healthy, with normal resistance to other microbes. Their clinical status improved with age, but not due to any cellular leakiness in MyD88 deficiency. The MyD88-dependent TLRs and IL-1Rs are therefore essential for protective immunity to a small number of pyogenic bacteria, but redundant for host defense to most natural infections.     

Role of adaptor TRIF in the MyD88-independent toll-like receptor signaling pathway

Stimulation of Toll-like receptors (TLRs) triggers activation of a common MyD88-dependent signaling pathway as well as a MyD88-independent pathway that is unique to TLR3 and TLR4 signaling pathways leading to interferon (IFN)-beta production. Here we disrupted the gene encoding a Toll/IL-1 receptor (TIR) domain-containing adaptor, TRIF. TRIF-deficient mice were defective in both TLR3- and TLR4-mediated expression of IFN-beta and activation of IRF-3. Furthermore, inflammatory cytokine production in response to the TLR4 ligand, but not to other TLR ligands, was severely impaired in TRIF-deficient macrophages. Mice deficient in both MyD88 and TRIF showed complete loss of nuclear factor kappa B activation in response to TLR4 stimulation. These findings demonstrate that TRIF is essential for TLR3- and TLR4-mediated signaling pathways facilitating mammalian antiviral host defense.     

传染性法氏囊病Dot—ELISA双抗体夹心诊断法的建立及应用研究

应用建立的斑点酶联免疫吸附试验（Dot－ELISA）双抗体夹心法检测IBDV抗原,证明该诊断法敏感度高,特异性强而且简便、快速。对52份病鸡各脏器病毒抗原检测表明,以法氏囊、盲肠扁桃体的检出率为最高。对人工感染鸡各脏器病毒抗原的检测结果表明脾脏首先出现病毒抗原。各脏器病毒抗原含量依次为法氏囊＞盲肠扁桃体＞脾脏＞胸腺。     

雏鸡免疫柔嫩艾美耳球虫早熟株和毒株的细胞免疫反应

AA肉鸡雏鸡分别经口免疫柔嫩艾美耳球虫毒株早熟株，用免疫组化ABC法染色检测小肠、盲肠扁桃体、脾脏中CD4^ 、CD8^ T淋巴细胞动态变化；用淋巴细胞转化实验MTT法检测T淋巴细胞活性。结果表明：球虫免疫鸡后，CD4^ T淋巴细胞在一次免疫后迅速增殖，第6天达到第一峰，免疫柔嫩艾美耳球虫毒株的鸡盲肠与脾脏中CD4^ T淋巴细胞占所有淋巴细胞百分率分别达到38％和44％，免疫早熟株的鸡盲肠与脾脏中CD4^ T淋巴细胞占所有淋巴细胞百分率分别达到36％和43％，而二次免疫后和对照相比很少有显著差异。CD8^ T淋巴细胞在一次免疫后比CD4^ T增殖速度慢，第9天达到第一峰。免疫柔嫩艾美耳球虫毒株的鸡在此日盲肠与脾脏中CD8^ T淋巴细胞占所有淋巴细胞百分率分别达到37％和47％，免疫早熟株的鸡在此日盲肠与脾脏中CD8^ T淋巴细胞占所有淋巴细胞百分率分别达到36％和48％，二次免疫后迅速大量增殖，免疫柔嫩艾美耳球虫毒株的鸡在二免后第2天盲肠与脾脏中CD8^ T淋巴细胞占所有淋巴细胞百分率分别达到39％和50％．免疫柔嫩艾美耳球虫早熟株的鸡在二免后第2天盲肠与脾脏中CD8^ T淋巴细胞占所有淋巴细胞百分率分别达到37％和50％。且CD8^ T淋巴细胞总体水平比CD4^ T淋巴细胞多。盲肠扁桃体中T细胞的增殖速度比其他组织更快。免疫早熟株的鸡与免疫毒株的鸡肠道黏膜中的CD4^ 、CD8^ T淋巴细胞变化基本一致。一次免疫鸡比未免疫对照T淋巴细胞活性显著升高；进行二免的鸡免疫后第一、二、三周T淋巴细胞活性均比未进行二免的鸡显著升高；毒株免疫鸡T淋巴细胞活性大多与早熟株免疫鸡无8显著差异。     

Two new IncRNAs regulate the key immune factor NOD1 and TRAF5 in chicken lymphocyte

Reticuloendotheliosis virus (REV) causes the atrophy of immune organs and immuno-suppression in chickens, but the underlying molecular mechanism of the immune response after infection by REV is not well understood. Presently, the RNA-seq was used to analyze the regulation of immune response to REV in chicken lymphocytes from peripheral blood. Overall, 134 differentially expressed long non-coding RNAs (lncRNAs) between cells with REV infection or without in vitro were screened. Based on the differentially expressed protein-coding genes, the nucleotide-binding oligomerization domain (NOD)-like receptor pathway related to immune regulation was enriched. Two lncRNAs (L11530 and L09863) were predicted to target the NOD1 and tumor necrosis factor receptor-associated factor 5 (TRAF5) gene, respectively, which are involved in the NOD-like receptor pathway with cis-regulation way. The in vitro results revealed the significantly up-regulated (P<0.01) levels of lncRNA-L11530 and its target gene, NOD1, and the significantly down-regulated (P<0.05) levels of lncRNA-L09863 and its target gene, TRAF5, in lymphocytes after REV infection. These changes also occurred in vivo in blood lymphocytes of chickens infected with REV. Further, L09863 and L11530 were respectively interfered, the expression levels of their target genes NOD1 or TRAF5 were significantly down-regulated, accompanied by the change of IL-8 and IL-18 secretions in lymphocytes. The NOD-like receptor pathway appears to be important in the immune response to REV, LncRNA-11530 and IncRNA-09863 might involve in the immune regulation on REV infection by targeting NOD1 or TRAF5 in blood lymphocytes of chickens. Our findings reveal a new regulation of lncRNAs (L11530 and L09863) on immunity in chicken peripheral blood lymphocytes for REV infection by changing the expression of the target genes via the NOD-like receptor pathway.     

雏鸡感染法氏囊病毒后免疫器官中浆细胞的变化

本项研究对人工感染传染性法氏囊病毒(IBDV)的1日龄雏鸡和未感染 IBDV的相应对照雏鸡的免疫器官组织——法氏囊、胸腺、脾脏、盲肠扁桃体和哈德尔腺中的浆细胞总数、成熟浆细胞和前浆细胞数量及其分布的动态变化进行了检测。结果表明,1日龄雏鸡感染 IBDV 后,免疫器官组织中浆细胞总数和成熟浆细胞数明显低于对照雏鸡;前浆细胞数在感染初期也呈现一定的减少。浆细胞的上述变化在法氏囊的淋巴小结皮质、脾脏的红髓和鞘动脉外周、盲肠扁桃体的弥散区、哈德尔腺的集合小管和排泄管周围、胸腺的髓质等区域最明显。表明1日龄雏鸡感染IBDV 后,免疫器官的体液免疫反应呈现明显抑制。     

安徽部分地区鸡球虫种类及感染情况调查

为了解安徽省部分地区鸡球虫种类及感染情况,采用群体采样法分别从肥西县、长丰县和凤台县采集鸡新鲜粪样,用饱和盐水漂浮法检查。阳性粪样采用饱和盐水漂浮和离心沉淀法进行卵囊分离。显微镜下观察卵囊进行虫种鉴定,并统计各调查点的鸡球虫感染率和感染强度等。结果表明,鸡球虫感染率为93.3%(84/90);共检获7种球虫,即:柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)、巨型艾美耳球虫(E.maxima)、堆型艾美耳球虫(E.acervulina)、毒害艾美耳球虫(E.necatrix)、布氏艾美耳球虫(E.brunetti)、和缓艾美耳球虫(E.mitis)、早熟艾美耳球虫(E.prae-cox)。     

The Effects of Exogenous Nitric Oxide on Eimeria tenella Oocysts

The effects of exogenous NO on Eimeria tenella oocysts were studied. The E. tenella oocystsfreshly isolated from feces of experimental chickens infected with E. tenella and sporulated E. tenella oocystswere treated in vitro by the well-known NO-donors, SNP, SPER/NO and GSNO. The results showed thatamong the 3 NO donors, only GSNO had significant effects on the percentage of sporulated oocysts, the inhibi-ting rate of purified oocysts was from 93 to 97%, and reached 100% on the oocysts in the feces of chickenswith E. tenella infection. GSNO also significantly decreased the virulence of E. tenella oocysts, and the oo-cysts treated by 2 -8 mmol L-1 GSNO almost lost their pathogenicity to chickens.     

REV与ALV-J共感染对肉鸡T淋巴细胞免疫功能与组织病理学的影响

 【目的】研究致瘤性病毒REV、ALV-J单一感染和共感染肉鸡后血液和脾T淋巴细胞的免疫功能与脾组织病理学的变化。【方法】用一定剂量的REV和ALV-J单一感染及共感染1日龄肉鸡,取感染后不同日龄鸡的血液和脾组织,无菌分离淋巴细胞,用3H-TdR掺入法和MTT法分别检测T淋巴细胞增殖活性和细胞毒T淋巴细胞(CTL)的杀伤活性,并对脾脏进行组织切片、H.E染色检测组织病理学变化,通过免疫荧光抗体结合试验(immunofluorescence assay,IFA)分析组织病毒感染量变化。【结果】感染REV和ALV-J的肉鸡血液和脾T淋巴细胞的增值活性和CTL杀伤活性在整个感染监测期出现降低,单一感染比,共感染两种病毒的肉鸡在某些阶段出现T淋巴细胞免疫功能抑制加重;检测感染后17 d和37 d的脾脏组织病理学变化表明感染病毒的脾脏组织出现间质稀疏,淋巴细胞数量减少,生发层被破坏或减少,17 d较37 d出现病理变化更为明显;同时采用荧光标记的单克隆抗体进行IFA检测发现脾内淋巴细胞含有大量病毒粒子,在共感染两种病毒的肉鸡脾细胞内均检测出两种病毒,且含有病毒数量明显多于单一感染一种病毒的肉鸡。【结论】REV和ALV-J共感染后肉鸡T淋巴细胞功能抑制更为严重,这可能与两种病毒在肉鸡体内数量积聚增加、互为促进有重要关系;同时这两种病毒感染后造成T免疫细胞增殖活性和对肿瘤细胞的杀伤活性降低,可能是病毒持续感染、增殖及组织病变、产生肿瘤细胞的前提,本研究为家禽临床生产中防治REV和ALV-J感染提供免疫学基础。     

中草药抗球散超微粉对柔嫩艾美耳球虫感染鸡免疫机能的影响

为探讨中草药抗球散超微粉防治鸡柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)的作用机制,将150只20日龄供试鸡随机均分为Ⅰ组(感染给中草药组)、Ⅱ组(感染不给药组)和Ⅲ组(不感染不给药组)。Ⅰ组、Ⅱ组人工感染柔嫩艾美耳球虫,Ⅰ组于感染前1 d在饲料中添加1%的中草药抗球散超微粉,分别测定供试鸡血清免疫球蛋白IgG、IgM、IgA含量和外周血T淋巴细胞百分率,试验结束时测定脾脏和法氏囊指数。结果显示:与Ⅱ组相比,Ⅰ组的IgG、IgM、IgA抗体水平整体上呈上升趋势,IgG抗体水平于感染后13、17、21 d分别显著提高10.06%、14.78%、10.63%,IgM抗体水平于感染后13 d显著提高18.18%,IgA抗体水平于感染后17 d显著提高17.95%;Ⅰ组的外周血T淋巴细胞百分率于感染后14、21 d分别显著提高7.20、6.20个百分点;试验结束时,Ⅰ组的脾脏指数和法氏囊指数分别极显著提高46.72%和43.82%。以上结果表明,中草药抗球散超微粉能够促进柔嫩艾美耳球虫感染鸡免疫器官发育、增强机体免疫功能。     

E.necatrix二次感染雏鸡消化道局部体液Igs含量变化

采用间接酶联免疫吸附试验法检测了毒害艾美耳球虫(Eimeria necatrix)二次感染雏鸡肠液和胆汁IgA、IgM、IgG含量变化。结果表明,在E.necatrix二次大剂量攻击性感染雏鸡后的初期,三种免疫球蛋白含量呈现一过性下降,随即回升,14d较对照和初次感染雏鸡明显增加,表明球虫初次感染所激发的高水平体液免疫对其二次感染有良好的免疫保护作用。     

柔嫩艾美尔球虫的分离及病理学观察

采用单卵囊感染技术,从鸡球虫混合种中分离出1株柔嫩艾美尔球虫(E im eria tenella)。并对该株柔嫩艾美尔球虫的病理学做了进一步研究。利用柔嫩艾美尔球虫的寄生部位、肉眼病变、临床症状等生物学特性进行鉴定,并做回归动物实验,用此球虫卵囊100,000个感染雏鸡。取8天后明显病理变化的盲肠组织,采用石蜡切片技术,进行病理学观察。结果表明,在盲肠肠绒毛上皮、肠腺及肌层都有虫体寄生,并且有明显的出血病变。