Inhibitory Effects of S-Nitroso-Glutathione on Sporulation Process of Eimeria tenella Oocysts

To study the inhibiting effects of S-Nitroso-Glutathione (GSNO) on sporulation process of Eimeria tenella (E. tenella) oocysts by detecting the sporulation rate, GSNO as nitric oxide donor was used to treatE. tenella oocysts sporulated for different times; Several kinds of antioxidants and oxidants were used to investigate the inhibitory effects of GSNO on sporogony process of E. tenellaoocysts. The results showed that GSNO still inhibited the oocysts sporulated 10 h, but had few inhibiting effect on the oocysts sporulated for 14 h; the antioxidants, such as Vitamin C (VC), mannitol and sodium salicylate, could not eliminate the inhibitory effects of GSNO on oocysts; neither did the ferrous sulfate (FeSO4) nor Dithiothreitol (DTT). However, the oxidants, potassium dichromate (K2Cr2O7) and potassium permanganate (KMnO4) could obviously repress the effects of GSNO on oocysts. At present, the inhibitory mechanism of GSNO on unsporulated oocysts was still unclear.     

柔嫩艾美耳球虫子孢子抗原的制备

[目的]为进一步研究柔嫩艾美耳球虫（E.tenella）的单克隆抗体奠定基础。[方法]给肉鸡雏接种E．tenella纯种孢子化卵囊：第5～10天收集鸡的粪便并标记、粗提，经卵囊孢子化、纯化孢予化的卵囊、计数卵囊后，最终制备出子孢子抗原。[结果]该方法制备E．tenella子孢子抗原较其他方法简单易行，不需太多专门仪器和培养液，一般实验室均可进行，效果良好。但所用时间较长。[结论]该试验成功分离提纯出了鸡的E．tenella卵囊，并获得了蛋白浓度较高的抗原，为单克隆抗体的制备提供了有力保障。     

E.tenella吉林株单卵囊的分离及PCR鉴定(英文)

[Objective] In order to get a purified strain to carry out the relative molecular biology research about E.tenella. [Method] The single-oocyst isolation method was improved and the isolated single-oocyst which was put into capsule was fed to chickens. At the same time, the collected oocysts were identified by PCR method. [Result] The oocysts were isolated from feces of 15 chickens among that of 20 chickens and the infection rate was 75%. The PCR results demonstrated that the single-oocyst strain was E.tenella. [Conclusion] The inoculation of single oocyst capsule was simple, besides, this method did not only save time but also declined inoculation difficulty, increased infection rate and provided good materials for biological research of coccidian.     

转基因柔嫩艾美耳球虫对生态环境的影响

【目的】从表达M2e-EYFP融合蛋白转基因柔嫩艾美耳球虫的稳定性,及其在环境中的传播能力、竞争能力和存活能力方面,分析转基因球虫对生态环境的潜在风险。【方法】稳定性试验包括:转基因球虫感染非靶动物,观察临床症状和卵囊产出情况;转基因球虫继代繁殖,检测荧光率;转基因球虫与毒害艾美耳球虫混合感染,PCR检测卵囊中的外源基因。传播能力试验主要是分析感染鸡和不感染同居鸡的卵囊产量和荧光率。竞争性试验则是用不同混合比例的2种球虫感染鸡,检测卵囊产量和荧光率;存活能力试验是用不同处理方式的卵囊感染鸡,检测卵囊是否产出以分析卵囊存活能力。【结果】转基因球虫不感染小鼠和家鸽,与野生型柔嫩艾美耳球虫宿主特异性相同;连续繁殖传17代后外源基因稳定表达。与毒害艾美耳球虫混合寄生时在异种球虫体内未检测出外源基因。传播能力试验中,46d攻毒时转基因球虫感染与不感染同居组的卵囊产量差异不显著,但与不感染对照组相比均显著减少,且1∶1感染和不感染同居组卵囊荧光率检测结果维持在51.6%67.9%。竟争性试验中,攻毒时各比例感染组卵囊产量均极显著少于不感染攻毒对照组,荧光率检测结果各比例组变化幅动不大,且1∶1组哨兵鸡卵囊荧光率检测结果为41.2%61%。存活能力试验,转基因球虫与野生型球虫在夏季室温条件下均不能存活90d,且与其他不同方式处理的卵囊外界存活时间接近。【结论】说明转基因球虫具有良好的稳定性,在环境中的传播能力、竞争能力和存活能力未呈现显著优于野生球虫的趋势。     

E.tenella吉林株单卵囊的分离及PCR鉴定

[目的]为了获得E．tenella纯株,进行相关的分子生物学研究。[方法]对已经建立的球虫单卵囊分离技术进行改进,用分离的单卵囊胶囊接种雏鸡。同时应用PCR方法对收集的单卵囊分离株进行球虫种类鉴定。[结果]20只试验鸡中有15只粪便中分离到卵囊,感染成功率为75％。PCR扩增结果表明该单卵囊分离株为Etenella。[结论]采用单卵囊胶囊进行接种,操作简便,既节省了接种时间,又降低了接种难度,且大大提高了接种成功率,为球虫的分子生物学研究提供了材料。     

柔嫩艾美耳球虫抗马杜拉霉素、地克珠利虫株特异消减文库的构建

 以遗传背景一致的柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）敏感株孢子化卵囊为驱动组，马杜拉霉素抗药株和地克珠利抗药株孢子化卵囊为试验组，利用抑制消减杂交（SSH）方法，通过两轮杂交和两次PCR分别构建了富含两个抗药株孢子化卵囊与敏感株孢子化卵囊之间差异表达基因的消减cDNA文库。随机从两个消减文库中分别挑取50个克隆，经PCR鉴定马杜拉霉素抗药株和地克珠利抗药株孢子化卵囊的消减文库重组率分别为96%和98%，差异基因片段大小分布在250 bp～1.0 kb之间。从每个文库中随机挑取65个阳性克隆经斑点杂交试验，分别选择表达量上调的6个克隆进行序列分析和同源性比较。结果发现，有4个cDNA片段可能是新基因片段，与地克珠利抗药株的产生有关；有3个新的cDNA片段可能与马杜拉霉素抗药株的产生有关。这些结果将为克隆全长cDNA和探索球虫抗药性产生及发展的分子机理奠定了一定的基础。     

E．tenella吉林株单卵囊的分离及PCR鉴定

1材料与方法1．1材料①试验动物。1日龄海兰公雏,购自长春市北方鸡场。饲养于150℃,消毒1h的隔离器中,自由采食和饮水。饲喂不添加任何抗球虫药的全价饲料,喂前80℃高温消毒30min。②试验虫种。单卵囊分离用虫种,为该实验室从球虫严重临床发病鸡盲肠中分离。③试剂。基因组DNA提取试剂盒购于天根生化科技（北京）有限公司,D12000及PCR相关试剂购自大连宝生物工程有限公司。其他试剂均为国产分析纯。④仪器。     

两种方法提取柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊基因组DNA的对比试验

为寻找一种合适的提取球虫基因组DNA的方法,试验采用氯化苄法(BC)和常规提取DNA的方法提取了鸡柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊基因组DNA。氯化苄的化学性质类似于苯酚,在65℃条件下与蛋白质和几丁质等发生反应,能够有效地破坏球虫卵囊壁,可用于大规模提取基因组DNA;常规方法提取DNA的程序是用蛋白酶K消化处理,用酚/氯仿抽提,再用氯仿抽提,部分步骤需要重复。2种方法对比试验结果表明,二者均可用于鸡球虫基因组DNA的提取,所获得的DNA数量和质量都很高,可用于各种分子生物学实验。但BC法具有简便、快速、经济实用的特点,更适用于球虫卵囊大量样品的DNA快速提取。     

中药饮水剂对感染球虫后雏鸡血清一氧化氮及其合成酶的影响

为了进一步探讨中药饮水剂的抗球虫作用机制,将120只14日龄海兰褐蛋公雏,随机分为对照组(I)、感染组(Ⅱ)和中药饮水剂组(Ⅲ),每组40只。除I组外,其余每只鸡口服感染8.0×104个E.tenella孢子化卵囊,分别于感染0、3、6、9、12 d后,每组随机取鸡5只,心脏采血,用于血清一氧化氮(NO)及其合成酶(iNOS)的测定。结果表明,在感染后3 d,各组血清NO含量和iNOS活性无显著差异(P>0.05);在感染高峰期(6 d),Ⅲ组血清NO含量及iNOS活性较Ⅱ组分别降低了36.17%和14.25%,差异极显著(P<0.01),与Ⅰ组比较无显著差异(P>0.05);至感染后9 d,虽然Ⅲ组血清NO含量及iNOS活性与Ⅱ组差异不显著,但仍较其降低了12.53%和13.51%;至感染后12 d,Ⅱ组血清NO含量及iNOS活性基本恢复正常水平。结果提示:中药饮水剂通过抑杀球虫,以减少炎性因子的释放,抑制宿主细胞内iNOS活性及表达,降低血清NO含量。     

不同剂量柔嫩艾美耳球虫感染对雏鸡红细胞压积和血沉值的影响

试验应用1 0×103、1 0×104和5 0×1043个不同剂量的柔嫩艾美耳球虫(Eimeriatenella)孢子化卵囊,进行人工感染发病。对雏鸡感染后不同时间的红细胞压积容量(PCV)和红细胞沉降速率进行了测定。结果表明,一定剂量的柔嫩艾美耳球虫感染,可引起感染雏鸡红细胞压积容量降低(p<0 05,p<0 01),红细胞沉降速率加快(p<0 05,p<0 01)。随着感染剂量加大,两项指标的变化幅度也变大,且均以感染后的第5天时最为明显。     

一株和缓艾美耳球虫的致病性和免疫原性

笔者对新分离到的和缓艾美耳球虫进行了致病性和免疫原性的研究。结果表明雏鸡感染1 000和5 000孢子化卵囊表现正常,肠道没有肉眼可见的病理变化。20 000个卵囊感染引起轻微病变。100 000个卵囊和500 000 个卵囊感染则产生较为明显的致病作用,与不感染对照组相比增重分别为70．3％和56．8％,肠道外观也产生明显可见的病变,根据0-4分肠道计分标准,分别为1．43和2．37。所有实验鸡都没有出现死亡。该虫株免疫原性较强,一次免疫5 000个卵囊/只,就能够对200 000个卵囊/只感染产生坚强的保护作用。     

鸡柔嫩艾美耳球虫单卵囊分离技术的构建及致病性研究

构建了一种新的鸡柔嫩艾美耳球虫单卵囊分离技术 ,并对杨陵柔嫩艾美耳球虫地理株进行了分离 ,对继代增殖的纯种卵囊进行了致病性试验。结果表明 ,该单卵囊分离技术简单易行 ,单卵囊感染成功率可达4 0 % ;该虫株对雏鸡有很强的致病性 ,经口接种 1× 10 5个孢子化卵囊 ,致死率高达 80 %。     

安徽部分地区鸡球虫种类及感染情况调查

为了解安徽省部分地区鸡球虫种类及感染情况,采用群体采样法分别从肥西县、长丰县和凤台县采集鸡新鲜粪样,用饱和盐水漂浮法检查。阳性粪样采用饱和盐水漂浮和离心沉淀法进行卵囊分离。显微镜下观察卵囊进行虫种鉴定,并统计各调查点的鸡球虫感染率和感染强度等。结果表明,鸡球虫感染率为93.3%(84/90);共检获7种球虫,即:柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)、巨型艾美耳球虫(E.maxima)、堆型艾美耳球虫(E.acervulina)、毒害艾美耳球虫(E.necatrix)、布氏艾美耳球虫(E.brunetti)、和缓艾美耳球虫(E.mitis)、早熟艾美耳球虫(E.prae-cox)。     

中药方剂孢囊净对鸡球虫病的防治效果研究

[目的]筛选和探讨有效防治鸡球虫病的中药方剂。[方法]首先使用球虫孢子化抑制试验对常用的抗鸡球虫中药进行筛选,结合出血抑制试验筛选出常用的止血中药,并组成中药方剂＂孢囊净＂。选择120只15日龄海兰灰蛋雏鸡随机分为6组,阴性对照组饲喂正常饲料,不接种柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊,其他5组均同时接种感染柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊1.0×104个/只,阳性对照组饲料中不添加任何药物,3个中药组分别按质量分数为0.5%、1.0%和1.5%孢囊净添加于饲料当中,西药组添加质量分数为0.01%磺胺喹啉钠饮水作为治疗对照,测定各组理化指标和抗球虫指数。[结果]1.0%和1.5%中药组均能明显减少红细胞的损失,与阳性对照组比较差异极显著（P〈0.01）,与西药组比较,差异显著（P〈0.05）;1.0%和1.5%中药组白细胞数量明显低于阳性对照组,差异极显著（P〈0.01）,凝血时间明显缩短,与阳性对照组相比差异显著（P〈0.05）;1.5%中药组抗球虫指数达到了193.53,为高效抗球虫中药。[结论]中药方剂孢囊净通过抑制球虫孢子化、杀灭球虫、减少出血等途径对鸡球虫病进行防治,达到良好的效果。     

柔嫩艾美尔球虫的分离及病理学观察

采用单卵囊感染技术,从鸡球虫混合种中分离出1株柔嫩艾美尔球虫(E im eria tenella)。并对该株柔嫩艾美尔球虫的病理学做了进一步研究。利用柔嫩艾美尔球虫的寄生部位、肉眼病变、临床症状等生物学特性进行鉴定,并做回归动物实验,用此球虫卵囊100,000个感染雏鸡。取8天后明显病理变化的盲肠组织,采用石蜡切片技术,进行病理学观察。结果表明,在盲肠肠绒毛上皮、肠腺及肌层都有虫体寄生,并且有明显的出血病变。     

γ——射线辐射对兔球虫孢子化卵囊致病性及免疫原性的影响

本试验研究了不同剂量(5KR、15KR、25KR、35KR、45KR)的γ-射线辐射对家兔的E.stiedai球虫的孢子化卵囊致病性及免疫原性的影响。结果证明:γ-射线辐射可以降低E.stiedai球虫的致病性,同时也减弱它的免疫原性。其程度取决于辐射剂量。通过辐射卵囊和未受辐射卵囊的比较试验,認为用辐射致弱的球虫卵囊作为疫苗来預防球虫病是可能的。     

柔嫩艾美尔球虫库尔勒株免疫原性初步研究

本实验采用单卵囊分离技术,得到1株柔嫩艾美尔球虫(Eimeria tenella),对该株E.tenella的免疫原性做了初步研究,分别用100个卵囊/只,1,000个卵囊/只,10,000个卵囊/只的剂量免疫,以100,000个卵囊/只的剂量攻毒,结果显示,1000个卵囊/只的剂量免疫效果最好。     

6株肠艾美耳球虫繁殖力的比较研究

[目的]为肠艾美耳球虫的早熟选育及兔球虫疫苗的研制提供理论依据。[方法]采用6个不同地区肠艾美耳球虫的孢子化卵囊经口接种45日龄无球虫兔,接种剂量为1×104个卵囊/只,并对6株肠艾美耳球虫的繁殖力进行比较。[结果]衡水株排卵量最多,张家口株次之,胶南株排卵量最少。睢宁株的排卵量接近胶南株,如皋株、通江株相近,在感染后第8.5～9天均有排卵,各虫株的排卵高峰期相似,第13天排卵量达到峰值,第21天接近0。[结论]不同地理株肠艾美耳球虫的排卵量不同,但排卵高峰相一致。     

雏鸡免疫柔嫩艾美耳球虫早熟株和毒株的细胞免疫反应

AA肉鸡雏鸡分别经口免疫柔嫩艾美耳球虫毒株早熟株，用免疫组化ABC法染色检测小肠、盲肠扁桃体、脾脏中CD4^ 、CD8^ T淋巴细胞动态变化；用淋巴细胞转化实验MTT法检测T淋巴细胞活性。结果表明：球虫免疫鸡后，CD4^ T淋巴细胞在一次免疫后迅速增殖，第6天达到第一峰，免疫柔嫩艾美耳球虫毒株的鸡盲肠与脾脏中CD4^ T淋巴细胞占所有淋巴细胞百分率分别达到38％和44％，免疫早熟株的鸡盲肠与脾脏中CD4^ T淋巴细胞占所有淋巴细胞百分率分别达到36％和43％，而二次免疫后和对照相比很少有显著差异。CD8^ T淋巴细胞在一次免疫后比CD4^ T增殖速度慢，第9天达到第一峰。免疫柔嫩艾美耳球虫毒株的鸡在此日盲肠与脾脏中CD8^ T淋巴细胞占所有淋巴细胞百分率分别达到37％和47％，免疫早熟株的鸡在此日盲肠与脾脏中CD8^ T淋巴细胞占所有淋巴细胞百分率分别达到36％和48％，二次免疫后迅速大量增殖，免疫柔嫩艾美耳球虫毒株的鸡在二免后第2天盲肠与脾脏中CD8^ T淋巴细胞占所有淋巴细胞百分率分别达到39％和50％．免疫柔嫩艾美耳球虫早熟株的鸡在二免后第2天盲肠与脾脏中CD8^ T淋巴细胞占所有淋巴细胞百分率分别达到37％和50％。且CD8^ T淋巴细胞总体水平比CD4^ T淋巴细胞多。盲肠扁桃体中T细胞的增殖速度比其他组织更快。免疫早熟株的鸡与免疫毒株的鸡肠道黏膜中的CD4^ 、CD8^ T淋巴细胞变化基本一致。一次免疫鸡比未免疫对照T淋巴细胞活性显著升高；进行二免的鸡免疫后第一、二、三周T淋巴细胞活性均比未进行二免的鸡显著升高；毒株免疫鸡T淋巴细胞活性大多与早熟株免疫鸡无8显著差异。     

安徽部分地区鸡柔嫩艾美耳球虫单卵囊的分离与鉴定

为获得纯种柔嫩艾美耳球虫虫株,从安徽省巢湖市、霍邱县、定远县3个地区患球虫病的鸡场采集3株混合球虫,培养至孢子化,分离单卵囊接种1～7日龄的雏鸡,感染后7～12 d,收集卵囊,然后通过生物学特性和PCR方法进行虫种鉴定。结果显示,3个地区的单卵囊感染成功率分别为50%、57%和29%,各虫株经生物学特性和PCR鉴定均为柔嫩艾美耳球虫。研究表明:1.0%琼脂单卵囊分离法简便且成功率较高,利用特异性引物PCR鉴定虫株,为纯种地方株的研究奠定了基础。