甘肃省4种苹果病毒检测及其分子多样性分析

为明确甘肃省苹果产区苹果茎沟病毒（Apple stem grooving virus,ASGV）、苹果锈果类病毒（Apple scar skin viroid,ASSVd）、苹果褪绿叶斑病毒（Apple chlorotic leaf spot virus,ACLSV）和李属坏死环斑病毒（Prunus necrotic ringspot virus,PNRSV）4种病毒发生和分布情况,以及主要病毒的遗传多样性,采用RT-PCR技术进行鉴定,并对主要病毒cp基因片段测序分析。结果表明：在甘肃省5个市（县）苹果产区随机采集的93份叶片中,ASGV平均检出率达87.1%,ASGV成为危害甘肃省苹果的优势种,各苹果产区ASSVd、ACLSV和PNRSV平均检出率分别为41.9%、10.7%和11.8%,天水和兰州市4种苹果病毒检出率均高于其他地区;所有检测样品以“ASGV+ASSVd”为主要复合侵染类型,检出率达37.6%;4条ASGV cp基因片段的系统发育分析显示,4个分离物被聚在同一亚组,来自天水的分离物A29与来自中国云南苹果的ML-1分离物（JN871586.1）聚在同一支,与其核酸序列同源性为99.2%,A39与A42聚为一支,两者与来自中国陕西苹果的YL06分离物（EU236258.1）核酸序列同源性为97.1%和96.9%,A80与A39和A42共聚为一簇。     

河北苹果坏死花叶病毒的发生及近全基因组序列的测定与分析

为明确苹果坏死花叶病毒（Apple necrotic mosaic virus, ApNMV）在河北的发生及其基因组特性，本试验利用RT-PCR技术对河北保定两地ApNMV发病情况进行检测，然后通过高通量测序技术对带毒样本进行序列测定和分析。结果表明，河北农大果园‘红珍珠’‘锦锈红’‘信侬红’3个品种及保定唐县苹果实验基地富士品种ApNMV检出率分别为9.09%、18.18%、100%和65%。ApNMV阳性果树高通量测序结果显示，果树为ApNMV、苹果褪绿叶斑病毒（Apple chlorotic leaf spot virus, ACLSV）、苹果茎沟病毒（Apple stem grooving virus, ASGV）和苹果茎痘病毒（Apple stem pitting virus, ASPV）复合侵染，ApNMV河北分离物（ApNMV-HB）的近全基因组序列包含RNA1～RNA3序列，GenBank登录号分别为OP019626、OP019627和OP019628。RNA1编码120 kD的甲基转移酶/NTP-binding解旋酶（MET/HEL）,RNA2编码97 kD的RNA聚...     

3种苹果潜隐性病毒一步多重RT-PCR检测体系的优化

为建立更为快速准确的苹果潜隐性病毒检测方法,以携带苹果茎沟病毒(ASGV)、苹果褪绿叶斑病毒(ACLSV)和苹果茎痘病毒(ASPV)的田间苹果成龄树为试材,设计合成了扩增目的片段为273 bp(ASGV)、358bp(ACLSV)和432 bp(ASPV)的3对特异性引物,并对影响RT-PCR体系的主要参数进行试验优化.结果表明:建立的一步多重RT-PCR体系可以实现对3种主要潜隐性病毒的特异性检测;通过对田间多个样品的检测验证,表明该方法的准确性和灵敏度都很高,并缩短了单个样品的检测时间,极大地提高了工作效率.     

我国苹果病毒病的研究现状

我国从1978年开始对苹果病毒病进行系统研究,目前初步明确了我国苹果主产区主要病毒病的种类及特性,在病毒检测方面也取得了很大进展。介绍了我国苹果上主要病毒的特性,这些病毒包括苹果花叶病毒（ApMV）、苹果锈果类病毒（ASSVd）、苹果绿皱果病毒（AgrCV）、苹果褪绿叶斑病毒（ACLSV）、苹果茎痘病毒（ASPV）和苹果茎沟病毒（ASGV）;阐述了这些苹果病毒病所采用的技术,包括指示植物、电子显微镜技术、血清学方法、分子生物学技术等。     

基于高通量测序对引起苹果外观异常病原的鉴定

【目的】研究引起新疆阿拉尔苹果外观异常病原的种类、发病类型及严重程度,为防治此类病害提供理论依据。【方法】在新疆阿拉尔六团一连采用实地调查采样,分类描述苹果外观异常;用五点取样法调查发病区发病率、发病品种等;采用高通量基因测序技术分析其病原病毒分子生物学。【结果】苹果外观异常平均发病率为70.45%。田间症状主要有果实畸形型、锈果型、着色异常型三种类型。主要病毒有苹果褪绿叶斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus, ACLSV)、苹果茎痘病毒(Apple stem pitting virus, ASPV)、苹果茎沟病毒(Apple stem grooving virus, ASGV),苹果花叶病毒(Apple mosaic virus, ApMV)和苹果绿皱果病毒(Apple green crinkle virus, AgrCV)5种类型,在不同品种中病毒种类存在差异。【结论】阿拉尔苹果外观异常病毒病发生较为严重且呈多种病毒混合发生,其引起的症状与苹果锈果类病毒病症状相似。     

上饶早梨主栽品种病毒种类分析及其茎尖脱毒技术效率比较

对上饶早梨3个主栽品种的病毒种类进行分析,并对其不同茎尖脱毒技术的效率进行比较。结果表明,花厅六月雪和田墩六月雪没有检测到苹果茎痘病毒(ASPV),花厅黄皮消检测到ASPV,田墩六月雪、花厅六月雪和花厅黄皮消均检测到苹果茎沟病毒(ASGV)和苹果锈果类病毒(ASSVd),但均未检测到苹果褪绿叶斑病毒(ACLSV)和苹果花叶病毒(Ap MV)。对于上饶早梨3个主栽品种来说,超低温疗法的脱毒效率显著高于常规茎尖培养,在3种超低温疗法脱毒技术中,包埋玻璃化法超低温疗法的脱毒效率最高。SSR荧光标记毛细管电泳检测表明,常规茎尖培养和3种超低温疗法脱毒技术均能保证上饶早梨3个主栽品种的遗传稳定性。该研究有助于上饶早梨种苗病毒病害的检测鉴定和实时监控检疫,同时也可为建立上饶早梨种质资源超低温库和生产无毒苗提供一定的技术支撑。     

苹果潜隐性病毒一步三重检测体系的建立与优化

【目的】在两步单重检测体系基础上,建立能同时检测苹果茎痘病毒(ASPV)、苹果茎沟病毒(ASGV)和苹果褪绿叶斑病毒(ACLSV)的一步三重检测体系,以简化苹果潜隐性病毒检测方法。【方法】以携带ASPV、ASGV、ACLSV的苹果优系‘浓果-25’组培苗为试材,比较一步单重、一步两重和一步三重RT-PCR 3种检测体系的检测效果,对一步三重检测法中的退火温度、反转录时间、延伸时间、循环数和引物加量进行优化,并用带毒情况不同的苹果田间根茎叶、组培苗、脱毒苗对优化后的RT-PCR一步三重检测体系进行验证。【结果】一步单重RT-PCR体系一次只能检测1种病毒,一步两重RT-PCR体系一次能同时检测2种病毒,一步三重RT-PCR体系一次能同时检测3种病毒。优化后的一步三重RT-PCR检测体系为:50℃反转录20 min;94℃预变性20 min;94℃变性30 s,53～56℃退火30 s,72℃延伸30 s,30个循环,引物加量为各病毒上、下游引物(10μmol/L)各1.0μL,无需进行终延伸。优化后的一步三重检测体系验证结果与两步单重检测结果一致,初步证明该检测体系合理。【结论】建立了苹果潜隐性病毒一步三重检测体系,该体系能同时对苹果样品中ASPV、ASGV和ACLSV 3种病毒进行检测。     

库尔勒香梨上苹果茎沟病毒的三种分子生物学检测技术比较研究

采用反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）、试管捕捉反转录聚合酶链式反应（TC-RT-PCR）及免疫捕捉反转录聚合酶链式反应（IC-RT-PCR）技术对20份库尔勒香梨样品进行苹果茎沟病毒（Apple stem grooving virus,ASGV）检测,结果显示RT-PCR检测出7份样品感染ASGV,再使用TC-RT-PCR与IC-RT-PCR进行复检,有6份样品检测到ASGV,说明TCRT-PCR与IC-RT-PCR不如RT-PCR的灵敏度高,但是TC-RT-PCR与IC-RT-PCR不需要提取总RNA,操作简便,且减少有毒有机溶剂的危害与污染。TC-RT-PCR与IC-RT-PCR相比,检测得到的特异性带较清晰。     

苹果无病毒母本树的培育技术研究

 1990～1994年，采用3种方法对26个苹果品种和3个矮化砧木进行了脱毒试验，获得24个苹果品种、2个矮化砧木共51株无病毒原种母本树。脱毒株率分别为：单纯热处理26.5%、单纯茎尖培养35.0%、热处理与茎尖培养并用脱毒66.7%。在未脱除的病毒中，苹果褪绿叶斑病毒（ACLSV）占20.9%、苹果茎痘病毒（ASPV）占29.3%、苹果茎沟病毒（ASGV）占49.8%。     

苹果优新品种无病毒母本树的培育

采用盆苗或试管苗热处理方法对昂林等16个苹果优新品种进行脱毒处理,采用木本指示植物2重芽接法和RT-PCR技术检测ASGV、ASPV和ACLSV 3种病毒,共获得11个苹果品种35株无病毒母本树,其中,盆苗热处理平均脱毒株率为46.1%,试管苗热处理平均脱毒株率为79.2%。     

青稞转录因子HvnANT1基因的克隆与表达分析

为探究HvnANT1基因在青稞粒色形成过程中的基因表达模式,以紫粒青稞‘涅如姆扎’和白粒青稞‘昆仑10号’为试材,利用简化基因组GBS(Genotyping-by-Sequencing)对青稞紫粒进行基因定位,克隆到HvnANT1基因,对其进行生物信息学分析。结果表明:1)在7H染色体的84.30—86.00 cM获得1个MYB类转录因子,命名为HvnANT1。2)该基因长1 033 bp,其完整开放阅读框为762 bp,编码253个氨基酸。HvnANT1蛋白分子量为27.14 kU,是亲水性的不稳定碱性蛋白且不存在跨膜结构,无信号肽。该蛋白的二级结构主要是由无规卷曲、α-螺旋、延伸链和β-转角组成,具有2个SANT结构域(分别位于第13—第63个;第66—第114个氨基酸)。3)同源比对与系统进化分析表明:青稞HvnANT1蛋白与大麦、乌拉尔图小麦、高梁、玉米、二型花、小米、水稻、土瓶草、车轴草和杨梅10种植物的ANT1蛋白序列相似性分别为100.00%、88.85%、54.64%、60.95%、60.82%、58.46%、57.61%、37.76%、36.05%和36.33%;这些序列都具有2个高度保守的2个SANT结构域;与大麦的亲缘关系最近,其次是与乌拉尔图小麦,与水稻最远。4)亚细胞定位结果表明,该基因定位在细胞核内。5)实时荧光定量PCR(qRT-PCR)结果显示:与籽粒颜色形成的乳熟早期和乳熟晚期相比,软面团期的HvnANT1基因在‘涅如姆扎’中表达量极显著上调,而在‘昆仑10号’中各时期的表达量较低且差异不显著;且软面团期的‘涅如姆扎’籽粒HvnANT1基因的表达量极显著高于‘昆仑10号’(P<0.01)。花青素合成相关的结构基因HvnCHI、HvnANS和HvnDFR与该基因表达量模式相似。综上,青稞HvnANT1蛋白结构中的SANT结构域在物种进化过程中比较保守;该基因定位在细胞核内,符合转录因子特性;HvnANT1基因表达模式与结构基因HvnCHI、HvnANS和HvnDFR相似,在籽粒颜色形成的软面团期表达量极显著升高。     

岚皋魔芋软腐病病原细菌生物多样性研究

【目的】研究岚皋魔芋软腐病病原细菌生物多样性。【方法】采用组织分离法分离纯化魔芋软腐病球茎及叶柄中的致病菌,通过魔芋球茎、胡萝卜及马铃薯块的侵染试验初步确定其致病性,再利用魔芋球茎侵染致病及盆栽致病性试验确认其致病性;经菌落与细胞形态、生理生化特性及16SrRNA序列测定确定病原菌的类型。【结果】从魔芋软腐病球茎及叶柄中共分离获得16株细菌,侵染试验表明,其中CDS1-B1、CDS1-B2、CDS2-B1、CDS2-B2、CZS-B4和CZS-B6共6株细菌可使魔芋球茎表现软腐症状,并导致盆栽魔芋发病;6株细菌的菌落与细胞形态均存在差异;在魔芋、胡萝卜及马铃薯块上的侵染能力不同;16SrRNA序列分析表明,菌株CDS1-B1、CDS1-B2、CDS2-B1及CDS2-B2均与菊欧氏杆菌(Erwinia chrysanthemi)亲缘关系最近,菌株CZS-B4与菊欧文氏菌(Dickeya dadantii)亲缘关系最近,相似度为98.8%,菌株CZS-B6与菊果胶杆菌(Pectobacterium chrysanthemi)的相似度达99.9%。【结论】导致岚皋县魔芋软腐病的致病细菌存在生物多样性,其致病性也存在差异,其中新发现的魔芋软腐病原菌菊果胶杆菌(Pecto-bacterium chrysanthemi)致病性最强,菊欧氏杆菌(Erwinia chrysanthemi)和菊欧文氏菌(Dickeya dadantii)致病性较弱。     

广西4种丛生竹基本特性的研究

以广西壮族自治区4种丛生竹:撑篙竹、花吊丝竹、粉单竹和马蹄竹为研究对象,探索其横切面维管束分布特征以及主要物理力学特性。结果表明,粉单竹维管束分布较为紧密,维管束密度最大,撑篙竹、花吊丝竹维管束分布较为分散,马蹄竹维管束密度最小;粉单竹的基本密度、气干密度和全干密度,以及力学特性在4种丛生竹中最大,其次是花吊丝竹,撑篙竹与马蹄竹物理力学特性相近。研究发现,粉单竹材性最好,可进行工业化加工利用,花吊丝竹、撑篙竹及马蹄竹可分离出竹青部分再进行高效加工利用。     

危害陕西茶区茶树的小绿叶蝉种类订正及对我国茶树小绿叶蝉的再认识

【目的】通过对危害陕西茶区茶树的小绿叶蝉进行鉴定,明确陕西茶区该类害虫的学名和特征,并对危害我国茶树的小绿叶蝉种类进行了探讨。【方法】运用网捕法采集小绿叶蝉成虫,用显微照相机(CCD)拍摄成虫照片,在解剖镜下观察其一般形态和雄性外生殖器特征,并对小绿叶蝉种类进行鉴定。【结果】采自陕西茶区茶园的小绿叶蝉的外部形态和雄性外生殖器特征与小贯小绿叶蝉Empoasca(Matsumurasca)onukii相同,而与该地已有报道的小绿叶蝉的特征不同。【结论】危害陕西茶区茶树的小绿叶蝉应为小贯小绿叶蝉(Empoasca(Matsumurasca)onukii),我国茶树小绿叶蝉的种名有待进一步明确。     

新疆南疆部分地区3种璃眼蜱的分子生物学鉴定

旨在对新疆南疆部分地区璃眼蜱属的蜱进行分子生物学鉴定,了解其分布情况。采集新疆南疆部分地区蜱,通过形态学鉴定将璃眼蜱属蜱作为样本,通过12SrDNA和16SrDNA基因扩增、测序及序列分析进行蜱种类鉴定。13个采样点共559只璃眼蜱属蜱,鉴定为3种,分别为小亚璃眼蜱、亚洲璃眼蜱和残缘璃眼蜱。     

陕西菜田2种粉虱数量结构及烟粉虱生物型鉴定

旨在研究陕西菜田烟粉虱和白粉虱的数量结构,为粉虱风险评估和防治策略制定提供理论依据。利用定点调查与普查相结合的方法,对陕西关中、陕南和陕北不同生态区、不同季节、不同蔬菜作物以及不同菜田烟粉虱和温室白粉虱的种群分布和组成进行研究,并结合mtDNA-CO1标记基因实现对陕西菜田烟粉虱的生物型鉴定。结果表明,烟粉虱和温室白粉虱的分布和种群组成因地区、季节、作物种植模式不同而异。其中烟粉虱均呈现优势分布,并占到种群数量的67.2%～100%。采用标记基因技术、序列同源性分析和系统发育研究,明确了陕西菜田烟粉虱生物型为Q型烟粉虱。     

高等植物花发育的研究进展

以金鱼草和拟南芥菜为例,介绍近年高等植物花发育的研究进展。ＴＦＬ和ＣＥＮ基因具有维持花序分生组织特性的功能;ＤＣＬＶ１基因在营养型分生组织向生殖型分生组织转化中起调节作用;ＬＥＹ、ＡＰ１、ＣＡＬ和ＦＬＯ控制花分生组织形态特征;ＡＰ１／ＳＱＵＡ、ＡＰ２作用于Ａ功能区,控制萼片和花瓣的发育;ＡＰ３／ＤＥＦ、ＰＩ／ＧＬＯ执行Ｂ功能控制花瓣和雄蕊的发育;ＡＧ／ＰＬＥ对应于Ｃ功能区控制雄蕊和心皮的发育;Ａ、Ｂ、Ｃ三个功能区共同作用控制整个花器官的结构     

假结核耶尔森氏菌rpoS基因的抗胁迫功能

为探讨食源性病原微生物假结核耶尔森氏菌的抗逆机制,采用同源重组原理进行双交换以获得rpoS基因突变株。分别在5mmol/L H_2O_2和pH 3.5两种胁迫下测定野生型菌株、rpoS基因突变株和互补菌株的存活率,并以2′,7′-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)为荧光探针,测定两种胁迫下细菌胞内活性氧水平。结果显示,在5mmol/L H_2O_2和pH3.5胁迫下,假结核耶尔森氏菌rpoS基因突变株存活率明显降低,这种降低能够在互补菌株中得到恢复;突变株中胞内活性氧自由基水平明显高于野生型菌株和互补菌株。说明:rpoS基因具有帮助假结核耶尔森氏菌抗氧化胁迫和酸胁迫的功能,且这一功能的发挥是通过调节胞内活性氧水平实现的。     

陕西榆林山药根腐病病原菌的分离与鉴定

旨在明确引起陕西省榆林市山药根腐病的致病菌,为该地区山药根腐病的防治提供参考。以受害山药块茎和根际土壤为试验材料,通过组织分离法获得纯培养,结合柯赫氏法则、形态学鉴定、ITS区序列分子生物学鉴定,以及构建系统发育树和序列比对的方法,明确山药根腐病的致病菌。结果表明,引起陕西榆林山药根腐病的病原菌为棕黑腐质霉、燕麦镰孢和尖孢镰孢。陕西榆林山药根腐病由腐质霉属和镰孢属两个属的3种病原菌引起,棕黑腐质霉是首次报道危害山药,镰孢属真菌是该地区山药根腐病的主要致病菌。     

外源蛋白在苜蓿体细胞胚中的表达

【目的】探讨转基因苜蓿植株根、茎、叶和体细胞胚中外源GUS的表达情况,为外源蛋白在苜蓿体细胞胚中的积累提供理论依据。【方法】以在加拿大广泛种植的N4.4.2紫花苜蓿品种的叶柄为外植体,进行农杆菌GV3101介导的苜蓿遗传转化,将感染的苜蓿叶柄外植体置于不同的转化培养基中培养,获得了适合于农杆菌介导的转基因苜蓿植株,将其用于转基因体细胞胚的诱导。采用PCR方法筛选阳性株系,并对其进行GUS组织化学染色分析,对转基因植株根、茎、叶和体细胞胚进行荧光定量分析。【结果】以苜蓿叶柄为外植体成功获得11株阳性转基因植物,转化效率为30.6%。GUS荧光定量分析结果表明,体细胞胚中GUS外源蛋白的表达量明显高于根、茎和叶,是其表达量的3～6倍;根、茎和叶中GUS表达量较低,且三者间没有明显差异。【结论】苜蓿体细胞胚能积累相对高的外源蛋白,是外源蛋白表达的最佳材料,为外源蛋白大量工厂化生产奠定了实验基础。