半胱氨酸蛋白酶基因表达载体的构建及转基因苜蓿的初步研究

【目的】为培育高抗逆的作物品种提供科学依据。【方法】以耐盐苜蓿"中苜1号"为外植体,采用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的叶盘法转化苜蓿。【结果】成功构建了含有半胱氨酸蛋白酶基因MsCP1和报告基因GUS的植物表达载体pCAMBLA1391-CP-GUS,共获得47株抗性再生植株。经PCR和RT-PCR检测,表明外源基因已成功整合到苜蓿基因组中,并在转录水平得到表达。【结论】初步获得了高抗逆的转基因苜蓿新品系。     

花生油酸脱氢酶基因遗传转化体系的建立与表达分析

 【目的】培育高油酸的花生新种质。【方法】以根癌农杆菌为介导将含有油酸脱氢酶基因的植物双元表达载体pFGC/2nd转入花生外植体丛生芽,通过卡那霉素筛选,器官发生再生转化植株;荧光定量PCR检测转基因植株。【结果】丛生芽外植体于OD600为0.6的农杆菌菌液中浸泡8～10 min后,在MS培养基上暗培养3 d效果较好。诱导筛选培养3个月左右,共得到16株转化植株,其中11个转基因植株经PCR检测呈阳性,说明外源基因已整合进入受体植物。进一步的荧光定量PCR检测显示,有4个植株基本上不表达或表达量很低。【结论】建立花生丛生芽遗传转化体系;RNA干扰对内源的油酸脱氢酶基因产生了抑制作用。     

超声波辅助农杆菌转化OT百合‘罗宾娜’的研究

【目的】通过超声波处理辅助农杆菌转化OT百合小鳞片,提高农杆菌介导法转化百合的效率。【方法】以OT百合‘罗宾娜’(Lilium tenuifoliumoriental×tumpet‘Robina’)的再生小鳞片为外植体,分别以80W功率的超声波处理1,2,3,4,5min,通过超声波处理辅助根癌农杆菌进行外源基因的转化,同时以未进行超声波处理为对照;利用GUS组织化学法,分别检测转化脱菌后筛选培养7d的外植体和筛选培养60d后形成的潮霉素抗性再生植株叶片、小鳞片、根系的GUS瞬时表达和稳定表达,提取潮霉素抗性植株基因组DNA进行GUS和HPT基因的PCR扩增分析。【结果】超声波处理的农杆菌介导转化的百合外植体经GUS组织化学染色,多数可见蓝色斑点,且以3min超声波处理的蓝色最深;3min超声波处理的外植体对潮霉素的抗性率最高达48.85%,未经超声波处理的仅为15.56%,二者差异达显著水平。从53个潮霉素抗性再生植株的DNA样品中扩增得到了GUS基因和HPT基因的扩增片段,其中超声波处理3min的PCR阳性植株转化率最高,为28.30%,而未进行超声波处理的PCR阳性植株转化率仅为5.66%,初步证明外源基因可能整合到百合基因组中。【结论】20℃条件下80W功率超声波处理3min,可以有效提高农杆菌介导法转化OT百合的效率。     

农杆菌介导的薹菜遗传转化体系研究

以薹菜子叶-子叶柄为外植体,研究了根癌农杆菌介导的遗传转化技术。用含GUS和NPTⅡ基因的农杆菌侵染子叶-子叶柄,获得了具有卡那霉素抗性的再生植株。再生植株经GUS组织染色,证实外源基因转化到植物基因组中。卡那霉素敏感性测定结果表明,当培养基中含卡那霉素（Km）15 mg/L时,非转化再生植株全部白化。转基因抗性芽筛选的适宜的卡那霉素浓度为10 mg/L。     

百脉根表达H5N1亚型禽流感血凝素的研究

 【目的】将H5N1亚型禽流感病毒血凝素（AIVHA）基因转入牧草植物中,利用豆科牧草作为植物生物反应器来生产禽流感抗原蛋白,探索研制禽流感转基因植物可饲用疫苗的可行性。【方法】以百脉根子叶柄外植体作为转化受体,通过农杆菌介导法将AIVHA基因导入百脉根,子叶柄外植体经过共培养、筛选分化、再生, 得到抗性植株。对抗性植株进行了PCR、RT-PCR检测和Western blot分析。【结果】证明AIVHA基因已经导入到百脉根基因组中,在核酸水平和蛋白水平都得到了表达。【结论】利用百脉根表达禽流感抗原蛋白是可行的。     

转G10aroA棉花株系的获得及分子生物学鉴定

【目的】培育具有抗草甘膦除草剂的棉花材料具有极其重要的意义。利用农杆菌介导法在棉花中转入编码EPSPS酶的抗草甘膦除草剂基因G10aroA,通过体细胞愈伤诱导组织培养技术获得能够稳定遗传的转基因棉花株系材料。【方法】首先,利用不同草甘膦抗性筛选条件比较分析不同棉花受体材料的愈伤诱导效率;其次,以R15材料作为受体,利用含有G10aroA的农杆菌侵染下胚轴切段,在进行体细胞愈伤诱导的组织培养过程中通过草甘膦抗性筛选获得棉花再生植株,对获得的棉花再生植株进行纯合繁育。在此基础上,利用PCR扩增检测证实外源G10aroA在转基因植株中能够稳定遗传;利用RT-PCR分析其外源基因在转基因植株不同组织中的转录水平进行研究、并进一步利用Western-blot对转基因植株中外源蛋白的表达进行分析。【结果】在优化的草甘膦筛选条件下,以草甘膦浓度为2.5 mmol•L-1的抗性条件进行棉花愈伤诱导筛选并获得棉花再生植株;利用特异引物进行PCR检测结果表明,在检测的全部再生植株中,扩增得到1.8 kb预期大小目标条带的阳性株系32株,其中,收获的27个株系的外源目标基因能够在T0、T1转基因植株中稳定遗传;对G10aroA在转基因株系L12、L14的不同组织中的转录表达进行定量RT-PCR分析表明,外源G10aroA在转基因棉花植株的不同组织中表达具有差异,相对表达量高低依次为茎、苞叶、叶和花;另外,蛋白检测结果进一步表明,该外源基因能够在转基因株系L7、L12和L14中植株中正常表达为预期46 kD的EPSPS蛋白。【结论】通过农杆菌介导法转化外源抗草甘膦基因G10aroA,在草甘膦抗性条件下进行棉花体细胞诱导的组织培养,成功获得转外源G10aroA的棉花再生株系,并通过分子生物学方法研究证实外源G10aroA能够在T0、T1转基因株系中稳定遗传、转录以及表达。     

农杆菌介导的2mG_2-epsps基因转化玉米自交系18-599R幼胚的研究

【目的】对农杆菌介导的抗草甘膦新基因2 mG2-epsps转化玉米18-599R幼胚的体系进行优化,以获得具有明显草甘膦抗性的转基因植株。【方法】以玉米18-599R幼胚为受体,采用农杆菌介导法,对转化时的预处理条件、菌液浓度×浸染时间、草甘膦筛选浓度设置处理,以优化转化体系;并用PCR、实时荧光定量PCR和喷洒草甘膦鉴定外源基因在转基因植株中的表达情况。【结果】热激处理对抗性愈伤率没有明显的提高作用,离心处理会降低抗性愈伤率;菌液浓度为OD600=0.6,浸染时间为10 min时,平均抗性愈伤率最高,为37.33%;草甘膦浓度为2.0mmol/L是比较理想的筛选浓度;实验共得到46株再生植株,5株PCR检测呈阳性,阳性率为10.87%;实时荧光定量PCR表明外源基因在T2代植株的根、茎、叶中均有表达;对T2代转基因植株喷洒1.5g/L的草甘膦,表现出耐受性。【结论】实验成功将2 mG2-epsps导入18-599R基因组,并获得了明显的草甘膦抗性。     

水稻OsHOX6启动子的组织特异性表达

【目的】研究水稻HD-ZipⅠ转录因子家族的成员OsHOX6基因启动子的表达。【方法】通过构建水稻OsHOX6基因启动子与GUS基因融合表达载体,利用农杆菌(Agrobacterium)介导,以未成熟水稻胚作为试验材料,转化到水稻IR64,通过PCR检测和潮霉素抗性筛选出阳性的转基因植株,从不同组织取样品,进行X-Gluc染色并观察。【结果】转基因植株的叶、根、茎、花等器官经过X-Gluc染色后,主要在侧根、花粉以及组织损伤部分出现蓝色斑点,其它组织均未检测出蓝色斑点,观察根解剖结构,绿色斑点集中在根内皮层。【结论】 水稻OsHOX6基因启动子能够驱动GUS基因,在转基因水稻侧根和花粉上特异表达。     

拟南芥2-甲基-6-叶绿基-1,4-苯醌甲基转移酶启动子在转基因烟草中的表达特性分析

通过对报告基因GUS产物的分析进行了拟南芥2-甲基-6-叶绿基-1,4-苯醌甲基转移酶(MPBQMT)启动子在转基因烟草中的表达特性的初步研究。构建含该启动子和GUS报告基因的植物表达载体,通过农杆菌介导转化烟草,对转基因烟草进行GUS组织化学染色和GUS荧光定量分析该启动子表达特性。GUS在转基因烟草的根和种子中基本不表达,茎上有一定表达,叶上表达量最高,约是茎的4.7～10.9倍。结果表明MPBQMT基因启动子主要在烟草绿色组织中特异性高表达。     

玉米根部特异性启动子的克隆及功能分析

【目的】从玉米幼根基因组DNA中克隆β-葡萄糖苷酶基因根部特异性启动子序列ZmGLU1P,并对其功能进行分析。【方法】利用PCR技术从玉米品种P138幼根基因组DNA中克隆玉米根部特异性启动子片段ZmGLU1P,将其与GUS基因融合,构建植物表达载体pCAMBIA121-ZmGLU1P,转化到EHA105根癌农杆菌中,通过根癌农杆菌介导法转化烟草NC89,对转化烟草植株进行PCR和Southern杂交检测。采集PCR和Southern杂交检测为阳性的转基因烟草的根、茎、叶,进行GUS活性的组织染色检测。【结果】克隆获得了ZmGLU1P片段,其长度为1 846 bp,与已报道的序列同源性达99%以上。转基因烟草植株的PCR和Southern杂交结果显示,成功地获得了转基因阳性植株;GUS活性检测表明,根中GUS活性最强,而在茎和叶等组织中GUS活性甚微,表明ZmGLU1P片段具有根部特异性启动子功能。【结论】玉米β-葡萄糖苷酶基因上游1 846 bp的片段ZmGLU1P具有根部特异性启动子功能,为根部特异性启动子。     

青稞转录因子HvnANT1基因的克隆与表达分析

为探究HvnANT1基因在青稞粒色形成过程中的基因表达模式,以紫粒青稞‘涅如姆扎’和白粒青稞‘昆仑10号’为试材,利用简化基因组GBS(Genotyping-by-Sequencing)对青稞紫粒进行基因定位,克隆到HvnANT1基因,对其进行生物信息学分析。结果表明:1)在7H染色体的84.30—86.00 cM获得1个MYB类转录因子,命名为HvnANT1。2)该基因长1 033 bp,其完整开放阅读框为762 bp,编码253个氨基酸。HvnANT1蛋白分子量为27.14 kU,是亲水性的不稳定碱性蛋白且不存在跨膜结构,无信号肽。该蛋白的二级结构主要是由无规卷曲、α-螺旋、延伸链和β-转角组成,具有2个SANT结构域(分别位于第13—第63个;第66—第114个氨基酸)。3)同源比对与系统进化分析表明:青稞HvnANT1蛋白与大麦、乌拉尔图小麦、高梁、玉米、二型花、小米、水稻、土瓶草、车轴草和杨梅10种植物的ANT1蛋白序列相似性分别为100.00%、88.85%、54.64%、60.95%、60.82%、58.46%、57.61%、37.76%、36.05%和36.33%;这些序列都具有2个高度保守的2个SANT结构域;与大麦的亲缘关系最近,其次是与乌拉尔图小麦,与水稻最远。4)亚细胞定位结果表明,该基因定位在细胞核内。5)实时荧光定量PCR(qRT-PCR)结果显示:与籽粒颜色形成的乳熟早期和乳熟晚期相比,软面团期的HvnANT1基因在‘涅如姆扎’中表达量极显著上调,而在‘昆仑10号’中各时期的表达量较低且差异不显著;且软面团期的‘涅如姆扎’籽粒HvnANT1基因的表达量极显著高于‘昆仑10号’(P<0.01)。花青素合成相关的结构基因HvnCHI、HvnANS和HvnDFR与该基因表达量模式相似。综上,青稞HvnANT1蛋白结构中的SANT结构域在物种进化过程中比较保守;该基因定位在细胞核内,符合转录因子特性;HvnANT1基因表达模式与结构基因HvnCHI、HvnANS和HvnDFR相似,在籽粒颜色形成的软面团期表达量极显著升高。     

新疆南疆部分地区3种璃眼蜱的分子生物学鉴定

旨在对新疆南疆部分地区璃眼蜱属的蜱进行分子生物学鉴定,了解其分布情况。采集新疆南疆部分地区蜱,通过形态学鉴定将璃眼蜱属蜱作为样本,通过12SrDNA和16SrDNA基因扩增、测序及序列分析进行蜱种类鉴定。13个采样点共559只璃眼蜱属蜱,鉴定为3种,分别为小亚璃眼蜱、亚洲璃眼蜱和残缘璃眼蜱。     

广西4种丛生竹基本特性的研究

以广西壮族自治区4种丛生竹:撑篙竹、花吊丝竹、粉单竹和马蹄竹为研究对象,探索其横切面维管束分布特征以及主要物理力学特性。结果表明,粉单竹维管束分布较为紧密,维管束密度最大,撑篙竹、花吊丝竹维管束分布较为分散,马蹄竹维管束密度最小;粉单竹的基本密度、气干密度和全干密度,以及力学特性在4种丛生竹中最大,其次是花吊丝竹,撑篙竹与马蹄竹物理力学特性相近。研究发现,粉单竹材性最好,可进行工业化加工利用,花吊丝竹、撑篙竹及马蹄竹可分离出竹青部分再进行高效加工利用。     

扩展莫尼茨绦虫丝氨酸蛋白酶抑制剂基因serpin部分片段克隆及不同体节mRNA转录水平分析

旨在初步了解丝氨酸蛋白酶抑制剂基因在扩展莫尼茨绦虫生长发育中的作用。采用分子克隆获得扩展莫尼茨绦虫丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin基因部分片段,应用MEGA软件对其进行进化分析。同时以beta-Tubulin基因作为内参基因,采用SYBR Green real-time RT-PCR技术检测该基因在扩展莫尼茨绦虫4个不同发育阶段即头节、幼节、成节、孕节中的表达差异,最终克隆获得749bp的serpin基因片段。进化分析表明,扩展莫尼茨绦虫serpin基因与多方棘球蚴serpin基因有较近的亲缘关系。标准曲线分析显示,serpin和beta-Tubulin基因的Ct值与阳性质粒的浓度均呈良好的线性关系,相关系数均大于0.99,熔解曲线分析表明,产物为特异的单峰,具有较高的特异性。同时试验结果显示,serpin基因在虫体各发育阶段中的表达丰度存在差异,从高到低依次为孕节、头节、成节、幼节。由此初步推测,此基因可能在扩展莫尼茨绦虫虫卵发育为六钩蚴的过程中发挥一定作用。     

美洲棘蓟马体内共生菌Wolbachia的wsp基因分子检测及系统发育分析

【目的】对美洲棘蓟马体内共生菌Wolbachia进行分子生物学鉴定,确定该蓟马体内Wolbachia的进化位置,为进一步探讨Wolbachia对其生殖作用的调控机制提供理论依据。【方法】以wsp基因为目的基因,对美洲棘蓟马体内的共生菌Wolbachia进行特异性扩增和测序,使用Clustal X 1.83软件对所得DNA序列进行比对;在MEGA 4.0软件中采用邻接法对Wolbachia的系统发育关系进行分析。【结果】利用wsp基因的特异性引物从美洲棘蓟马体内扩增出了632 bp的Wolbachia的wsp基因片段(GenBank登录号为JN315668),580 bp的Wolbachia A群的wsp基因片段和405 bp的Mel亚群的wsp基因片段。系统发育分析结果表明,美洲棘蓟马体内的Wolbachia与黑腹果蝇亲缘关系较近。【结论】美洲棘蓟马体内感染的Wolbachia属于A群Mel亚群。     

芽孢杆菌拮抗镰孢菌机制的研究进展

镰孢菌（Fusarium）分泌多种真菌毒素引起的枯萎病、赤霉病、根腐病和穗腐病等植物病害,造成重大的作物生产损失。化学防治是防治镰孢菌的重要手段,但其带来的镰孢菌抗性和生态环境污染等问题,严重制约了农业可持续发展。在病害管理中使用生物防治剂为控制镰孢菌引起的植物病害提供了一种安全、有效和可持续的手段,因此生物防治具有比化学防治更深远的优势。在生物防治剂中使用最广泛的生防微生物是芽孢杆菌属（Bacillus）的成员,其可通过多种机制为植物提供有效控制镰孢菌入侵的方案。芽孢杆菌作为一种优良的生物防治剂已被广泛研究,其可通过生态位竞争、产生抗菌物质、诱导植物系统抗性和塑造根际健康微生物组来拮抗镰孢菌侵染,本文从以上4个方面对芽孢杆菌拮抗镰孢菌的机制进行综述,为农业生产中芽孢杆菌防治镰孢菌病害的研究提供参考。     

乌梅等20种中药对胸膜肺炎放线杆菌的体外抗菌活性研究

【目的】观察乌梅Fructus mume等20种中药的体外抗胸膜肺炎放线杆菌Actinobacillus pleuropneumoniae活性.【方法】通过乙醇回流、水煎煮和超声波等方法对20种中药进行提取,采用二倍稀释法测定其对胸膜肺炎放线杆菌的体外抗菌活性;并研究抗菌活性较强的几味中药的体外联合抑菌活性.【结果和结论】乌梅、黄连Rhizoma coptidis、诃子Terminalia chebula、秦皮Cortex fraxini、地榆Sanguisorbae officinalis、虎杖Polygonum cuspidatum 6种中药提取物对胸膜肺炎放线杆菌的最小抑菌浓度(Minimal inhibitory concentration,MIC)范围是6.25~50.00 mg/mL;大青叶Isatis indigotica、茵陈Artemisia capillaris、甘草Glycyrrhiza uralensis和白鲜皮Dictamnus dasycarpus 4种中药提取物的MIC范围是50.00~100.00 mg/mL;黄柏Phellodendron amurense、杜仲Eucommia ulmoides、金银花Lonicera japonica、柴胡Bupleurum chinense、蒲公英Taraxacum mongolicum、板蓝根Baphicacanthus cusia、栀子Gardenia jasminoides和黄芪Astragalus membranaceus等10种中药提取物的MIC100.00 mg/mL.联合抑菌试验结果表明,乌梅、黄连、诃子和虎杖两两联合抑菌指数(FICI)≤1,乌梅、虎杖分别与秦皮的FICI2.乌梅、黄连、诃子、虎杖、秦皮、地榆对胸膜肺炎放线杆菌均具有较好的体外抗菌活性;乌梅、黄连、诃子和虎杖两两联合为相加、协同作用;秦皮分别与乌梅、虎杖为拮抗作用.     

干旱胁迫下不同品种小麦4种功能基因的表达模式及相关生理指标分析

采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)对干旱胁迫下脂质转移蛋白基因(TaLTP1)、膨胀素基因(TaEXPB23)、水通道蛋白基因(TaAQP7)和果聚糖6-果糖基转移酶基因(Ta6-SFT)在4种小麦叶片中的表达情况进行分析;通过测定相对水分质量分数和果聚糖质量分数来判断小麦生长发育状况。结果显示:干旱胁迫48h内,4种基因在不同抗旱性小麦叶片中的表达模式不同,干旱敏感型小麦中4种基因的相对表达量先上升后下降,恢复到正常水平;干旱耐受型小麦中4种基因的相对表达量先上升后下降,但仍维持较高表达水平;干旱耐受型小麦具有较高的相对水分质量分数和果聚糖累积量。以上结果表明,4种基因参与小麦干旱胁迫应答,4种基因的表达模式可以作为鉴定小麦抗旱的分子指标。本研究可为准确快速地鉴定小麦品种抗旱性提供重要分子依据。     

罗氏沼虾Doublesex基因的cDNA克隆及性别二态性表达分析

克隆了罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)含DM结构域的Dsx基因(MroDsx)部分序列,DM结构域包含5个保守的半胱氨酸(Cysteine)和2个组氨酸(Histidine), 且与中国对虾(Fenneropenaeus chinensis) Dsx基因DM结构域具有73%的相似性。荧光定量PCR(Quantitative real time PCR,qPCR)结果显示:MroDsx基因仅在性腺中特异性表达,且在精巢中的表达量显著高于卵巢;在精巢发育早期(主要是精原细胞)高表达,随着精巢的发育MroDsx基因的表达量逐渐降低。原位杂交(In situ hybridization,ISH)结果进一步显示:MroDsx转录本在精原细胞表达量高,在精母细胞以及精细胞中较弱,在成熟的精子中不表达,与荧光定量的结果一致。基于对MroDsx转录本的表达分析,推测MroDsx可能参与罗氏沼虾精巢的发育过程。     

新疆野生樱桃李PsoRPM2与PsoLFY互作调控植株开花的分子机制

为明确新疆野生樱桃李PsoRPM2基因引起植株的早开花现象，本研究通过形态学、转基因以及酵母双杂等试验对PsoRPM2基因进行了分析。结果显示:新疆野生樱桃李极早花、早花、中花、晚花和极晚花的比率分别为11%、24%、44%、18%和3%。早花类型的花芽分化明显快于晚花类型，早花花芽中的PsoLFY和PsoFT基因表达高于晚花，而PsoFLC基因则在晚花中表达较高。转PsoRPM2基因烟草表现为早花，并且NtLFY基因表达明显升高。在新疆野生樱桃李早花花芽中，PsoRPM2基因表达高于晚花，同一时期的PsoLFY基因表达也较高。酵母双杂试验显示，PsoRPM2与PsoLFY可以互作。综上，新疆野生樱桃李之所以早花是通过PsoRPM2与PsoLFY互作，提高花芽中PsoLFY和PsoFT基因表达，从而加快花芽分化进程，导致植株提前开花。