猪源戊型肝炎病毒ORF2蛋白生物信息学分析及真核表达研究

【目的】分析猪源戊型肝炎病毒(Swine hepatitis E virus, sHEV)4型ORF2蛋白的结构和功能,筛选具有保护性抗原的基因片段并表达蛋白,为研究其作为潜在保护性抗原提供候选蛋白。【方法】对sHEV 4型ORF2蛋白进行生物信息学分析,选取具有潜在保护性抗原蛋白的基因片段ORF2(128/140),通过PCR扩增、酶切后克隆至昆虫细胞表达载体,转染sf9细胞,通过Western blotting鉴定分析表达蛋白p128/p140。【结果】生物信息学分析显示,sHEV 4型ORF2蛋白存在2个稳定蛋白：p128和p140,分别含有496和476个氨基酸,二者皆为稳定蛋白,无跨膜区,蛋白二级结构主要以无规则卷曲为主。p128蛋白有11个T细胞表位、21个B细胞表位;p140蛋白有14个T细胞表位、18个B细胞表位。成功构建ORF2(128)、ORF2(140)2个基因的昆虫细胞表达载体,转染sf9细胞后经Western blotting检测发现,表达蛋白可被His标签单抗、sHEV抗体阳性血清识别。【结论】试验发现2个sHEV具有潜在保护性抗原的p128和p140蛋白,...     

基因4型HEV上海株ORF_2编码蛋白表达及其抗原性分析

为了表达基因4型戊型肝炎病毒(HEV)上海株ORF2编码蛋白并分析其抗原性,采用套式RT-PCR方法扩增上海猪基因4型HEV代表株结构蛋白基因ORF2部分片段,构建含有该基因片段的pET30a(+)重组表达质粒,命名为pET-E;将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21,经1mmol/L IPTG诱导得到表达,进行SDS-PAGE分析,然后用Western blot鉴定其抗原性,最后纯化蛋白。结果:SDS-PAGE证明该片段得到融合表达,分子量为33 ku。Western blot分析表明,重组蛋白可以与HEV阳性血清反应,表明该蛋白具有良好的抗原性;该融合蛋白含有组氨酸标签,可以用MagExtractor-His-tag-kit进行纯化。用纯化的重组蛋白作为包被抗原建立的间接ELISA检测89份猪血清样品,阳性率达80.4%,与已有的试剂盒检测结果相比,阳性符合率达95%。     

猪圆环病毒2型ORF3基因的原核表达

用原核表达系统表达猪圆环病毒2型ORF3基因,分析ORF3蛋白的抗原性。根据GenBank上公布的猪圆环病毒2型(PCV-2)核苷酸序列进行分析,针对ORF3基因设计并合成1对特异性引物,PCR扩增该基因,并将此片段克隆入原核表达载体pET-32a(+)上,命名为pET32a-ORF3,转化大肠杆菌Rosetta-blue(DE3) pLacⅠ感受态细胞,1.0 mmol/L IPTG 37 ℃诱导表达。结果表明,PCR扩增得到315 bp的片段,重组蛋白大小约为29 ku,与预期大小相符。Western blotting分析结果表明,重组蛋白能与抗His-tag的单克隆抗体反应,不与PCV-2阳性血清发生反应。猪圆环病毒2型ORF3基因能在大肠杆菌中成功表达,但与阳性血清之间没有反应原性,为进一步研究PCV-2 ORF3蛋白的功能及特性奠定基础。     

猪圆环病毒2型ORF3基因的原核表达

用原核表达系统表达猪圆环病毒2型ORF3基因,分析ORF3蛋白的抗原性。根据GenBank上公布的猪圆环病毒2型(PCV-2)核苷酸序列进行分析,针对ORF3基因设计并合成1对特异性引物,PCR扩增该基因,并将此片段克隆入原核表达载体pET-32a(+)上,命名为pET32a-ORF3,转化大肠杆菌Rosetta-blue(DE3)pLacⅠ感受态细胞,1.0mmol/L IPTG37℃诱导表达。结果表明,PCR扩增得到315bp的片段,重组蛋白大小约为29ku,与预期大小相符。Western blotting分析结果表明,重组蛋白能与抗His-tag的单克隆抗体反应,不与PCV-2阳性血清发生反应。猪圆环病毒2型ORF3基因能在大肠杆菌中成功表达,但与阳性血清之间没有反应原性,为进一步研究PCV-2ORF3蛋白的功能及特性奠定基础。     

猪戊型肝炎病毒swCH189株衣壳蛋白基因CP239片段的表达、纯化及抗原性分析

根据已克隆的戊型肝炎病毒株swCH189株结构蛋白基因（ORF2）的抗原性及水溶性分析,在其序列上设计套式引物,采用RT-PCR技术扩增猪戊型肝炎病毒（HEV）结构蛋白基因ORF2主要抗原基因片段,长度为728bp,将其克隆于PMD18-T载体,测序结果表明插入的片段属于猪戊型肝炎病毒结构蛋白基因ORF2部分;将该片段插入pet32a表达载体,经酶切、测序鉴定证实获得了带有目的基因的重组表达质粒。将重组质粒转化Rosetta菌,经0.3mmol/L IPTG诱导得到融合表达,得到相对分子质量为45 000的重组蛋白,以包涵体形式存在。Western blot分析表明,该蛋白可以与猪戊型肝炎阳性血清反应,表明该蛋白具有良好的反应原性。并用SDS电泳切胶纯化和透析浓缩方法进行纯化,用纯化的蛋白免疫兔子,经每2周免疫1次,连续3次免疫后,对免疫组和对照组,分别在45,60,90d采血,每只兔子采集1份。用夹心ELISA法测定免疫血清抗体,结果表明免疫组在45d后均产生具有HEV抗原结合活性的抗体。本试验对猪swCH189株CP239基因的克隆和表达研究,为进一步研究结构蛋白基因ORF2的生物学功能奠定了基础。     

猪圆环病毒2型Cap蛋白的截短表达与活性检测

本研究参照已发表的PCV2基因组序列,设计合成1对特异性引物,以PCV2基因组DNA为模板,PCR扩增了长约480 bp的ORF2基因片段。将目的片段定向克隆到pGEX-6p-1原核表达载体,酶切及测序鉴定正确后,转化BL21(DE3)表达菌,经IPTG诱导得到了以包涵体形式表达的重组蛋白。采用亲和层析法在变性的条件下纯化重组蛋白,纯化的重组蛋白浓度为0.396 mg/mL。纯化蛋白经免疫印迹、间接ELISA检测证明具有良好的抗原性和特异性。     

猪2型圆环病毒辽宁分离株ORF2基因真核表达载体的构建及鉴定

PCV2基因片段ORF2编码病毒衣壳蛋白,是主要的免疫原蛋白,并且基因序列比较保守,是构建核酸疫苗的首选基因片段.本试验构建真核表达载体pIRES-ORF2,并转染Hela细胞,进行了间接免疫荧光试验.结果表明,在荧光显微镜下可以看到转有pIRES-ORF2质粒的细胞玻片上有明显的黄绿色荧光.     

猪戊型肝炎病毒结构蛋白片段的表达及其在ELISA中的初步应用

为建立一种快速的猪戊型肝炎病毒抗体检测方法，根据已克隆的戊型肝炎病毒株DQ1结构蛋白基因（ORF2）的抗原性及水溶性分析，在其序列上设计一对引物，上游引物和下游引物分别带有BamHⅠ、HindⅢ酶切位点，用PCR方法扩增，获得369bp大小的相应片段，位于ORF2128—497bp处。将扩增片段克隆到pET-32a构建了原核表达载体pET32a—D001，经测序证明该片段正确插入。将pET32a—D001转化BL21并诱导表达，SDS-PAGE结果显示表达蛋白大小为33ku，Western-blot结果表明表达的蛋白质具有生物活性，将表达蛋白作为诊断抗原，对反应条件进行优化，初步建立了ELISA诊断方法。     

猪圆环病毒2型ORF1基因的克隆与原核表达

为了给猪圆环病毒病的诊断及防制提供科学依据,试验参考GenBank中猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2) ORF1基因序列,设计1对特异性引物,进行ORF1基因的PCR扩增,扩增出PCV2贵州株ORF1基因片段。扩增产物与pMD18-T载体连接、鉴定正确后,再亚克隆至pET-30a(+)原核表达载体中,经双酶切鉴定后测序。结果表明,ORF1基因在pET-30a(+)载体中位置正确,pET30a-PCV2-ORF1原核表达质粒构建成功,转化至Rosetta菌,用IPTG进行诱导表达,收集菌液进行SDS-PAGE检测,结果显示PCV2-ORF1在pET-30a(+)中获得了高效融合表达,其表达蛋白分子质量约为42 ku。重组蛋白主要以包涵体的形式表达,包涵体洗涤溶解后,采用Ni²⁺离子金属螯合亲和层析柱纯化蛋白,Western blotting分析结果表明,表达蛋白能和抗His标签的单克隆抗体反应。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒M蛋白和SEA共表达核酸疫的构建及鉴定

构建猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）M蛋白和金黄色葡萄球菌肠毒素A（SEA）共表达的核酸疫苗,并研究其表达产物的抗原性。将采自长春患PRRS病猪的组织剪碎充分研磨,提取病毒RNA后,用RT-PCR的方法特异性扩增PRRSV长春株的ORF6基因（M蛋白）片段。将该片段定向插入到载体pKS-SEA上,双酶切获得片段SEA-ORF6,再将其克隆到真核表达载体pVAXI中,构建重组质粒pVAXI-SEA-ORF6,转化大肠杆菌。经酶切鉴定后,将构建的阳性重组质粒在BHK细胞中表达。通过间接免疫荧光方法初步检测所表达蛋白的抗原性,用Western blot分析表达蛋白的特异性。结果表明,所构建的重组质粒pVAXI-SEA-ORF6在BHK细胞中得到了表达,为进一步研究PRRSV基因工程疫苗奠定了基础。     

猪圆环病毒Ⅱ型ORF2基因在酵母中的表达

为探索猪圆环病毒Ⅱ型(PCVⅡ) ORF2基因的高效表达,将ORF2基因整合到酵母表达载体pPICZαC中,构建重组质粒pPICZαC-ORF2,通过SacⅠ酶切线性化,经电穿孔法转到毕赤酵母菌SMD1168。经Zeocin^TM抗性筛选得到转化子,通过SDS-PAGE分析和Western blotting鉴定,结果表明衣壳蛋白在酵母菌中成功分泌表达。     

猪圆环病毒2型ORF2基因重组植物乳杆菌的构建及其免疫原性分析

为研制一种能有效控制猪圆环病毒2型（porcine circovirus type 2,PCV2）的新型疫苗,本试验将PCV2的ORF2基因克隆至植物乳杆菌表达载体pSCPSP超强启动子SCP的下游,构建重组表达质粒pSCPSP-Cap,用电击转化法转化克隆至表达宿主菌植物乳杆菌,获得一株重组植物乳杆菌。以SDS-PAGE和Western blotting法检测24 h上清液中表达的蛋白;将8周龄的SPF级BALB/c小鼠随机分组,每组8只,分别设置对照组、空载体组、灌胃组、饮水组、灭活疫苗组,试验14、28、42和56 d后对小鼠采血,分离血清,利用PCV2 ELISA抗体检测试剂盒检测小鼠血清中PCV2的抗体水平。SDS-PAGE、Western blotting结果显示,PCV2衣壳蛋白在植物乳杆菌中成功分泌表达,表达的蛋白分子质量为28 ku,且具有良好的反应原性,重组植物乳杆菌免疫小鼠诱导机体产生PCV2特异性抗体显著高于其他组（P<0.05）。结果表明,PCV2的ORF2基因在植物乳杆菌中成功表达,且具有良好的生物活性,可为PCV2口服疫苗的开发研究提供理论参考。     

Construction and Immunogenicity Analysis of Recombinant Lactobacillus plantarum Expressing ORF2 Gene of Porcine Circovirus Type 2

To develop an effective vaccine against porcine circovirus type 2 (PCV2), ORF2 gene was cloned into a Lactobacillus plantarum (L.plantarum) pSCPSP under the control of a SCP promoter to construct recombinant plasmid pSCPSP-Cap that was transformed into LP1 by electroporation. Extracellular expression of the Cap protein was confirmed by SDS-PAGE and Western blotting analysis. Afterwards, 8-week-old SPF BALB/c mice were randomly divided into control group, carrier group, lavage group, group of drinking water and inactived vaccine group. After 14,28,42 and 56 d, mice serums were collected to evaluate the level of specific antibody by SDS-PAGE and Western blotting. Eventually, SDS-PAGE and Western blotting results indicated that the Cap protein of PCV2 could be efficiently expressed in L. plantarum, expression of protein molecular weight was 28 ku and with good immunogenicity. In addition, higher levels of specific antibody in the serum of mice was observed by oral administration with L. plantarum expressing the PCV2 Cap antigen (P<0.05). In conclusion, the ORF2 gene of PCV2 could be successfully expressed in recombinant L. plantarum and expressed protein with good biological activity, which would lay the foundation for the development of PCV2 oral vaccination.     

羊口疮病毒ORF129基因的原核表达、纯化及鉴定

试验旨在克隆羊口疮病毒ORF129基因，并对其编码蛋白进行表达及纯化。参照GenBank已发表羊口疮病毒OV-IA82株ORF129基因序列（登录号：AY386263.1），用Primer Premier 5.0软件设计合成1对特异性引物，利用PCR方法扩增ORF129全基因序列，将其与质粒pET-28a （+）经BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切后连接，构建重组质粒pET-28a （+）-ORF129。重组质粒经双酶切和测序鉴定后转化大肠杆菌Rosttta感受态细胞，利用IPTG诱导ORF129基因的表达，经SDS-PAGE分析后，将表达产物超声破碎、洗涤、溶解，然后采用尿素梯度透析方法进行复性，经亲和层析法纯化目的蛋白并通过Western blotting对其进行鉴定。双酶切鉴定和测序结果表明，本试验成功构建了重组质粒，读码框正确，菌液起始D_{600 nm}值为0.4~0.8，37℃、220 r/min、1 mmol/L IPTG诱导3 h时能得到ORF129包涵体蛋白，蛋白大小为58 ku，在加入精氨酸、甘油的复性液中，蛋白复性率较高，将复性后蛋白与Ni柱结合，在咪唑浓度为500 mmol/L时，能将蛋白洗脱，纯化的蛋白经Western blotting鉴定正确，证明蛋白成功表达。本研究成功构建了羊口疮病毒ORF129基因原核表达重组质粒，并成功表达和纯化了ORF129蛋白，为后续羊口疮病毒检测方法的建立奠定基础。     

1型鹅星状病毒ORF2蛋白原核表达及其多克隆抗体的制备与鉴定

[目的] 利用原核表达系统表达1型鹅星状病毒（Goose astrovirus 1,GAstV-1）结构蛋白ORF2,并制备其多克隆抗体。[方法] 根据GAstV-1 TZ03株基因序列,对ORF2基因序列进行大肠杆菌密码子偏爱性优化和合成,将其克隆至原核表达载体pET-30a（+）,构建重组质粒pET-ORF2,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,IPTG诱导表达重组蛋白,通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定重组蛋白;将鉴定正确的重组蛋白纯化后免疫家兔制备多克隆抗体,以间接免疫荧光试验鉴定多克隆抗体的特异性。[结果] 酶切和测序结果显示,成功获得重组质粒pET-ORF2;SDS-PAGE结果显示,表达的重组蛋白分子质量约为70 ku,主要以包涵体形式存在;Western blotting结果表明,该蛋白能与抗His标签鼠单克隆抗体发生特异性反应。间接ELISA检测制备的兔抗ORF2蛋白多克隆抗体效价达1：128 000;间接免疫荧光试验结果显示,制备的多克隆抗体能与GAstV-1发生特异性反应。[结论] 原核表达的GAstV-1 ORF2重组蛋白具有良好的免疫原性,制备的兔源多克隆抗体具有较高的效价和特异性,为研制GAstV-1相关诊断试剂奠定了基础。     

猪圆环病毒2型DY株ORF2基因在Sf9昆虫细胞中的表达

本试验采用PCR方法扩增出完整的PCV2 ORF2基因,并将其克隆到Bac-to-Bac杆状病毒表达系统的转移载体pFastBac1^TM中,获得重组转移载体pFast-ORF2,再将其转化DH10Bac感受态细胞,发生转座反应,通过抗性及蓝白斑筛选获得含有ORF2基因的重组杆粒,通过Cellfectin转染试剂介导将重组杆粒DNA转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒。用该重组杆状病毒感染Sf9昆虫细胞,并通过间接免疫荧光法和Western blotting检测目的蛋白的表达。结果表明,ORF2基因在昆虫细胞中获得表达,表达的蛋白质可被PCV2阳性血清识别,这为进一步研究PCV2亚单位疫苗及诊断抗原奠定了基础。     

V5标记的猪圆环病毒2型Cap蛋白重组杆状病毒表达载体的构建

试验旨在利用真核表达系统构建V5标记的猪圆环病毒2型（PCV2） Cap蛋白的表达载体。采用基因工程技术将V5标签引入到PCV2 ORF2基因C末端,并将标记基因定向克隆入pFastBacHTA载体,将pFastBacHTA-ORF2-V5重组转移载体转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,使用脂质体介导法将鉴定后的重组杆状病毒质粒转染于Sf9细胞中;运用间接免疫荧光试验（IFA）、SDS-PAGE和Western blotting试验对Sf9细胞中V5标记Cap蛋白的表达进行验证。结果显示,本试验成功将V5标签引入到PCV2 ORF2基因末端,pFastBacHTA-ORF2-V5重组转移载体转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞后获得了Bacmid-ORF2-V5重组杆状病毒质粒;IFA、SDS-PAGE和Western blotting试验结果显示,在Sf9细胞中能检测到重组杆状病毒V5标记的PCV2 Cap蛋白,具有良好的反应原性,说明本试验成功获得一株rAcMNPV Cap-V5重组杆状病毒。试验结果为PCV2标记亚单位疫苗的研制提供一定的理论依据。     

羊口疮病毒ORF059基因的真核表达研究

试验旨在扩增羊口疮病毒（Orf virus,ORFV）ORF059基因并进行真核表达。提取羊ORFV HCE弱毒株基因组为模板,参照GenBank上ORF059的基因序列,利用DNAMAN设计引物,应用PCR扩增ORF059目的片段,凝胶回收后将其连入pEGFP-N1质粒,构建重组质粒pEGFP-ORF059-N1,测序正确后瞬时转染NIH3T3细胞,应用荧光显微镜观察,Western blotting鉴定融合蛋白的表达。结果表明,ORF059基因片段大小为1 005 bp;重组质粒pEGFP-ORF059-N1构建正确;转染pEGFP-ORF059-N1的NIH3T3细胞有明显的绿色荧光;表达的融合蛋白大小约为64 ku。本试验结果为进一步研究ORF059的作用机理奠定了基础。     

Study on Eukaryotic Expression of ORF059 Gene of Orf Virus

The study was aimed to clonie and express ORF059 gene of Orf virus (ORFV).The genome of ORFV HCE attenuated vaccine strain was extracted and used as the template.Based on the referenced gene sequences of ORF059 gene on GenBank,the specific primers were designed,the fragment of ORF059 gene was amplified by PCR.After being purified,ORF059 gene was inserted into pEGFP-N1 vector to construct recombinant plasmid pEGFP-ORF059-N1.After being sequenced,the recombinant plasmid pEGFP-ORF059-N1 was transfected into NIH3T3 cells with liposomes.The expression of fusion protein was identified by the fluorescence microscope observation and Western blotting.The results showed that the ORF059 gene was 1 005 bp.The recombinant plasmid pEGFP-ORF059-N1 was constructed correctly.Green fluorescence could be observed in NIH3T3 cells transfected by pEGFP-ORF059-N1 under the fluorescence microscope.The expressed fusion protein was about 64 ku.The results laid a foundation for the further research on the mechanism of ORF059.     

猪圆环病毒2型ORF2与T细胞表位基因重组腺病毒表达载体的构建及鉴定

利用腺病毒表达系统表达猪圆环病毒2型（porcine circovirus type 2,PCV2）的ORF2基因与T细胞表位（T cell epitope,TCE）基因,表达的融合蛋白具有反应原性,为研制PCV2新型疫苗奠定基础。以pMD18-T-ORF2、pMD18-T-TCE为模板,采用PCR方法扩增目的基因ORF2和TCE,以多肽接头（Gly₄Ser）₃为连接子,运用重叠延伸PCR技术将2段基因通过连接子（Gly₄Ser）₃进行融合连接。将融合基因定向克隆至腺病毒转移载体pShuttle-CMV构建重组质粒pShuttle-CMV-ORF2-TCE,将该重组质粒用PmeⅠ酶线性化后电转化大肠杆菌BJ5183感受态细胞（内含pAdEasy-1骨架质粒）进行同源重组获得重组腺病毒质粒pAd-ORF2-TCE。PacⅠ酶线性化pAd-ORF2-TCE质粒后转染AD293细胞包装病毒,重组腺病毒经3轮噬斑纯化后获得重组腺病毒rAd-ORF2-TCE,病毒滴度为10^12.3 TCID₅₀/mL。Western blotting及间接免疫荧光试验（indirect immunofluorecent assay,IFA）结果表明融合蛋白得到正确表达。