H1N1亚型猪流感病毒反向遗传操作系统的建立及高产细胞型疫苗株的拯救

[目的]建立H1N1亚型猪流感病毒反向遗传学操作系统及拯救出能够在动物传代细胞中高水平复制的H1N1亚型猪流感疫苗株.[方法]利用反向遗传操作技术,对猪流感病毒广东分离株进行拯救.[结果]首次成功拯救出全部片段均来自于亲本株的猪流感病毒rH1N1,并且成功拯救出了具有高度细胞适应性毒株re-LM株,研究结果表明二者均具有良好的遗传稳定性.rH1N1经MDCK细胞连续传代培养后,血凝价最高仅为1:64;而re-LM的血凝价最高可以稳定在1:1024,表明该毒株具有细胞繁殖高产的特性.用该重组病毒制备油乳剂灭活苗免疫2月龄仔猪,首免2周即可检测出HI抗体,平均效价在1:32以上,三免后2周H1抗体平均效价达到1:512,说明其有良好的免疫原性. [结论]H1N1亚型猪流感病毒反向遗传操作系统的成功建立为猪流感病毒致病机理、传播机制及病毒基因功能的研究奠定了基础;重组细胞高产型猪流感病毒株的拯救为H1N1亚型猪流感疫苗的研制开辟了新的途径.     

3株H1N1亚型猪流感病毒的HA基因遗传信息及抗原特异性分析

【目的】分析3株属于欧亚类禽(SWSS1)、经典(SWL6)与Pdm09H1N1(Pdm091057)分支的猪流感病毒的HA基因遗传信息及抗原的特异性,为HA基因抗原表位的功能研究及流感防控奠定基础。【方法】以SWSS1株、SWL6株和Pdm091057株流感病毒为材料,比较分析3株H1N1亚型HA基因片段的遗传信息,制备全病毒灭活疫苗,各免疫3只雌性新西兰大白兔,采用血凝抑制(Hemagglutination inhibition,HI)反应试验检测抗体滴度。【结果】3株病毒的HA基因片段的氨基酸序列相似性为69.4%~89.1%,各分支的HA基因的抗原表位存在差异;3株病毒经过2次免疫后平均HI抗体滴度均能达1 280以上,且SWSS1的平均HI抗体滴度高达2 560。同时SWSS1与SWL6、Pdm091057这2株病毒均无血清学交叉反应,而SWL6与Pdm091057有较低的血清学交叉反应。【结论】3株猪流感病毒的HA基因片段抗原表位存在着差异,可能是3毒株之间血清学交叉反应较低的原因。3株病毒免疫原性均较好,可作为候选疫苗株。     

悬浮MDCK细胞的驯化与H5亚型禽流感病毒的培养

【目的】为评估细胞源重组禽流感病毒H5亚型灭活疫苗的有效性提供数据支持。【方法】选取一株来源清楚的贴壁MDCK细胞,通过逐步降低培养基中血清含量及不断调整无血清培养基配方,将其驯化为悬浮MDCK细胞,并以此为基质增殖重组禽流感病毒H5N1 Re-6株、H5N1 Re-7株和H5N1 Re-8株;比较不同毒株在贴壁和悬浮MDCK细胞中增殖的差异。分别将经悬浮MDCK细胞增殖的病毒与经SPF鸡胚增殖的病毒制备成重组禽流感病毒(H5亚型)三价灭活疫苗,免疫商品蛋鸡和商品鸭,通过血清学方法比较细胞源与鸡胚源禽流感灭活疫苗的免疫效果。海兰褐商品蛋鸡:6 050只,分为3组,2组为免疫组,每组3 000只,28日龄免疫0.5 mL/只,80日龄免疫0.5 mL/只;不免疫对照组1组,50只,同等条件下隔离饲养。分别于蛋鸡日龄49、110、210 d(即首免后21 d、82 d、6个月)时采血分离血清,测定禽流感H5亚型Re-6株、Re-7株、Re-8株的HI抗体效价,监测抗体消长。长白飞鸭:220只,分为3组,2组为免疫组,每组100只,10日龄免疫0.5 mL/只,24日龄免疫1.0 mL/只,不免疫对照组20只,同等条件下隔离饲养。分别于鸭日龄24、38、52 d(即首免后14、28、42 d)时采血分离血清,测定禽流感H5亚型Re-6株、Re-7株、Re-8株的HI抗体效价,监测抗体消长。【结果】获得一株可在无血清培养基中悬浮生长的MDCK细胞,摇瓶、5L生物反应器中的培养数据及细胞状态显示,该细胞株适合放大生产。此悬浮MDCK细胞培养48 h细胞密度可由1.5×10~6 cells/mL左右增殖到1.0×10~7 cells/mL左右,状态良好、活率高、单个悬浮于培养基中。以此悬浮MDCK细胞为基质增殖重组禽流感病毒,H5N1 Re-6株的HA效价达1﹕512,TCID_(50) 10~(7.67)/mL,EID_(50) 10~(7.83)/0.1 mL;H5N1 Re-7株的HA效价达1﹕256,TCID_(50)达10~(7.33)/mL,EID_(50)10~(7.17)/0.1 mL;H5N1 Re-8株的HA效价达1﹕1024,TCID_(50) 10~(8.5)/mL,EID_(50) 10~(8.38)/0.1 mL,与经贴壁MDCK细胞增殖的病毒毒价相当。细胞源三价灭活疫苗免疫海兰褐商品蛋鸡,首免后21 d时,禽流感H5亚型Re-6株、Re-7株、Re-8株HI抗体效价几何平均值(GMT)分别为1﹕446、1﹕111、1﹕416,二免后30 d时三者HI抗体效价几何平均值(GMT)分别为1﹕588、1﹕362、1﹕776,6个月时分别为1﹕239、1﹕128、1﹕223,维持了较高的抗体水平;免疫长白飞鸭,首免后14 d时,禽流感H5亚型Re-6株、Re-7株、Re-8株HI抗体效价几何平均值(GMT)分别为1﹕30、1﹕17、1﹕64,28 d时三者HI抗体效价几何平均值(GMT)分别为1﹕194、1﹕91、1﹕137,42 d时分别为1﹕416、1﹕128、1﹕239;以上两组的试验结果与鸡胚源重组禽流感灭活疫苗免疫后诱导产生的HI抗体效价相当。【结论】经驯化获得的可在无血清培养基中悬浮生长的MDCK细胞株,其增殖重组禽流感病毒H5N1 Re-6株、H5N1 Re-7株、H5N1 Re-8株能力强,且病毒被制备成灭活疫苗免疫海兰褐商品蛋鸡和长白飞鸭可产生较高水平的抗体。为大规模工业化生产禽流感疫苗提供技术支持。     

广西猪流感病毒H1N2亚型的血清学调查

【目的】了解广西猪群中猪流感（SI）的流行情况,为科学防控广西SI提供参考依据。【方法】以猪流感病毒（SIV）H1N2亚型毒株为抗原,采用微量血凝抑制试验（HI）方法,对2009年7月~2011年3月在广西12个市采集的997份猪血清进行SIV的血清学调查。【结果】2009年的H1N2亚型抗体阳性率为33.4%,比2010年和2011年1～3月的高;广西各市的H1N2亚型抗体阳性率为0~83.1%,其中河池和百色两市的H1N2亚型抗体阳性率较高,分别为83.1%和51.1%,崇左市为零,其他市的H1N2亚型抗体阳性为4.0%~32.1%。【结论】广西地区猪群在2009～2011年均受到猪源H1N2亚型不同程度的感染。     

广西H9N2亚型禽流感病毒疫苗候选株的筛选

【目的】筛选出免疫原性更优的H9N2亚型禽流感病毒（AIV）疫苗候选株用于新型疫苗研发,为加强对H9N2亚型AIV的防控提供技术支持。【方法】以2000—2020年广西地区分离获得的36株H9N2亚型AIV分离株为试验材料,依据HA基因遗传进化分析选择12株不同年份、不同地域及不同宿主来源的H9N2亚型AIV代表株,与目前使用的商品化H9亚型AIV疫苗株（SS株）进行交叉血凝抑制试验（HI）及抗原性分析,根据抗原分析结果选择其中具有不同抗原差异的代表株制备油乳剂灭活疫苗,并分别与商品化H9亚型AIV疫苗（SS株）进行交叉免疫保护试验。【结果】在36株H9N2亚型AIV广西分离株中有31株属于Y280-Like(9.4.1),其中26株属于分支I、5株属于分支II,另外5株属于G1-Like(h9.4.1),与我国常用疫苗株分属于不同进化分支。12株H9N2亚型AIV广西代表性分离株灭活后的HA效价≥7 log2,病毒灭活效果良好,可用于制备油乳剂灭活疫苗,且制备的油乳剂灭活疫苗稳定性和安全性良好。根据交互HI抗体滴度计算出各毒株间的抗原相关值（R）,结果发现A/chicken/Guan...     

H3N2亚型SIV血凝蛋白单克隆抗体的制备

【目的】制备H3N2亚型猪流感病毒(SIV)的单克隆抗体,为SIV的鉴别诊断奠定基础。【方法】将A/swine/Henan/1/2010(H3N2)猪流感病毒初步浓缩后,免疫6周龄的BALB/c小鼠,取小鼠脾细胞与瘤细胞NS0融合,采用间接ELISA方法筛选杂交瘤细胞,对杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体进行Western blot检验和抗原结合活性检测。【结果】经过3次有限稀释法克隆纯化,最终得到1株能稳定分泌单克隆抗体的阳性细胞株,命名为1C10,经检测其腹水抗体效价为1∶51 200。单克隆抗体亚型鉴定结果表明,1C10为IgG1亚型,轻链类型为κ链。Western blot检测结果表明,这株单克隆抗体能与H3N2特异性结合,而且能特异性识别血凝素蛋白(HA),而不与H1N1亚型猪流感病毒、伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、猪细小病毒发生交叉反应。【结论】制备获得1株抗猪流感H3N2病毒HA蛋白的单克隆抗体,可用于猪流感病毒鉴别诊断方法的建立。     

广西猪流感病毒H1N2亚型的血清学调查

【目的】了解广西猪群中猪流感（SI）的流行情况,为科学防控广西SI提供参考依据。【方法】以猪流感病毒（SIV）HIN2亚型毒株为抗原,采用微量血凝抑制试验（HI）方法,对2009年7月～2011年3月在广西12个市采集的997份猪血清进行SIV的血清学调查。【结果】2009年的H1N2亚型抗体阳性率为33．4％,比2010年和2011年1-3月的高;广西各市的H1N2亚型抗体阳性率为0—83．1％,其中河池和百色两市的H1N2亚型抗体阳性率较高,分别为83．1％和51．1％,崇左市为零,其他市的H1N2亚型抗体阳性为4．0％～32．1％。【结论】广西地区猪群在2009～2011年均受到猪源H1N2亚型不同程度的感染。     

不同疫苗接种对鸡免疫学功能的影响试验

为验证不同疫苗免疫对鸡免疫学功能的影响,采用两批市售的鸡新城疫-传染性支气管炎-禽流感（H9亚型）三联灭活疫苗注射14日龄鸡,同时按0.3 mL·只-1注射重组禽流感病毒H5亚型二价灭活疫苗（细胞源,Re-6株+Re-8株）,并同时设单独注射重组禽流感病毒H5亚型二价灭活疫苗（细胞源,Re-6株+Re-8株）组和健康对照组,每组鸡各10只,分别于疫苗注射后14、21和28 d,对各组鸡采血,分离血清,进行H5亚型禽流感HI抗体效价测定。结果表明：注射后14、21和28 d,第1组（新支流三联180010900批）组鸡血清中H5亚型禽流感HI抗体效价分别为1:68.6、1:207.9和1:415.6,第2组（新支流三联180020900批）组鸡血清中H5亚型禽流感HI抗体效价分别为1:68.6、1:207.9和1:445.7;第三组单独注射重组禽流感病毒H5亚型二价灭活疫苗（细胞源,Re-6株+Re-8株）组鸡血清中H5亚型禽流感抗体效价分别为1:64.0、1:194.0和1:388.0,健康对照组鸡血清中H5亚型禽流感HI抗体效价均不高于1:24.3。说明接种2种疫苗试验鸡血清H5亚型...     

H5N1亚型高致病性禽流感病毒A/goose/Guangdong/1/96株反向基因操作系统的建立

 A/goose/Guangdong/1/96（GSGD/1/96）是中国分离的第1株H5N1亚型禽流感病毒，它不仅是97香港感染并致人死亡的H5N1亚型流感病毒HA基因供体株，而且是中国目前已报到的H5亚型流感病毒分离株的共同祖先。本研究建立了该病毒的8质粒反向基因操作系统，并通过细胞转染成功拯救了该病毒（R-GSGD/1/96）。R-GSGD/1/96在对SPF鸡和 Balb/c小鼠的致病性方面保持了与亲本野毒(W-GSGD/1/96)一致的生物学特性，即对鸡都是高致病性毒株，R-GSGD/1/96与W-GSGD/1/96的静脉致病指数分别为2.01和2.10；救获病毒与野生病毒一样，尽管106EID50经鼻腔感染小鼠后1～2 d内能从肺脏检测到低滴度的病毒，但不能在小鼠体内成功复制。GSGD/1/96反向基因操作系统的成功建立为进一步开展中国高致病性禽流感病毒分离株的生物学特性、遗传衍化及结构与其功能关系研究奠定了基础。     

H3N2亚型犬流感病毒实验感染模型的建立

【目的】建立H3N2亚型犬流感病毒(canine influenza virus,CIV)实验感染模型，了解犬流感的发病特征，为疫苗效力评价奠定基础。【方法】6—13月龄CIV血凝抑制(haemagglutination inhibition,HI)抗体阴性(HI<1:10)比格犬26只，其中3只鼻腔喷雾PBS作为阴性对照，另23只分5组(10、10³、10⁵、10⁶、10⁷ EID₅₀/只)，分别为3、5、5、5、5只/组，每只犬各鼻腔喷雾H3N2亚型CIV(A/canine/China/Huabei-170607/2017(H3N2)，简称HB株)病毒液1mL。观察临床症状、肺脏病变和肺脏组织病理学变化，计算肺实变率，检测病毒和HI抗体效价。【结果】10 EID₅₀剂量感染组，3只犬均未出现明显临床症状，肺脏均无明显眼观病变，肺脏实变率0%，无组织病理学变化，病毒检测均为阴性，HI抗体效价几何平均值(geometric mean titer,GM...     

重组禽流感病毒H7N9 H7-Re1株培养条件的优化

【背景】高致病性禽流感疫情的暴发造成了巨大的经济损失和环境卫生的破坏,现阶段疫苗接种仍是我国控制禽流感的主要措施之一,需要大量安全、高效和低成本的禽流感病毒疫苗。鸡胚法制备禽流感病毒疫苗的工艺存在原料来源受限、过程复杂、个体差异、培养周期长和不易放大培养等缺陷。而利用生物反应器大规模培养动物细胞生产病毒疫苗,不仅可以大幅度提高单位产量,实现高密度细胞和高病毒产率,同时可保证产品质量。目前我国用于禽流感防控的疫苗为重组禽流感病毒(H5+H7)二价灭活疫苗(H5N1 Re-8株+H7N9 H7-Re1株)。国内细胞全悬浮工艺生产禽流感灭活疫苗单罐产能最大为6 000 L,高病毒含量抗原的提供是生产高效疫苗的主要影响因素之一。【目的】为了能够提供稳定的、高效的生产抗原,开展种毒驯化试验。【方法】将重组禽流感病毒H7N9 H7-Re1株分别在MDCK细胞及悬浮MDCK细胞上增殖。在MDCK细胞上通过不同的病毒接种剂量、不同收获时间、不同TPCK-胰酶浓度的试验,确定了H7N9 H7-Re1株在MDCK细胞上最佳收获时间为64 h,最佳接毒剂量为0.008%或MOI为10~(-4),最佳TPCK-胰酶浓度为2μg·mL~(-1),根据确定的最佳培养条件连续传代,并对各代次病毒含量进行检测。【结果】在MDCK细胞上传至第5代时,HA可达1﹕256,每1 mL病毒含量达到10~(8.5)TCID50,每0.1 mL病毒含量达到10~(8.5)EID50,均高于其他代次。【结论】将第5代确定为MDCK细胞传代最佳代次,可考虑确定为生产用基础种毒代次。在悬浮MDCK细胞上对重组禽流感病毒传代进行了优化试验,确定了H7N9 H7-Re1株在悬浮MDCK细胞上最佳收获时间为48 h,最佳接毒剂量MOI为10~(-2),最佳TPCK-胰酶浓度为4—8μg·mL~(-1)。在实际疫苗生产过程中,可选择MDCK细胞或悬浮MDCK细胞来扩繁种毒。     

猪流感病毒H1N2亚型油乳剂灭活苗的免疫效果

【目的】评估以H1N2亚型猪流感病毒（SIV）制成油乳剂灭活苗的免疫效果,为预防SIV的发生和蔓延提供参考依据。【方法】采用不同剂量的SIV H1H2亚型油乳剂灭活苗对猪只进行免疫,免疫后采血,用HI试验测定抗体效价,连续测定至第10周,然后对猪只进行攻毒,并观察其临床症状及进行病毒检测等。【结果】中免疫剂量组（4 mL/头）和高免疫剂量组（6 mL/头）的抗体滴度高于低免疫剂量组（2 mL/头）;免疫组与对照组在攻毒后猪只的体温无显著差异（P >0.05）,免疫组攻毒后无明显的临床症状,除中免疫剂量组在攻毒后第1 d检测出鼻粘液病毒外,其他时间及其他剂量组均未检测到SIV,对猪只起到良好的保护作用。【结论】SIV H1N2亚型油乳剂灭活苗具有良好的免疫效果,对同亚型病毒的攻击具有一定保护作用,其最佳免疫剂量为4 mL/头。     

一株H1N1猪流感病毒的进化分析与分子特征

【目的】了解猪流感病毒的分子流行病学,为动物流感的防控提供科学依据。【方法】将猪的鼻拭子接种鸡胚进行病毒分离,对血凝试验阳性的样品在SPF鸡胚上进一步纯化、增殖,采用RT-PCR对分离毒株的全基因组进行扩增,使用Applied Biosystems 3500xL Genetic Analyzer进行序列测定,利用DNASTAR软件对测序基因片段进行整个阅读框的核苷酸序列同源性比对分析,并用 MEGA 6.0绘制遗传进化树及分析氨基酸位点。【结果】分离毒株A/swine/Zhejiang/245/2013（SW/ZJ/245/13）为H1N1亚型病毒,核苷酸的分析结果发现该分离毒株的8个基因片段均与中国近期分离的H1N1亚型流感病毒高度同源,属于类禽型猪H1N1的进化分支,没有出现不同基因型流感病毒片段之间的重组。分离株HA蛋白的裂解位点序列为IPSIQSR↓G,具有典型低致病力流感病毒的分子特征;HA蛋白5个抗原位点区域与其同源性最高毒株完全一致,表明抗原性未发生改变;HA蛋白受体结合位点中190 D以及225 E,表明SW/ZJ/245/13与SA-α-2,6-Gal受体有较强的结合能力,而SA-α-2,6-Gal受体普遍存在于哺乳动物宿主（猪和人）上呼吸道中;HA共有6个潜在糖基化位点,其中4个（N27、N40、N212和N291）位于HAl区,2个（N498和N557）位于HA2区;NA有7个潜在糖基化位点,其中4个（N50、N58、N63和N68）在链接区,其他3个（N88、N146和N235）在结构域;PB2蛋白具有271T、627E和701N的氨基酸组合;M2蛋白发生抗药位点S31N的突变。【结论】 类禽型H1N1猪流感病毒的持续存在和不断变异,提示应加强猪流感的监测,为动物流感的防控提供重要的科学依据。     

表达载体pCAGGS显著增强禽流感DNA疫苗的免疫保护效果

【目的】将A/Goose/GuangDong/1/96(H5N1)[GD/1/96(H5N1)]的HA基因插入鸡β-actin启动子高效真核表达载体pCAGGS，构建了DNA疫苗质粒pCAGGHA5，以提高H5亚型禽流感DNA疫苗的表达水平和免疫保护效果。【方法】将pCAGGHA5和表达GD/1/96(H5N1)HA基因的质粒pCIHA5通过间接免疫荧光法和Western-blot分析检测转染293T细胞后瞬时表达的HA抗原蛋白，随之将pCAGGHA5及pCIHA5分别以100 ?g和10 ?g剂量一次免疫3周龄SPF鸡，4周后用100 LD50的HPAIV GD/1/96(H5N1)鼻腔途径进行攻击。【结果】间接免疫荧光法和Western-blot分析表明2种表达质粒均可正确表达H5亚型HA抗原蛋白，载体pCAGGS表达水平显著高于载体pCI；免疫SPF鸡后，100?g pCAGGHA5可形成5/5的免疫保护，100?g pCIHA5可形成2/4的免疫保护，10?g pCAGGHA5可形成对免疫鸡5/5的免疫保护，而10?g pCIHA5 则基本不能形成免疫保护，pCAGGHA5诱导的HI抗体水平远远高于pCIHA5。【结论】鸡β-actin启动子表达载体pCAGGS可显著提高HA基因体外表达水平和H5亚型禽流感DNA疫苗诱导的保护性抗体免疫反应水平，增强免疫保护效果。     

胰蛋白酶浓度对H9亚型禽流感病毒在MDCK细胞上增殖的影响

[目的]探讨不同胰蛋白酶浓度对低致病力禽流感病毒在MDCK细胞上增殖后的HA滴度。[方法]通过3株禽流感H9亚型病毒分别接种MDCK细胞单层,加入含有不同胰蛋白酶浓度的DMEM维持液,每隔24 h观察细胞病变,并测定上清液中的HA滴度。[结果]当维持液中胰蛋白酶含量为10～20μg/ml时,培养液上清液中的HA滴度最高,达到7 log2（1∶128）。当病毒的接种浓度为10-3和10-4时,MDCK细胞在96 h几乎全部病变,峰值出现在接种后的72～96 h。[结论]当维持液中胰蛋白酶含量为10～20μg/ml时,有利于H9亚型AIV病毒在MDCK细胞上增殖。     

欧亚类禽型H1N1猪流感病毒HA蛋白的表达及免疫原性评估

【目的】 表达欧亚类禽型（eurasian avian-like,EA）H1N1猪流感病毒（SIV）的血凝素（HA）蛋白,并对其免疫原性进行测定。【方法】 利用RT-PCR技术扩增病毒A/swine/Zhejiang/245/2013（H1N1）(ZJ245)的HA基因,将其克隆至真核表达载体pCAGGS中,获得重组质粒pCAGGS-HA(ZJ245),将其转染293T细胞,采用间接免疫荧光（IFA）检测和Western blot检测HA蛋白在体外的表达;将重组质粒pCAGGS-HA(ZJ245)经肌肉注射途径、以100 μg/只剂量免疫16只6周龄BALB/c小鼠（I组和II组）,间隔3周后进行加强免疫（二免）;同等数量的小鼠以相同方式注射100 μL无菌PBS作为非免疫对照组（III组和IV组）。首免和二免每周采血,分别采用血凝抑制（HI）试验和病毒中和（VN）试验两种方法测定不同类型的血清抗体效价;二免2周后,其中两组小鼠（I组和III组）用50 μL（10 ^6.0EID₅₀）的ZJ245病毒经滴鼻感染途径进行攻毒,另外两组（II组和IV组）用A/swine/Heilongjiang/44/2009（H1N1）（HLJ44）病毒进行攻毒。攻毒后14 d内每天观察小鼠的临床症状、统计发病与死亡情况,且每天称量小鼠体重,在体重下降比率超过25%时判定为小鼠死亡。攻毒后第3 天,每组随机剖杀3只小鼠,分别采集脑、鼻甲、肺、脾和肾等脏器,匀浆处理后通过接种10日龄的非免疫鸡胚测定脏器的病毒含量。通过小鼠体重变化以及脏器滴定的病毒含量评估重组质粒pCAGGS-HA(ZJ245)的免疫保护效果。 【结果】 经酶切鉴定和测序验证表明ZJ245的HA基因的已正确克隆至真核表达质粒pCAGGS中获得重组质粒pCAGGS-HA(ZJ245),经体外转染293T细胞后,IFA和Western blot证实了病毒的HA蛋白能够正确表达,并具有良好的生物学活性;小鼠的免疫与攻毒试验结果表明,重组质粒pCAGGS-HA(ZJ245)首免后一周可检测到针对同源病毒ZJ245的低水平HI和VN抗体,加强免疫后抗体水平明显升高,HI抗体达到76.88、VN抗体达到152.5;同时针对异源病毒HLJ44也产生了较低水平的HI和VN抗体。10 ^6.0EID₅₀的同源病毒ZJ245攻毒时,与非免疫组小鼠相对比,重组质粒pCAGGS-HA(ZJ245)的免疫完全阻止了因病毒攻击而导致的小鼠体重下降以及肺脏和鼻甲内病毒的复制;10 ^6.0EID₅₀的异源病毒HLJ44攻毒时,相比非免疫组小鼠,质粒免疫组小鼠体重的下降比率、以及肺脏和鼻甲内的病毒滴度均显著降低（P<0.0001、P <0.001、P <0.05）。 【结论】 重组质粒pCAGGS-HA(ZJ245)能够有效表达病毒HA蛋白,免疫后可使小鼠获得完全抵抗ZJ245感染及部分抵御HLJ44感染的免疫保护力,表明重组质粒 pCAGGS-HA(ZJ245)具有良好的免疫原性。     

一株鸭源H4N8亚型禽流感病毒的全基因测序及遗传进化分析

【目的】禽流感病毒(avian influenza virus, AIV)根据其表面糖蛋白血凝素(hemagglutinin, HA)和神经氨酸(neuraminidase, NA)的不同,可分为16种HA和9种NA亚型。根据其致病力的差异可分为高致病性禽流感病毒(highly pathogenic avian influenza virus, HPAIV)和低致病性禽流感病毒(low pathogenic avian influenza virus, LPAIV)。虽然H4亚型禽流感病毒为低致病性AIV,感染家禽表现为无症状感染,但其对禽类甚至是哺乳动物是一个潜在的威胁,因此必须要加强对H4亚型禽流感病毒的调查监控。【方法】为了探讨H4亚型禽流感病毒的分子特征及遗传演化规律,对2010年在中国华东地区某活禽市场进行流行病学监测时分离到的一株H4N8亚型禽流感病毒A/duck/Nanjing/1102/2010（简称DK/NJ /1102）进行了全基因组序列测定及遗传进化分析。通过常规的血清学试验确定其HA亚型,提取病毒总RNA,并通过RT-PCR方法分别扩增出其各基因片段,连接 pGEM-Teasy载体上后进行序列测定。利用GenBank中的BLAST工具进行核苷酸序列的同源性分析,并与GeneBank 中的H4亚型流感病毒及其它相关序列进行遗传进化分析。【结果】DK/NJ/1102的HA基因与Mongolia 分离株A/duck/Mongolia/274/2007(H4N3)的核苷酸同源性最高,为98.9%。推导的氨基酸剪切位点序列为“P-E-K-A-S-R-G”,符合典型的低致病性禽流感病毒特征;NA基因与华东地区分离的鸭源毒株A/Duck/Eastern China/n91/2009(H3N8)核苷酸同源性最高,达99.4%;PB1、PA和NP基因均与H1亚型禽流感病毒亲缘关系最近;M基因与A/wild duck/Korea/CSM4-12/2009(H5N1)核苷酸同源性最高,高达99.9%;NS基因与韩国2009年分离的H7N7亚型流感病毒遗传距离最近。NS1蛋白的80-84处氨基酸没有发生氨基酸缺失。【结论】该H4N8亚型禽流感病毒基因组构成比较复杂,可能是一株多基因重组病毒。     

H9N2亚型猪流感病毒NS1基因的克隆表达及反应原性分析

【目的】对H9N2亚型猪流感病毒NS1（nonstructural protein 1）基因进行原核表达,获得纯化表达产物,以期为检测猪流感抗体的 ELISA试剂盒的研制奠定基础。【方法】采用RT-PCR扩增了猪流感病毒（H9N2）的NS1基因,将其克隆于表达载体pET-28a（+）上构建成重组质粒pET-NS1,转化受体菌E.coli BL21-DE3感受态细胞,经酶切鉴定及序列分析,筛选出正确重组质粒转化子。【结果】经终浓度5 mmol•L-1乳糖诱导,SDS－PAGE电泳结果显示,重组蛋白NS1得到大量表达,分子质量约为26kD。经Western-blotting分析,表达蛋白能与阳性血清发生特异性反应,而与阴性血清不反应;ELISA检测显示,在被检血清稀释1 280倍时,阳性血清的OD650值大约是阴性血清的3倍,差异明显。【结论】重组蛋白NS1表达量高,易于纯化并且具有良好的血清学反应的特异性。     

H1N1亚型猪流感病毒HA蛋白225位氨基酸对病毒致病性的影响

[目的]流感病毒的致病性是由多个基因共同决定的,笔者之前的研究结果发现当两株具有相似基因特征的H1N1亚型猪流感病毒进行HA基因替换以后,病毒对小鼠的致病性发生了改变.通过确定影响病毒致病性的关键氨基酸位点,为进一步揭示流感病毒致病力差异奠定了基础.[方法]对ZD71和SY130的HA蛋白氨基酸序列进行比对,确认氨基酸...