猪Mx1基因cDNA的克隆及序列分析

 为获得云南本地猪Mx1基因cDNA序列,根据GenBank中猪Mx1基因的参考序列,设计合成3对引物。以云南本地猪外周淋巴细胞为样本,采用RT-PCR方法进行分段扩增,对扩增片段进行克隆,测序分析及序列拼接。结果表明,扩增的云南本地猪Mx1基因cDNA全长2546bp,开放阅读框1992bp,编码663个氨基酸,与GenBank中他猪种Mx1基因序列对比,核苷酸序列的同源性为99.4%～99.8%,氨基酸序列的同源性为98.8%～99.5%。成功获得云南本地猪Mx1基因的cDNA序列,为研究云南本地猪Mx1蛋白的抗病毒活性及作用机制奠定了基础。     

草鱼抗病毒基因Mx全长cDNA的克隆、序列分析与真核表达载体构建

Mx蛋白是一类由I型干扰素(IFN)诱导表达的抗病毒蛋白。以PolyI∶C诱导的草鱼(Ctenopharyngodon indellus)肾细胞(CIK cells)为材料,抽提细胞总RNA,通过RT-PCR的方法扩增出Mx基因cDNA全序列,连接至pMD20-T载体上,构建重组质粒pMD20-T-Mx,并测序进行序列分析。用限制性内切酶从克隆的重组质粒pMD20-T-Mx上切下Mx基因,插入到质粒pEGFP-C1中,构建真核表达载体pEGFP-C1-Mx。结果显示,该基因cDNA全序列为1 921 bp,阅读框共编码627个氨基酸,分子量约为71.1 ku,理论等电点pI为8.33,其编码的Mx蛋白具有脊椎动物Mx蛋白共有的结构特征:一个三联体GTP结合区域和一个发动蛋白家族的典型结构特征序列。生物信息学分析表明,草鱼Mx基因所编码的蛋白质以亲水区域为主,具有丰富的B细胞抗原位点,但无明显的核定位序列,空间结构包括N端的GTP酶结构域(GTPase domain)、中间的中央相互作用结构域(central interactive domain,CID)和C端的GTP酶效应结构域(GTPase effector domain,GED)。同源性分析显示,草鱼Mx蛋白氨基酸序列和其他物种的相似性为45.1%～99.7%。此外还成功构建了含草鱼Mx基因cDNA全序列的真核表达载体pEGFP-C1-Mx。研究亮点:首次通过干扰素诱生剂PolyI∶C诱导草鱼肾细胞的方法克隆得到了草鱼抗病毒基因Mx cDNA全序列,并且借助生物信息学软件对其编码的氨基酸进行了序列分析,还成功构建了真核表达载体pEGFP-C1-Mx,为进一步研究草鱼Mx蛋白的生物学活性及其在抗鱼类病毒性疾病中的应用奠定基础。     

牙鲆Mx基因在毕氏酵母中的表达

以牙鲆为材料,通过RT-PCR扩增得到其Mx基因的cDNA序列,构建pPIC9K-Mx表达载体,并在毕氏酵母中实现了牙鲆Mx蛋白的真核表达,为进一步研究牙鲆Mx蛋白的抗病毒机制打下了良好的基础。     

禽类Mx基因GTP酶效应区(GED)序列适应性进化分析

为进一步了解禽类Mx基因进化历程及结构与功能变异,测定了4种经济类型11个地方鸡品种:肉用型(惠阳胡须鸡、清远麻鸡、文昌鸡)、兼用型(藏鸡、狼山鸡、寿光鸡、北京油鸡、萧山鸡、鹿苑鸡)、蛋用型(白耳鸡)、药用和观赏型(丝羽乌骨鸡)Mx基因GTP酶效应区(GTPase effector domain,GED)序列,并结合已报道的原鸡及部分其他鸡形目和雁形目禽类相关序列,采用mrModeltest和MrBayes筛查最适核苷酸替代模型、构建贝叶斯进化树,并采用Datamonkey和PAML4b检测位点选择压力。结果:获得了中国地方鸡种Mx基因GED区核苷酸序列,全长231 bp,编码77个氨基酸。序列联配结果表明家鸡Mx基因GED区高度保守,仅发现3个突变位点,分别位于2 032 bp、2 075 bp和2 139 bp处。AIC信息量准则表明禽类Mx基因GED区的最优核苷酸替代模型为GTR+G。基于最优模型重建的禽类Mx基因GED区贝叶斯进化树具有较高的后验概率,揭示的系统发育关系和禽类物种进化基本一致。Datamonkey的单一断裂点扫描和遗传算法扫描均未发现禽类Mx基因GED区序列数据集有重组事件,位点选择压力检测结果表明禽类Mx基因GED区在进化过程中并未受到正选择作用。     

琅琊鸡Mx基因3′端部分序列PCR-RFLP与序列分析（摘要）

[目的]从分子角度对琅琊鸡Mx基因的遗传变异进行研究,为琅琊鸡分子标记辅助选择、抗病育种提供依据。[方法]采用常规的酚/氯仿抽提法提取基因组DNA。Mx基因3′端部分序列引物参考杨宁（上游引物P1：5′-GCCTACCAATACCTGG-TAGACTTT-3′,下游引物P2：5′-GCTCCCCCTCCTITCAAATA-3′）。琅琊鸡Mx基因3′端部分序列的PCR产物采用1%琼脂糖凝胶电脉检测,在紫外凝胶成像系统下观察并保存图像。利用3%琼脂糖凝胶电泳检测HaeⅢPCR-RFLP。根据酶切结果,选取不同基因型个体的PCR扩增产物,用DNA快速纯化回收试剂盒纯化。根据《分子克隆试验指南》,经连接、转化、克隆后,按照TaKaRa公司质粒DNA小量纯化试剂盒说明,对经PCR扩增鉴定为阳性的菌液提取质粒。鉴定后将重组质粒送TaKaRa公司测序。[结果]琅琊鸡群体中存在Mx基因HaeⅢ酶切位点的多态性,且均有A、B两个等位基因,基因频率分别为0.562和0.438。经独立X~2性检验,Mx基因HaeⅢ酶切位点的基因型分布在琅琊鸡群体中极显著偏离Hardy-Weinberg平衡状态（P〈0.01）。对多态片段进行克隆测序分析,结果表明,该扩增片段长度大小为357 bp,通过DNAMAN分析软件对报道序列（NC_006088,杨宁）和Mx基因序列作比对分析,发现琅琊鸡Mx基因3′端部分序列扩增区域在20 506～20 862位点,变异序列在20771～20 802位点存在长度为31 bp的碱基缺失。HaeⅢ在本序列195 bp位点存在识别序列,对AB基因型（2条带）个体酶切产物是长度为195 bp和162 bp的2段,在3%琼脂糖凝胶中显示2条带;对AA基因型（1条带）个体发生酶切反应时,由于存在62～93位点长度为31 bp碱基缺失,所以酶切产物是长度为164 bp和162 bp的2段,与试验预期结果相一致。[结论]在山东省地方鸡种琅琊鸡Mx基因3′端序列中发现存在HaeⅢ-RFLP。     

鸡Mx基因编码序列1892位SNP及其等位基因的确定

通过利用非互补的PCR-RFLP技术检测了12个鸡群体378个样本在Mx基因编码序列第1892位的等位基因.结果表明:鸡Mx基因经PCR-RFLP扩增,获得长度约为100 bp的基因片段,在1892位发生A→G的突变;鸡Mx的抗病性(A)和易感性(G)等位基因频率分别为38%和62%,且分布于西南亚的BAN、PKD、PMA和Pal 4个鸡群体中的抗病基因频率明显高于其他群体.     

山东地方鸡种Mx基因遗传变异与免疫性状的关系

采用PCR SSCP技术研究山东地方鸡种(鲁禽鸡、琅琊鸡、石歧杂鸡、汶上芦花鸡、莱芜黑鸡、济宁百日鸡)Mx基因多态位点与绵羊红细胞(sheep red blood cell, SRBC)免疫抗体滴度和禽流感(avian influenza, AI)、新城疫(newcastle disease, ND)免疫抗体滴度等免疫性状的关系。扩增包含Mx基因intron 13和exon 14约150 bp的片段,通过SSCP分型、测序,在5个地方鸡种共发现2个SNP突变位点分别为Mx基因编码序列第1 892位点G→A(Ser→Asn),第1 911位点G→A。与免疫性状进行关联分析,发现鲁禽鸡、琅琊鸡、莱芜黑鸡Mx基因编码序列1 892位点与H9抗体滴度显著相关(P＜0.05)。     

鸡瘦蛋白基因克隆中的若干问题研究

根据GenBank中鸡的LeptinmRNA序列(AccessionNo.AF012727)设计12对引物,用RT-PCR方法从不同品种(系)、不同时期及不同处理鸡的脂肪、肝脏和卵巢组织总RNA中没有扩增出鸡的Leptin基因片段;根据鸡的EST数据库中查到的一条鸡Leptin基因前体序列设计4对引物,用RT-PCR方法在包括卵巢在内的多个组织的cDNA中没能扩增出正确序列。为提高鸡Leptin基因的表达水平,通过给鸡注射胰岛素,利用RT-PCR方法对肝脏、卵巢和脂肪组织的总RNA进行扩增,没有得到目的序列。根据已发表的哺乳动物的Leptin基因序列设计兼并引物对鸡基因组DNA和脂肪、肝脏组织的cDNA进行PCR,结果没有特异性扩增条带,但在小鼠的基因组中可以获得稳定的扩增条带。用扩增长片段LATaq酶从鸡基因组DNA中也没有扩增出Leptin基因片段,而从小鼠的基因组DNA中,可扩增出小鼠Leptin基因片段;以小鼠LeptincDNA片段为探针,对鸡脂肪组织和肝脏组织来源的总RNA进行NorthernBlot分析,并未获得杂交信号;以猪的LeptincDNA片段为探针,对鸡基因组DNA进行SouthernBlot分析,并未获得特异性的结果。研究结果表明,在鸡的脂肪、肝脏和卵巢组织中不存在与小鼠Leptin基因同源性如此高的mRNA序列,在鸡的基因组中也不存在与小鼠、猪等哺乳动物Leptin基因序列同源性如此高的基因?     

AA肉鸡补体C3d基因cDNA的克隆及鉴定

为获得鸡C3d基因的cDNA,从鸡肝细胞提取总RNA,通过RT-PCR扩增出C3d基因的cDNA,脂糖凝胶电泳鉴定后直接克隆到pMD18-T载体,构建C3d-pMD18-T重组质粒,转化大肠杆菌,酶切鉴定后进行序列测定。通过琼脂糖凝胶电泳证明有1.0 kb左右的PCR扩增片段,序列测定表明为C3d基因的cDNA。通过RT-PCR法从鸡肝细胞RNA中成功地扩增到鸡C3d基因的cDNA,为进一步构建基于C3d基因内佐剂的疫苗奠定了基础。     

琅琊鸡Mx基因3'端部分序列PCR-RFLP与序列分析

[目的]为琅琊鸡分子标记辅助选择、抗病育种提供依据。[方法]利用PCR-RFLP技术对琅琊鸡Mx基因3’端片段的HaeIII的酶切多态性进行分析。[结果]琅琊鸡群体中存在Mx基因Haem酶切位点的多态性,且均有A、B2个等住基因,基因频率分别为0．562和0．438。Mx基因Hoe III酶切位点的基因型分布在琅琊鸡群体中极显著偏离Hardy-Weinberg平衡状态（P〈0．01）。对多态片段进行克隆测序分析,结果表明,该扩增片段长度大小为357bp,多态片段存在长度为31bp的碱基缺失。[结论]在山东省地方鸡种琅琊鸡眠基因3’端序列中发现存在Hoe III-RFLP。     

鸡、鹅肌肉生成抑制因子基因的克隆及序列分析

采用反转录．聚合酶链反应(RT-PCR)技术,从鸡胚、鹅胚中扩增得到肌肉生成抑制因子基因,分别克隆到pGEM-T Easy载体中进行序列测定．结果表明,克隆得到的MSTN基因序列均由1128个核苷酸组成,MSTN基因序列同源性为94．6％,推导相应氨基酸序列的同源性达97．9％．     

乌鸡传染性法氏囊病毒的分离鉴定与分子生物学特性研究

从一群精神不振、拉白色稀粪便为特征的乌鸡中分离到 1株病毒。经血清学试验、鸡胚接种试验、动物回归试验等鉴定为法氏囊病毒。该病毒与鸡法氏囊病毒的血清型无明显差异。根据IBDV的VP2基因序列设计了一对特异性引物 ,应用RT -PCR法从中扩增出了一条0 .72kb的VP2基因高变区片段。序列分析表明 ,片段长 0 .72kb ,编码 2 4 0个氨基酸 ,与其他毒株的VP2基因序列比较分析 ,该毒株符合IBDV超强毒的特征。虽然有 4处氨基酸发生了变化 ,但没有引起其抗原性的改变     

鸡突变型和未突变型Mx蛋白体外抗病毒活性研究

【目的】研究鸡Mx蛋白第631位氨基酸变异与抗病性的相关性。【方法】用已经构建成功的中国狼山鸡Mx蛋白基因突变型pcDNA3.0-MMx和未突变型pcDNA3.0-Mx真核表达载体分别转染鸡成纤维（CEF）细胞和鼠成纤维（NIH-3T3）细胞;利用RT-PCR检测突变型MMx基因和未突变型Mx基因的表达,微量细胞病变抑制法测定重组蛋白抗新城疫病毒（NDV）和水泡性口炎病毒（VSV）的效果。【结果】诱变鸡Mx基因的表达重组蛋白可保护CEF细胞在孵育48 h内免受NDV的感染;转染突变型pcDNA3.0-MMx真核表达载体的NIH-3T3细胞在孵育60 h内亦未受到VSV的浸染;而转染未突变型pcDNA3.0-Mx真核表达载体的CEF和NIH-3T3细胞在24 h内均发生了病变。【结论】体外重组突变的Mx蛋白在单细胞水平上具有延缓NDV和VSV感染的能力。     

鸡新城疫Ⅰ系疫苗诱导鸡IL-2基因转录及cDNA克隆的研究

应用RT-PCR方法从鸡新城疫 系疫苗接种鸡胚的脾淋巴细胞中扩增出IL-2基因cDNA。结果表明,以鸡新城疫 系疫苗稀释50倍或100倍接种10日龄鸡胚,培养48h的脾脏提取mRNA的扩增效果最好。测序结果显示,所扩增片段的核苷酸序列及其所编码的氨基酸序列,与已发表的IL-2基因的同源性分别为97.7%～99.8%和95.1%～99.3%。其中第8位、68位和130位氨基酸(分别是L,V和S)的变异是其他品种鸡所没有的。     

北京油鸡肠道肽转运蛋白PEPT1表达载体的构建及在293-T细胞的表达

本试验通过分子生物学手段建立了北京油鸡PEPT1细胞模型。根据GenBank的原鸡PEPT1保守区序列设计引物,从北京油鸡肠道粘膜组织中扩增出PEPT1基因,将其与pGEM-T载体连接并测定核苷酸序列,成功获得到测序正确的2145bp的基因,并将北京油鸡肠肽转运载体PEPT1基因克隆到真核表达载体pcDNA3.0,构建了真核表达载体pcDNA3-PEPT1。采用脂质体介导将表达质粒pcDNA3-PEPT1转染293-T细胞,同时转染pcDNA3.0-EGFP荧光蛋白进行转染体系荧光监测,流式细胞术检测转录后16、20、24h的荧光强度。分别在16、20、24、44h收集等量转染细胞,抽提转染细胞总RNA,DNAseⅠ处理残留的DNA污染,反转录合成cDNA,以构建不同稀释度的pGEM-T-PEPT1质粒为模板,建立SYBERGREEN实时荧光定量标准曲线,检测PEPT1在293-T细胞中的转录水平。结果表明,在质粒转染入293-T细胞后,在16、20、24、44h均有稳定的转录水平。从而建立了在293-T细胞表达北京油鸡PEPT1的外源模型,同时为研究该转运蛋白性质,进一步调控动物肠道肽的吸收奠定了基础。     

鸡Mx蛋白在293T细胞中的表达及其抗病毒活性

[目的]研究鸡Mx蛋白在293T细胞中的表达并检测其抗病毒活性。[方法]将鸡的Mx基因克隆入pEGFP-C1载体,经筛选鉴定后磷酸钙法转染293T细胞,并对转染细胞进行荧光分析以及RT-PCR与Western blot鉴定,同时提取细胞蛋白质,微量细胞病变试验检测其抗新城疫病毒的活性。[结果]试验构建的pEGFP-C1-cMx真核表达载体转染293T细胞后,在胞浆中可检测到绿色荧光,RT-PCR与Western blot结果进一步证实,pEGFP-C1-cMx可在293T细胞中表达,微量细胞病变试验显示,表达的融合蛋白可保护鸡胚成纤维细胞免受新城疫病毒感染。[结论]试验构建的pEGFP-C1-cMx表达载体可在293T细胞中表达具有抗新城疫病毒活性的鸡Mx蛋白。