猪传染性胃肠炎华毒弱毒株纤突蛋白B、C抗原位点片段基因的克隆与序列分析

猪传染性胃肠炎华毒（TGEV H）是我国分离的代表毒株,H弱毒株是我国自行培育成功的具有良好免疫原性的疫苗株。应用RT－PCR方法扩增出1．3kb的目的片段,包括S基因的编码的B、C两个主要抗原位点的片段,目的片段与pUC19质粒载体进行连续,转化,鉴定后得到阳性重组质粒,命名为pTS1,将重组质粒插入的目的基因片段进行序列分析和比较,其结果表明TGEV H株和S基因5’端B、C位点片段1190bp的核苷酸序列与国外的TGEV毒株Miller、Purdue-115、FS772／70及台湾省TFI毒株序列均具有很高的同源性,达94．72以上。推导的氨基酸序列同源性为94．70％以上。编码抗原位点C的序列与其它毒株完全一致,但在B位点发生改变,即第97个氨基酸发生改变,由Trp突变为Ser。该核苷酸该片段全长1261bp,包括起始密码子ATG及基因间的共同序列ACTAAAC。本研究首次报道了国内的TGEV分离株－H弱毒株S基因的RT－PCR扩增及其编码的B、C抗原位点片段的分子克隆及序列分析,为进一步揭示TGEV强弱毒差别的分子机制、开展新型疫苗及进行分子诊断的研究奠定了重要基础。     

猪传染性胃肠炎病毒TH-98株M基因的克隆及序列分析

本研究首次扩增出TGEV国内分离株TH-98株M基因(882bp)，将该片段克隆到pMD18-T载体上，经限制性内切酶鉴定M基因正确插入pMD18-T载体上，命名为pMD18-T-THM。序列测定和分析表明，该片段的核苷酸序列与国外发表的猪传染性胃肠炎病毒T014株、Purdue15株、TFI株、96-133株M基因同源性达到98％以上，氨基酸序列同源性高达97％以上，表明不同来源毒株M基因保守性较高。     

猪传染性胃肠炎病毒TH-98株S基因的克隆与同源性比较

用猪睾丸 (Swine testicle,ST)细胞繁殖并扩增猪传染性胃肠炎病毒国内分离株 TH- 98,根据 Gen Bank中已发表的TGEV S基因 c DNA序列 ,利用 Oligo4.1程序软件设计并合成两对引物 ,进行逆转录聚合酶链式反应 (RT- PCR) ,扩增出2 .3kb和 2 .1kb两个片段 ,分别命名为 Sa与 Sb,先后插入到 p UC18质粒载体上的 Eco RI和 Pst I多克隆位点上 ,构建了重组质粒 p UC- S。根据 TGEV S基因位点和 p UC18的物理图谱 ,用相应的限制性内切酶进行酶切及套式 PCR方法进行鉴定、分析 ,证明克隆的 p UC- S为 TGEV S基因。同时对 p U C- S进行序列测定分析 ,并与来自美国、英国和日本的五个毒株进行核苷酸及编码氨基酸同源性比较 ,证明了 S基因的高度保守性     

猪传染性胃肠炎病毒S基因B、C位点的克隆及原核表达载体的构建

参考GenBank上公布的猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）S基因B、C抗原位点序列,应用Primer6．0设计一对含酶切住点的引物,用于RT—PCR扩增B、C抗原位点目的片段,将扩增产物连接于peasy—T克隆载体上,构建克隆载体,用EcoRⅠ和XhoⅠ对表达载体PET-32a（＋）和重组质粒进行酶切,将酶切产物亚克隆至PET-32a（＋）多克隆位点上,连接、转化至BL21（DE3）,构建B、C位点的原核表达载体,并对阳性重组质粒进行酶切、PCR和测序鉴定。所扩增的目的片段的大小为357bp,与原核表达载体连接后,经核苷酸及推导的氨基酸序列分析表明,该基因与其他猪传染性胃肠炎病毒相应基因具有很高的同源性,说明成功地构建了TGEVS基因B、C抗原位点的原核表达载体。TGEVS基因B、C抗原位点原核表达载体的成功构建,为TGEV诊断方法的建立提供良好的技术基础。     

猪传染性胃肠炎病毒S基因的克隆及其结构特征

参照GenBank中登录的TGEVS基因序列设计了3对特异引物，经RT-PCR扩增获得了TS株S基因的SⅠ、SⅡ和SⅢ3个片段，其大小分别约为1262、2368和1266bp。SⅠ、SⅡ和SⅢ片段经剪接后，可知TS株的S基因全长为4347nt，共编码1449个氨基酸。对TS株与其他毒株的S基因序列进行比较发现，TS株与Miller株、FS722／70株、TGEVH株、961933株、TFI株均在1124～1129位有5′-ATGATA-3′六个碱基，而在Purdue株、TH-98株、NEB72RT株和PRCV-HOL87株中缺失；TS株与Miller株、FS722／70株、TFI株、Purdue株、96-1933株、TGEVH株、TH-98株、NEB72-RT株和PRCV-HOL87株的核苷酸序列同源性分别为99．69／6、98．9％、98．0％、98．3％、95．7％、99．3％、97．7％、98．3％和97．5％。推导氨基酸序列的同源性分别为99．2％、98．4％、97．7％、97．8％、94．8％、98．6％、97．2％、97．7％和97．0％；TS株S蛋白的推导氨基酸序列较Purdue株、TH-98株和NEB72-RT株多出2个潜在的糖基化位点，共34个。与不同毒株比较后，推测在TGEV的S蛋白中第71位的Asp(D)与呼吸道嗜性有关，第219位的Ala(A)与肠道嗜性有关。     

猪传染性胃肠炎病毒TH-98株的遗传变异分析

猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)TH-98株是1998年在黑龙江省哈尔滨市郊区疑似感染TGEV的猪场中分离出来的高致病性毒株。采用RT-PCR以及RACE技术扩增出TGEV的全基因组序列并上传至Gen Bank,将TH-98株同Gen Bank中其他13株TGEV进行比较。结果表明14株TGEV Nsp1~Nsp16、S、ORF3a、ORF3b、E、M、N和ORF7氨基酸序列同源性分别为98.0%~100%、97.3%~99.8%、91.2%~100%、27.0%~100%、93.8%~100%、99.6%~100%、97.3%~100%和92.3%~100%。与已发表的13株TGEV毒株相比,TH-98株Nsp1~Nsp16、E、N及ORF7基因均无缺失或插入;与Miller M60的M基因相比,TH-98株有6nt的缺失。不同的TGEV株的突变、缺失、插入主要发生在ORF3b和S基因中。进化树分析可知TGEV TH-98与Purdue株亲缘关系较近,同Miller株拥有共同的祖先。TH-98株同近几年分离出的毒株JS2012、TGEV-HX、SHXB全基因序列同源性分别为98.6%、98.8%、99.8%。研究表明,TH-98株与目前流行的TGEV毒株相比没有发生明显的变化。     

猪传染性胃肠炎病毒S基因B和C抗原位点片段克隆序列分析及原核表达

猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S蛋白可诱导中和抗体，是主要保护性抗原，N端抗原位点B和C在猪呼吸道冠状病毒(PRCV)中缺失。体外扩增TGEVS基因B、C抗原位点357bp片段(TS)。核苷酸序列与氨基酸同源性分析表明该片段较为保守。将TS克隆到原核表达载体pGEX-6P-1中，转化大肠杆菌中。经IPTG诱导后，SDS—PAGE分析目的蛋白与谷胱苷肽硫转移酶(GST，大小约为26ku)融合后大小约为40ku，目的蛋白分子量约为13．2ku，优化表达条件后表达量达37．9％。     

猪传染性胃肠炎病毒Sa基因的克隆与序列分析

将猪传染性胃肠炎病毒接种ST细胞进行增殖,待细胞出现明显的病变后,将细胞反复冻融3次收获病毒。根据GenBank中已发表的猪传染性胃肠炎病毒S基因的序列,设计合成了1对扩增S基因包含A抗原位点724bp基因片段（Sa）的引物,引物两端分别有BamHⅠ和HindⅢ的酶切位点。以感染细胞提取的病毒RNA为模板,经RT-PCR扩增得到目的片段,然后将其克隆到pMD18-T载体上,经蓝白斑筛选和酶切鉴定选择阳性克隆进行序列测定,构建成功的重组质粒命名为pMD18-T-Sa。用DNAstar软件将其与GenBank上的序列进行同源性比较,结果表明,核苷酸同源性为97%以上,氨基酸同源性为93%以上。根据猪传染性胃肠炎病毒Sa基因核苷酸序列绘制的系统进化树,结果表明,试验株与TH-98株亲缘性最近。     

猪传染性胃肠炎病毒LJ-12株的分离与鉴定

对黑龙江省某猪场腹泻仔猪的粪便进行病毒分离,获得1株疑似猪传染性胃肠炎病毒(TGEV),命名为LJ-12株。在原代猪肾细胞上盲传8代后细胞出现病变,用TGEV S基因的1段特异性引物进行RT-PCR方法检测,扩增出与预期结果相一致的约480 bp的目的基因片段;核酸序列测定结果表明该段基因与TGEV TH-98株的核苷酸同源性为98.5%,氨基酸同源性为98.8%;并通过间接免疫荧光试验,超薄切片电镜观察等方法确定该分离毒株为猪传染性胃肠炎病毒。     

猪传染性胃肠炎病毒核衣壳N蛋白基因的克隆与鉴定

根据文献已发表的猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）cDNA基因序列，设计和合成1对引物，以TGEV TH-98强毒株基因组mRNA为模板，通过RT-PCR技术扩增其N基因：将RT-PCR产物按正确的阅读框架（ORF）定向克隆到载体pProEXHTb上，重组质粒PHN转化进大肠埃希氏菌DH5a株，通过酶切分析及序列测定表明已成功获得了TGEVN基因的无性繁殖体系。TH-98强毒株的N基因的Purdue-115株、FS772/70株、TO14株、96-1933株及TF I株的核苷酸序列的同源性分别为99%、97%、975、95%和96%，氨基酸序列的同源性分别为99%、97%、98%、96%和97%。     

猪传染性胃肠炎病毒SC-1株的分离与基因7的克隆分析

从四川某猪场采集疑似病例的腹泻粪样中分离到1株病毒,该病毒经过ST细胞传代培养盲传至第4代时出现病变。通过荧光抗体染色、病毒中和试验、TCID50试验、核酸类型鉴定,结合样品正染后在电镜下的观察结果,确定该毒株为猪传染性胃肠炎病毒,命名为TGEV SC-1株。参照GenBank中收录的TGEV基因7的序列设计了1对特异性引物,以SC-1株的细胞增殖毒的总RNA为模板,通过RT-PCR扩增获得了大小约为303 bp的基因片段,包括完整的基因7序列片段（237 bp）,在GenBank上的登录号为DQ437507。核苷酸和推导的氨基酸序列比较分析结果表明,该毒株与其他毒株的同源性均在92.4%以上,TGEV SC-1株与美国的PURDUE和中国的TH-98毒株亲缘关系最近;与日本各分离毒株、中国TS株、美国Miller株、中国台湾TFI株和英国96-1933株的同源性较低。TGEV基因7在密码子使用的选择上,存在较大的偏向性;基因7编码蛋白在两端存在有明显的疏水性区域,在2～24和56～75位氨基酸残基处存在跨膜结构。     

猪传染性胃肠炎病毒国内分离株S基因克隆及与国外分离株的同源性比较

用猪睾丸细胞增殖并扩增猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）国内分离株TH－98，根据基因库中已发表的TGEV S基因cDNA序列，利用Oligo软件设计并合成2对引物，进行逆转录聚合酶合酶链反应（RT－PCR），扩增出2.3kb和2.1kb2个片段，即Sa与Sb。将Sa与Sb先后插入到pUC18质粒载体上的EcoRⅠ和PstⅠ多克隆位点上，构建了重组质粒pUC-S，根据TGEV S基因位点和pUC18的物理图谱，用相应的限制性内切酶进行酶进行酶切及套式PCR方法鉴定，分析，证明克隆的pUC-S为TGEV S基因，同时对pUC-S进行序列测定分析，并与来自美国，英国和日本的5个毒株进行核苷酸及编码氨基酸同源性比较，证明了S基因的高度保守性。     

猪传染性胃肠炎病毒S基因B和C抗原位点片段在杆状病毒中的表达

应用RT-PCR方法扩增了猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)TH-98株S基因5′端含有B、C抗原位点的片段。将该片段亚克隆至杆状病毒转移载体pMelBac B中。重组质粒经纯化,与线性化的杆状病毒共转染Sf9昆虫细胞,经4轮蚀斑筛选,获得了纯化的重组病毒,最终实现了在昆虫细胞内的蛋白表达。经Dot-ELISA进行抗原性分析,结果表明重组蛋白具有抗原性。本研究猪传染性胃肠炎血清学诊断方法的建立提供了必要的物质基础。     

鸡传染性支气管炎病毒中国地方分离株S1基因5′端的变异

对自海南省、广西省发生鸡传染性支气管炎 (IB)鸡群分离的 4株 IBV分离株 (Ha N- 1/95、Ha N- 2 /95、GX- 1/98、GX- 2 /98)的主要免疫原纤突蛋白 S1基因经 RT- PCR扩增其 5′端约 1.2 kb的目的片段 ,将其插入载体 p MD 18- T中 ,在大肠杆菌中实现目的基因的克隆。对克隆的目的基因经限制性酶切分析及 PCR鉴定后 ,以双脱氧链终止法测定其核苷酸序列 ,并与 Gen Bank中的参考毒株 (H12 0、SD- 1/97和 Holte)相应序列作比较 ,分析其同源性。结果表明 ,Ha N- 1/95、Ha N- 2 /95、GX- 1/98及 SD- 1/97与疫苗株 H12 0的核苷酸序列同源性分别为 99.5 %、99.2 %、97.9%和99.5 % ,其推导氨基酸序列同源性分别为 99.1%、98.9%、96 .9%和 99.2 %。 GX- 2 /98与 Holte株的核苷酸序列同源率为 99.0 % ,其推导的氨基酸序列同源性为 98.6 % ,而与其他中国分离株的核苷酸序列的同源性仅为 70 %左右 ,氨基酸序列的同源性仅为 6 8%左右。     

禽流感病毒N4亚型神经氨酸酶基因的克隆和序列分析

应用无特定病原体 (SPF)鸡胚增殖禽流感病毒 A/ Turkey/ Ontario/ 6 118/ 6 8(H8N4 )毒株 ,Tri Zol L S Reagent提取病毒 RNA,RT- PCR扩增神经氨酸酶 (NA)基因全片段 ,克隆到 p MD18- T载体上 ,并进行了鉴定和序列测定。所获得的 NA基因片段长 14 4 1bp,编码 4 90个氨基酸残基。根据推导的氨基酸序列进行预测 ,有 9个潜在的糖基化位点和2 0个半胱氨酸残基     

接触传染性脓疱皮炎病毒B2L基因的克隆和序列分析

参照文献和 Gen Bank发表的接触传染性脓疱皮炎病毒 (CPDV ) NZ- 2株的 Bam H / B片段的基因序列 ,设计并合成 1对引物 ,通过 PCR扩增出国内 CPDV疫苗株和 3个分离株的 B2 L 基因 ,目的片段长约 1.13kb。将目的片段克隆到 p MD18- T载体后进行序列测定 ,并用 DNAStar软件比较分析国内的 CPDV株与 NZ- 2株的核苷酸序列和推导的氨基酸序列的同源性。结果表明 ,国内疫苗株和 3株分离株的核苷酸序列同源性分别为 99.7%、96 .9%和 97.4 % ,与国外 NZ- 2株的同源性为 96 .1%。国内 CPDV株与 NZ- 2株的氨基酸序列同源性分别为 92 .0 %～ 96 .0 % ,表明CPDV Bam H / B2 L基因变异的幅度小。     

猪传染性胃肠炎病毒的分离鉴定及S基因进化分析

从山东地区某大型养猪场疑似感染猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的仔猪肠道粪便中,利用ST细胞(猪睾丸细胞系)分离到1株病毒。通过噬斑克隆纯化、病毒理化特性、间接免疫荧光(IFA)、动物回归和RT-PCR进行鉴定。结果表明,病毒株在ST细胞形成形态均一。直径在2mm~3mm左右、外形圆而规则噬斑,耐酸,耐胰酶,对乙醚、氯仿、热比较敏感的RNA病毒;IFA鉴定采用共聚焦显微镜观察可见特异性细胞浆内橙红色荧光;动物回归试验出现典型猪传染性胃肠炎临床症状;RT-PCR扩增获得与预期目的基因片段大小一致的条带。综合分析以上结果,证明所分离到的病毒为TGEV,将其命名为TGEV-SDW1株。参照GenBank中TGEV S基因的核苷酸序列,用RT-PCR成功扩增获得分离株的S基因序列,并与GenBank中公布的13株TGEV毒株的S基因序列进行同源性比较,并绘制系统发育进化树。结果表明,分离株S基因片段长为4 350bp,与13株TGEV毒株氨基酸同源性很高,在96.0%~99.4%之间;核苷酸同源性与TH-98株最高,可达98.2%,与DAE株同源性最低,为77.7%。核苷酸系统进化树结果显示,分离株与中国KT2亲缘关系较近,处于同一分支,表明TGEV-SDW1株来自我国或我国周边国家的变异株。     

猪细小病毒L株VP2基因片段的克隆及序列分析

对自行分离的PPVL株VP2基因片段进行克隆和测序。序列分析表明:L株VP2基因片段与其他PPV毒株的VP2基因片段的核苷酸同源性均在99.19%以上,氨基酸同源性在98.87%以上。表明L株与国内流行毒株之间同源性极为接近,其中与NADL-2(4973)株的亲缘关系最近(核苷酸同源性为99.81%,氨基酸同源性为99.62%)。在决定毒株组织嗜性的关键氨基酸位点上(378,383及436),L株与NADL-2株相同,据此推测L株的毒性与组织嗜性可能与NADL-2相似。     

猪瘟病毒分离株E2基因的克隆与酵母表达系统转移载体的构建

用猪肾细胞 (PK- 15 )繁殖猪瘟病毒 (CSFV)分离株 HL - L Y,根据基因库已发表的 CSFV E2 基因序列 ,设计并合成一对引物 ,以 CSFV总 RNA为模板 ,通过 RT- PCR技术扩增出约 1.1kb的片段 ,即 E2 基因。将 RT- PCR产物先克隆到 p MD18- T载体上 ,构建了重组质粒 T- E2 ,再通过双酶切亚克隆到表达载体 p PIC9的多克隆位点 (MCS)上 ,经酶切、PCR鉴定和测序分析 ,表明均已成功获得了 CSFV E2 基因的重组体 p PIC9- E2 。将该测序结果与国内几个毒株 SHIMEN,C,C- V- L Z,GS- L T,GS- L X分别进行序列同源性比较 ,核苷酸同源性分别为 96 .5 1% ,95 .5 3% ,89.12 % ,78.6 6 % ,77.2 3% ;氨基酸同源性分别为 97.32 % ,95 .71% ,89.5 4 % ,83.16 % ,83.4 2 %。表明该毒株与国内标准毒株 SHIMEN株和 C株具有较高的同源性     

鹅细小病毒NS2基因的克隆和序列分析

本研究参考CerBank发表的GPV B株全基因序列，设计并合成一对引物，通过PCR技术扩增出GPV H1株NS2基因，目的片段长约1．4kb，将目的片段克隆到pMD18-T载体后进行序列测定和分析，结果表明：GPV H1株NS2基因全长1356bP，编码451个氨基酸，与国外已发表的GPV B株相比核苷酸序列同源性为98．75％，推导氨基酸序列同源性为98．67％。