小鼠卵母细胞孤雌激活及孤雌胚体外培养研究

本研究比较了几种化学激活剂对小鼠卵母细胞孤雌激活的影响以及激活后在不同培养培养液中的发育情况,并探讨了一种有效地孤雌激活和体外培养方法。分析结果表明:乙醇 6-DMAP(2.5mmol/L,4h)和SrCl2 6-DMAP(2.5mmol/L,4h)组的卵裂率和囊胚率都显著高于其他各组,说明他们能够较好的激活小鼠卵母细胞,而且,乙醇组合优于SrCl2组合,单个化学激活剂不能完全激活小鼠卵母细胞;激活的昆白小鼠MⅡ卵母细胞在含15?S的CZB培养液中可较好地克服2-cell阻滞并形成桑囊胚,在培养48h添加1.1mg/mL葡萄糖对胚胎的继续发育有利。     

体外培养条件对延边黄牛受精卵体外发育的影响

从延边黄牛卵巢中采集未成熟的卵母细胞进行体外成熟培养、体外受精及受精卵体外培养。结果表明 :1将卵子用 2种不同的培养液进行体外成熟培养和受精卵体外培养 ,TCM199组的卵裂率 (5 6 .3% )极显著高于 D- PBS组(33.6 % ) (P<0 .0 1) ;TCM199组的囊胚发育率和孵化率 (15 .1%、13.7% )虽高于 D- PBS组 (10 .5 %、8.7% ) ,但 2个组之间无显著差异 (P>0 .0 5 )。2以 TCM199作为基础培养液 ,分别用含激素培养液和不含激素培养液进行成熟培养和受精卵体外培养 ,添加激素组的卵裂率、囊胚发育率及囊胚孵化率 (81.2 %、17.5 %、15 .3% )高于没有添加激素的对照组 (75 .8%、12 .1%、10 .5 % ) ,但 2个组之间无显著差异 (P>0 .0 5 )。 3体外受精卵与单层颗粒细胞共培养组的卵裂率、囊胚发育率及囊胚孵化率 (78.0 %、11.5 %、9.9% )显著高于非共培养组 (6 8.1%、5 .4 %、3.6 % ) (P<0 .0 5 )。     

昆明小鼠早期胚胎G6PDH在CZB和KSOM中的转录与表达

根据小鼠肌肉 6 -磷酸葡萄糖脱氢酶 (G6 PDH)的 c DNA序列 ,设计并合成内外 2对引物 ,以巢式 RT- PCR检测了昆明小鼠体外培养的 2 -、4 -细胞期早期胚胎 G6 PDH m RNA的表达情况。结果显示 ,以不含葡萄糖的培养液 CZB体外培养发育至 2 -、4 -细胞阶段昆明小鼠早期胚胎 G6 PDH m RNA经反转录后 ,均能以外引物扩增产物为模板通过内引物扩增出 1条 378bp特异性条带 ;而以含葡萄糖的培养液 KSOM体外培养发育至 2 -、4 -细胞阶段昆明小鼠早期胚胎G6 PDH m RNA经反转录后 ,通过内外 2对引物均不能扩增出特异性条带。表明 CZB液培养的昆明小鼠 2 -、4 -细胞期胚胎 G6 PDH基因已转录与表达 ,磷酸戊糖途径已是其代谢葡萄糖的主要方式之一 ;而以 KSOM液培养的昆明小鼠2 -、4 -细胞期胚胎 G6 PDH基因没有转录与表达。说明培养液中含有葡萄糖的昆明小鼠 2 -、4 -细胞期胚胎不存在磷酸戊糖代谢途径 ,不含葡萄糖的则存在磷酸戊糖途径。     

共培养系统的体细胞类型和状态对猪胚胎早期发育的影响

经体外成熟、受精和培养获得猪胚胎 ,采用体细胞共培养研究了体细胞类型和状态对胚胎早期发育的影响。取体外成熟的不同直径卵泡 (>5 m m,2～ 5 mm)卵母细胞的卵丘团 (颗粒细胞团 ) ,培养铺层后与猪受精卵共培养 ,组间受精卵的卵裂率和发育能力无显著差异 ;根据卵巢的状况对猪输卵管上皮细胞 (POECs)的状态进行分组 ,受精卵和卵巢表面布满卵泡的 POECs共培养 ,卵裂率显著低于卵巢表面有黄体和 /或红体的 POECs共培养组 (P<0 .0 5 ) ,虽然各组间 3～ 4-细胞的发育率无显著差异 ,但卵巢表面有红体和卵泡的 POECs共培养组的 >4-细胞的发育率显著高于卵巢表面布满卵泡的 POECs共培养组 (P<0 .0 5 ) ;受精卵在共培养系统和非共培养系统中的卵裂率无显著差异 ,受精卵非共培养系统中 3～ 4-细胞的发育能力显著低于颗粒细胞共培养组 (P<0 .0 5 ) ,极显著低于 POECs共培养组 (P<0 .0 1) ,无能力突破 4-细胞继续发育 ,与颗粒细胞单层、POECs单层共培养的受精卵 >4-细胞的发育率分别为 2 4.0 %、5 3.8% ,差异显著 (P<0 .0 5 )。结果表明 ,共培养系统对胚胎体外发育的作用 ,一方面与体细胞类型有关 ,另一方面也受输卵管上皮细胞状态的影响     

活性氧(ROS)对小鼠早期胚胎胚细胞分裂的影响

在体外CZB培养的不同时期添加过氧化氢(2.1μmol/L),发育至囊胚阶段,制作胚胎标本,观察其囊胚发育率、胚细胞数和分裂相数。结果显示:0~12 h组和0~72 h组的胚胎发育率显著低于其他几组(P<0.05),对照组、12~24 h组、24~36 h组、36~48 h组之间均差异不显著(P>0.05);各组之间的胚细胞数和分裂指数均无显著差异。说明胚胎在体外培养时,2细胞期胚胎对外源性H2O2最敏感,也最容易发生发育阻滞。但是经H2O2处理之后,度过2细胞期发育阻滞的胚胎能在以后的发育中发生补偿性生长,其胚细胞数和分裂指数都和体外正常发育的胚胎没有差异。     

小鼠卵母细胞孤雌激活试验

应用两种激活方法(乙醇和离子霉素 6-DMAP)激活和三种培养液(CZB，KSOM，M199)对90只小鼠卵母细胞进行了孤雌激活研究。结果显示，离子霉素结合6-DMAP的激活效果高于乙醇；三种培养液中，以CZB激活效果较为理想。在随后的卵母细胞发育率方面，CZB、KSOM和M199三者之间的差异极为明显，以CZB最高，KSOM次之，M199的发育率最低。     

虾青素对小鼠早期胚胎发育及相关基因表达的影响

试验旨在研究培养液中添加虾青素(AX)对小鼠胚胎体外发育和相关基因表达的影响。试验选用23～25 g的ICR系雌性小鼠,利用超数排卵,取卵母细胞进行体外受精,受精1 h后将受精卵随机分组、分别移入浓度为0、5、10、25、50μmol/L的虾青素培养液中进行体外发育培养,在培养24和96 h后分别观察并统计各组的卵裂率和囊胚率;体外培养至96 h后,对囊胚进行细胞计数,统计囊胚细胞数差异;提取各组囊胚总RNA,利用实时荧光定量PCR技术对各组胚胎的TGF-β和Bcl-2基因的相对表达量进行检测。结果显示,添加10μmol/L虾青素能够改善小鼠胚胎体外发育环境且显著提高胚胎卵裂率和囊胚率(P0.05);显著提高囊胚的细胞数(P0.05);极显著提高TGF-β基因表达量(P0.01)。结果表明,添加10μmol/L虾青素有利于小鼠胚胎体外发育,可用于改善小鼠胚胎体外发育环境;TGF-β和Bcl-2基因很可能参与了胚胎发育过程中的相关调控。     

昆明小鼠不同性别早期胚胎体外培养发育潜力观察

自主设计2对引物,提取已知性别小鼠肝细胞DNA,扩增雄性小鼠特有的Sry基因及雌、雄小鼠共有的ZFX基因,建立双重PCR性别鉴定方法.提取小鼠早期8细胞胚胎单卵裂球、双卵裂球DNA,分别进行双重PCR性别鉴定,选择出早期8细胞胚胎的适宜模板量;将已测性别的8细胞胚胎按照雌、雄性别分开培养,观察统计雌、雄8细胞胚胎发育至囊胚的比率.试验结果显示,与单个卵裂球DNA模板量相比,双卵裂球的模板量检出率高,两者之间差异显著(75.00%Vs 93.33%,P<0.05);经过性别鉴定的雄性8细胞胚胎比雌性8细胞胚胎发育至囊胚的比率高,两者之间差异显著(53.33%Vs 33.33%,P<0.05).结果表明,采用双重PCR性别鉴定方法,以双卵裂球的DNA量为模板能够有效的对小鼠早期8细胞胚胎进行性别鉴定;雄性胚胎在体外培养条件下比雌性胚胎具有更好的发育潜力.     

Ghrelin对水牛体外受精和孤雌激活胚胎体外发育的影响

本研究的目的是探讨Ghrelin对水牛体外受精和孤雌激活胚胎体外发育的影响.体外成熟的水牛卵母细胞经体外受精或离子霉素孤雌激活后.分别在舍0,0.5,5,50和500 μg/L Ghrelin的培养液中进行体外培养,观察各组胚胎的卵裂率和囊胚率.结果显示,在培养液中添加不同浓度的Ghrelin对体外受精和孤雌激活胚胎的卵裂率均无显著影响(P>0.05),但添加500 μg/L的Ghrelin显著提高体外受精胚胎的囊胚发育率(33.5% vs 13.7%,P<0.05),50 μg/L或500 μg/L的Ghrelin均显著提高孤雌激活胚胎的囊胚发育率(32.4%和34.6% vs 14.5%,P<0.05).结果表明,培养液中添加Ghrelin对胚胎的早期卵裂没有影响,但可促进水牛体外受精和孤雌激活胚胎囊胚的形成.     

白牦牛卵母细胞体外成熟的研究

研究了不同激素配比、性周期阶段对白牦牛卵母细胞体外成熟的影响，同时研究了不同培养基对早期胚胎体外发育的影响。结果表明：M199＋0．2mmol／L丙酮酸钠＋10％NBs＋5．0mg／L LH＋0．5mg／LFSH＋1＞g／ml 17β-E2是白牦牛卵母细胞体外成熟较为理想的培养系统（成熟率79．4％、卵裂率42．5％）。采集白牦牛卵母细胞时卵巢所处性周期阶段（卵泡期、黄体期）影响卵母细胞的体外成熟（成熟率分别为77．6％、69．5％，卵裂率分别为45．7％、35．6％）。输卵管上皮细胞和颗粒细胞是理想的共培养细胞，能有效克服白牦牛早期胚胎发育阻滞（桑囊胚发育率分别为10．6％、7．7％）。     

小鼠4、8-细胞胚胎单卵裂球体外培养体系的研究

以CZB为基础培养液,培养小鼠4、8-细胞胚胎单卵裂球,研究葡萄糖、牛磺酸和猪输卵管上皮细胞共培养在其体外发育中的作用。结果表明:牛磺酸添加与否对4、8-细胞胚胎单卵裂球的囊胚发育率分别为29%、30%和14%、14%,无显著性差异(P>0.05)。添加葡萄糖后,4、8-细胞胚胎单卵裂球的囊胚发育率分别为36%和19%,有显著提高(P<0.05)。含有葡萄糖而牛磺酸的添加与否对4、8-细胞胚胎单卵裂球的囊胚发育率分别为36%、38%和19%、20%,无显著性差异(P>0.05)。各组内4、8-细胞胚胎单卵裂球形成的囊胚细胞数分别为(10.44±1.24～(12.43±1.18)和(7.57±0.97)～(8.48±1.16),均无显著性差异(P>0.05)。4、8-细胞胚胎单卵裂球与猪输卵管上皮细胞共培养,其囊胚发育率分别为47%和26%,囊胚细胞数分别为(17.57±1.13)和(11.43±0.92),均高于单一培养(P<0.05)。     

利用IVM/IVF技术生产试管犊牛的研究

本研究利用卵母细胞体外成熟(IVM)、体外受精(IVF)技术,体外生产牛胚胎,以获得试管牛.结果表明:卵母细胞体外培养22～24h后,其成熟率为85％;体外受精率为83％.体外受精卵分别在颗粒细胞单层(GCM)和输卵管细胞单层(OCM)上培养,其胚胎最后产量(以授精时卵母细胞的数目为基数)分别为19％和29％,差异极显著(P<0.01).若体外受精卵先在GCM中培养72h后,再将已发生卵裂的(>4细胞)胚胎移到OCM中培养,其胚胎最后产量为35％.由此表明,早期胚胎在其发育过程中至少存在着3个发育相期,即1～8细胞、8～16细胞和16细胞～囊胚3个阶段,各阶段需要不同的培养环境.IVM/IVF胚胎移植到受体黄牛体内后,其足月时的妊娠率为15％.第一头试管犊牛已于1993年4月18日凌晨产出.     

牛、羊卵母细胞孤雌激活的研究

本试验主要比较了离子霉素、电脉冲两种方法激活牛、羊体外成熟卵母细胞的效率。两种激活方法中。牛胚胎卵裂率无显著差异（90．61％对94．40％，P〉0．05），而离子霉素激活胚胎的囊胚发育率极显著高于电激活方法（12．3％对2．4％，P〈0．01）。两种方法对羊胚胎的研究中，羊胚胎卵裂率无显著差异（72．4％对77．4％，P〉0．05）。但是离子霉素激活胚胎的囊胚发育率显著高于电激活方法（3．67％对10．40％，P〈0．05）。本试验中还比较了用化学激活法（离子霉素）激活牛体外成熟卵母细胞后，用SOFaa体系培养，换液与不换液对孤雌激活胚胎体外发育的影响。结果表明：在第4天不换液的胚胎卵裂率和囊胚率极显著高于换液的胚胎（11．64％对3．49％。P〈0．01）。     

Demands for carbohydrates as major energy substrates depend on the preimplantation developmental stage in pig embryos: Differential use of fructose by parthenogenetic diploids before and after the 4-cell stage in the pig

The embryo culture technique has been improving, but the detailed demands for energy substrates such as glucose, fructose, pyruvate and lactate of preimplantation embryos are still unclear. In the present study, the demands of pig preimplantation embryos at each different developmental stage were investigated by use of parthenogenetic diploids as a model of pig preimplantation embryos. Pig parthenogenetic diploids showed different use of glucose and fructose before and after the 4-cell stage. Although glucose supported the development of pig embryos throughout the preimplantation stages and even maintained the expansion and hatching of blastocysts, it suppressed development to the blastocyst stage when glucose coexisted with pyruvate and lactate from 4 h after activation, but not after 48 h (early 4-cell stage). Since ketohexokinase that metabolizes fructose was not expressed in 2-cell and 4-cell diploids, a medium that included only fructose as a major energy substrate did not support early cleavage of pig diploids beyond the 4-cell stage, and almost no diploids developed to the morula stage just as in a medium without carbohydrates. These results may explain the different suppressive effects on pig preimplantation development between glucose and fructose when pyruvate and lactate were present in a medium. In addition, 4-cell diploids that had been cultured in a medium with pyruvate and lactate developed to the expanded blastocyst stage without any carbohydrates as a major energy substrate. These results show that the demands for carbohydrates are different depending on the developmental stage in pig preimplantation embryos.     

OPS玻璃化冷冻对小鼠四倍体胚胎体外发育的影响

为探究开放式拉长细管(OPS)玻璃化冷冻对四倍体胚胎发育的影响,本实验利用2-细胞胚胎电融合法制备四倍体胚胎,再对四倍体胚胎进行OPS玻璃化冷冻,分别观察记录二倍体胚胎、四倍体胚胎以及冷冻解冻后四倍体胚胎的发育情况。结果表明:2-细胞胚胎电融合效率为96.1%;二倍体胚胎组与电融合后四倍体胚胎组的囊胚率和孵化囊胚率差异不显著;冷冻解冻后四倍体胚胎的囊胚率(100%)与四倍体新鲜组(93.3%)差异不显著,其孵化囊胚率(72.3%)较新鲜组(64.9%)显著增高(P<0.05);四倍体冷冻解冻组的囊胚细胞数(31.96)与新鲜组(32.54)无显著差异;冷冻解冻后的四倍体早期囊胚进行体外培养时其发育速度比对照组更快。可见,冷冻对小鼠四倍体胚胎的囊胚率和囊胚细胞数均无显著影响,但孵化囊胚率显著提高,且OPS玻璃化冷冻后使四倍体胚胎的发育速度更快。     

甘氨酸对延边黄牛体细胞克隆重组胚发育的影响

为了提高延边黄牛体细胞克隆重组胚的发育率,研究了在体外培养液中添加不同浓度的甘氨酸对重组胚发育的影响。分别在体外培养液中添加0、7、14、21mmol/L的甘氨酸,结果表明,在体外培养液中添加甘氨酸能够显著提高延边黄牛体细胞克隆重组胚的发育率,且以7mmol/L浓度的甘氨酸囊胚的发育率最高。     

PGI2对缺少内源性PGs的绵羊早期胚胎体外发育的影响

试验旨在探讨添加外源Iloprost（PGI₂的稳定类似物）对缺少内源性前列腺素（PGs）的绵羊早期胚胎体外发育的影响。常规体外受精,通过在体外培养液中单独或联合添加前列腺素合成限速酶COX-1和COX-2的特异性抑制剂SC560和NS398,观察COX-1和COX-2对绵羊早期受精胚胎体外发育的影响。添加抑制剂NS398后,再协同添加不同浓度Iloprost,观察PGI₂对绵羊早期体外胚胎发育的具体作用,并对孵化囊胚的细胞数进行分析。结果显示,在卵裂率和囊胚率方面,单独添加NS398与同时添加SC560和NS398组间差异不显著（P>0.05）,而与对照组间差异显著（P<0.05）。添加NS398后,再添加不同浓度的外源性Iloprost可代替胚胎内源性PGI₂的作用,基本消除COX-2抑制剂对绵羊早期胚胎体外发育的不利影响。Iloprost的浓度以1×10^-6 mol/L为宜,H33342染色结果差异不显著（P>0.05）。本试验结果表明,胚胎内源性COX-2对绵羊早期胚胎中PGI₂的合成起主要调控作用。外源添加Iloprost可补偿胚胎内源性PGI₂的缺失作用,解除NS398对COX-2的特异性抑制作用,最终促进绵羊早期胚胎的体外发育。     

生长因子EGF、bFGF对猪孤雌胚体外发育的影响

在胚胎发育的不同阶段，分别在培养基中添加EGF和bFGF，研究EGF和bFGF对猪孤雌胚体外发育的作用。结果表明：在1细胞阶段添加EGF或bFGF，添加EGF能够显著提高孤雌胚的卵裂率（P〈0．05）；2～4细胞阶段添加EGF和bFGF，添加EGF组和添加bFGF组的囊胚率都显著高于对照组（P〈0．05），而添加bFGF组的囊胚率和囊胚细胞数都略高于对照组和添加EGF组。说明EGF和bFGF有利于猪孤雌胚的体外发育，而且，bF-GF能够通过提高囊胚细胞数而提高猪孤雌胚的质量。     

虾青素对小鼠早期胚胎发育及相关基因表达的影响

试验旨在研究培养液中添加虾青素（AX）对小鼠胚胎体外发育和相关基因表达的影响。试验选用23~25 g的ICR系雌性小鼠,利用超数排卵,取卵母细胞进行体外受精,受精1 h后将受精卵随机分组、分别移入浓度为0、5、10、25、50 μmol/L的虾青素培养液中进行体外发育培养,在培养24和96 h后分别观察并统计各组的卵裂率和囊胚率;体外培养至96 h后,对囊胚进行细胞计数,统计囊胚细胞数差异;提取各组囊胚总RNA,利用实时荧光定量PCR技术对各组胚胎的TGF-β和Bcl-2基因的相对表达量进行检测。结果显示,添加10 μmol/L虾青素能够改善小鼠胚胎体外发育环境且显著提高胚胎卵裂率和囊胚率（P<0.05）;显著提高囊胚的细胞数（P<0.05）;极显著提高TGF-β基因表达量（P<0.01）。结果表明,添加10 μmol/L虾青素有利于小鼠胚胎体外发育,可用于改善小鼠胚胎体外发育环境;TGF-β和Bcl-2基因很可能参与了胚胎发育过程中的相关调控。