骆驼天然单域重链抗体库的构建与鉴定

构建骆驼非免疫噬菌体抗体库,完成抗体库的鉴定。从未经免疫的健康骆驼的外周血淋巴细胞中提取总RNA后,特异性扩增骆驼重链抗体可变区(VHH)片段,将其与噬菌粒载体pCANTAB5E连接获得重组子,多次电转感受态大肠埃希菌TG1后获得VHH抗体基因库,并分析其库容量及多样性。结果表明,经过吸附-洗脱的淘选过程筛选出能够与莱克多巴胺人工抗原特异性结合的噬菌体展示纳米抗体。构建的骆驼天然重链单域抗体库的库容量为107,多样性良好,独立克隆所占比例为90%,筛选出针对莱克多巴胺人工抗原的噬菌体颗粒。已成功构建骆驼天然噬菌体重链抗体库,并筛选出抗莱克多巴胺的噬菌体颗粒,为抗莱克多巴胺纳米抗体的表达和莱克多巴胺的免疫学检测奠定基础,并为后续淘选针对特定抗原的单域重链抗体奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp2蛋白纳米抗体的筛选及其鉴定

为制备猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)非结构蛋白2(Nsp2)的纳米抗体,本研究将截短表达的Nsp2重组蛋白免疫骆驼后分离骆驼外周血淋巴细胞,利用RT-PCR扩增其VHH基因,将VHH基因插入pCANTAB5E噬菌体载体,构建双峰驼重链抗体可变区文库。利用噬菌体展示技术经过3轮淘选,共筛选得到44株Nsp2特异性纳米抗体;经ELISA检测,结果显示44株Nsp2特异性纳米抗体均能与Nsp2蛋白特异性反应。本研究首次筛选到PRRSVNsp2特异性纳米抗体,为Nsp2蛋白的相关研究提供了必要的研究工具,同时为开发新型抗PRRSV药物奠定一定的基础。     

抗犬瘟热病毒VHH抗体噬菌体库的构建与筛选

为构建特异性犬瘟热病毒（CDV）的纳米抗体库,获得抗CDV的VHH抗体,本试验利用CDV免疫羊驼,四免后采集外周血淋巴细胞,提取总RNA反转录为cDNA,利用巢式PCR扩增纳米抗体序列。将目的片段连接至pComb3x噬菌体展示载体,并电转至TG1宿主菌,挑取40个克隆进行菌液PCR验证,随机挑选13个阳性单克隆进行测序,计算抗体库库容量,加入辅助噬菌粒拯救获得的噬菌体展示抗体库。经过3轮淘选,富集对CDV结合力高的噬菌体。利用毕赤酵母系统表达两株结合力高的噬菌体,经Ni柱纯化后,利用ELISA进行噬菌体结合力的鉴定。结果表明,四免后羊驼血清效价达1：25 000,达到建库要求,构建的噬菌体展示文库库容量达3.41×10⁹ PFU。经过3轮淘选,特异性抗体库经稀释100倍后,ELISA检测仍为阳性,表明特异性结合CDV的噬菌体得到明显的富集。ELISA结果表明,两株纯化的纳米抗体与CDV的反应性显著高于对照组。以上结果提示,本研究成功筛选出2株特异性结合CDV的VHH抗体,为VHH抗体在犬瘟热的诊断和治疗方面的应用奠定了基础。     

抗犬瘟热病毒VHH抗体噬菌体库的构建与筛选

为构建特异性犬瘟热病毒(CDV)的纳米抗体库,获得抗CDV的VHH抗体,本试验利用CDV免疫羊驼,四免后采集外周血淋巴细胞,提取总RNA反转录为cDNA,利用巢式PCR扩增纳米抗体序列。将目的片段连接至pComb3x噬菌体展示载体,并电转至TG1宿主菌,挑取40个克隆进行菌液PCR验证,随机挑选13个阳性单克隆进行测序,计算抗体库库容量,加入辅助噬菌粒拯救获得的噬菌体展示抗体库。经过3轮淘选,富集对CDV结合力高的噬菌体。利用毕赤酵母系统表达两株结合力高的噬菌体,经Ni柱纯化后,利用ELISA进行噬菌体结合力的鉴定。结果表明,四免后羊驼血清效价达1∶25 000,达到建库要求,构建的噬菌体展示文库库容量达3.41×10~9 PFU。经过3轮淘选,特异性抗体库经稀释100倍后,ELISA检测仍为阳性,表明特异性结合CDV的噬菌体得到明显的富集。ELISA结果表明,两株纯化的纳米抗体与CDV的反应性显著高于对照组。以上结果提示,本研究成功筛选出2株特异性结合CDV的VHH抗体,为VHH抗体在犬瘟热的诊断和治疗方面的应用奠定了基础。     

抗乙肝病毒人源噬菌体单链抗体库的构建及筛选

为了构建抗乙肝病毒人源噬菌体特异性单链抗体库,从中筛选抗乙肝病毒人源噬菌体单链抗体库特异性单链抗体,试验提取患者外周淋巴细胞总RNA,以总RNA为模板,通过RT-PCR技术分别扩增出H链和L链可变区基因,采用SOE-PCR方法将VH和VL片段随机拼接成ScFv片段,然后将ScFv片段克隆至pCANTAB5E载体,电转E.coil TG1,构建抗乙肝病毒人源单链抗体库,并从中筛选阳性克隆抗体。结果表明:经过5轮筛选,获得2株能与乙肝病毒抗原特异性结合的阳性克隆。说明利用噬菌体抗体技术可不经免疫制备抗乙肝病毒人源噬菌体特异性单链抗体。     

抗牛结核分枝杆菌VHH抗体T7噬菌体库的构建与筛选

为获得抗牛结核分枝杆菌的VHH纳米抗体,本研究利用牛结核分枝杆菌Ag85B蛋白免疫双峰驼,免疫效价达到1∶8 000后采外周血分离淋巴细胞,提取RNA反转录成cDNA,利用巢式PCR方法扩增出编码单域抗体VHH的400 bp基因片段。将目的片段用限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ双酶切,与T7噬菌体载体臂T7Select 10-3RI Arms连接,再通过体外重新包装含目的片段的噬菌体。对建立的VHH噬菌体抗体库进行鉴定,原始文库库容为5.7×10~8 PFU,库阳性率为85.7%。通过4轮生物亲和淘选,筛选并表达出2株高特异性的VHH抗体,均对牛结核分枝杆菌Ag85B蛋白具有特异性。本研究为进一步探讨VHH抗体在牛结核病的诊断和治疗奠定了基础。     

基于噬菌体展示技术筛选抑制素α亚基特异性纳米抗体

【目的】通过噬菌体展示技术构建抗抑制素α亚基(INHα)纳米抗体文库,并筛选出针对绵羊INHα的特异性纳米抗体,以期制备出新型抑制素免疫制剂,为提高绵羊外周血促卵泡素(FSH)水平和排卵率做前期准备。【方法】利用pET32a-INHA原核表达载体诱导表达INHα蛋白,并对诱导表达的INHα蛋白进行SDS-PAGE和Western blotting鉴定;用Ni琼脂糖凝胶纯化后的INHα蛋白免疫新疆双峰驼。通过巢式PCR扩增制备骆驼噬菌体展示纳米抗体文库,通过三轮免疫亲和淘选及噬菌体ELISA从该文库中富集和筛选INHα特异性纳米抗体,并通过测序得知纳米抗体的基因序列;用蛋白-蛋白模拟对接初步鉴定该纳米抗体与INHα蛋白的亲和性。【结果】通过原核诱导表达及Ni琼脂糖凝胶纯化得到了大小为36 ku的INHα重组蛋白,通过Western blotting检测到约36 ku的蛋白条带;双峰驼通过6次INHα蛋白免疫抗体效价达到1∶1 024 000;通过巢式PCR获得了400 bp左右的VHH基因,通过电转化等试验构建了库容量为1.05×10¹²CFU的纳米抗体文库,文库阳...     

抗诺氟沙星噬菌体单链抗体库的构建与筛选

应用噬菌体展示和重组抗体技术制备抗诺氟沙星(NFLX)单链抗体库,筛选获得抗NFLX高特异性、高亲和力的单链抗体scFv。将NFLX与BSA化学偶联获得的免疫源,免疫Balb/C小鼠,提取脾细胞RNA,反转录获得cDNA。以针对鼠源重链可变区(VH)及轻链可变区(VL)基因的特异性引物,扩增获得VH基因和VL基因。通过SOE-PCR法将VH基因和VL基因通过柔性多肽Linker((Gly4Ser)3)拼接成VH-Linker-VL片段,酶切(sfiⅠ+NotⅠ)处理后,插入噬粒载体pCANTAB5E,并转化宿主菌TG1,通过辅助噬菌体M13K07拯救,构建抗NFLX噬菌体单链抗体库。以包被抗原NFLX-OVA包被96孔板,亲和富集法,经三轮淘筛,间接Elisa初步检测重组scFv的特异性抗原结合活性。成功构建噬菌体单链抗体库,获得鼠源抗NFLX特异性的scFv,噬菌体中scFv插入率为90%,获得库容约为1.3×106的抗NFLX噬菌体单链抗体库,筛选得到5株抗NFLX的scFv。为运用噬菌体展示抗体技术制备特异性抗药物单抗及进一步建立药残检测新技术奠定了基础。     

犬细小病毒VHH抗体的文库构建、表达及其鉴定

为构建特异性犬细小病毒(Canine parvovirus, CPV)的纳米抗体库,并获得特异性抗CPV的重链单域抗体(Single variable domain on a heavy chain antibodies, VHH抗体),以分离鉴定的一株CPV-2c毒株(TS02株)作为免疫原免疫羊驼,四免后采集外周血,分离淋巴细胞,利用巢式PCR扩增VHH序列,通过噬菌体展示技术成功构建了纳米抗体的CPV免疫文库,进一步通过ELISA特异性筛选具有高亲和力的抗CPV纳米抗体序列。将筛选出的抗体序列插入pcDNA3.1真核表达载体构建pcDNA3.1-VHH重组质粒,采用PEI转染高密度的HEK293F悬浮细胞,瞬时表达、纯化VHH,进行鉴定。结果表明,四次免疫后羊驼血清效价高达1∶25000,达到了建库要求,构建的纳米抗体的CPV免疫文库,库容达2×10⁶ CFU/mL,文库多样性良好。通过特异性筛选获得了4株具有高亲和力和特异性的抗CPV纳米抗体序列,采用HEK293F细胞瞬时表达并纯化获得4个重组VHH,分别是CPV-VHH-H1、CPV-VHH-D4、CP...     

欧洲鳗鲡T7噬菌体单链抗体库的构建、淘选及其在大肠杆菌中的高效表达

为构建欧洲鳗鲡噬菌体天然单链抗体(scFv)库,筛选鳗鲡病原菌特异性scFv,本研究采用PCR扩增健康欧洲鳗鲡重链可变区(VH)与轻链可变区(VL)基因,通过重叠延伸PCR(SOE-PCR)技术扩增完整的scFv基因(VH-Linker-VL)序列,与T7噬菌体载体连接,经体外包装后接种于宿主菌BLT5403,增殖后经PCR扩增获得噬菌体scFv库。进而以嗜水气单胞菌重组外膜蛋白为抗原,对噬菌体scFv库进行4轮生物淘洗,采用阻断ELISA选取抗体活性最高的scFv,构建pGEX-4T-2-OMP-scFv重组表达载体,转化大肠杆菌BL21进行原核表达。结果显示:本研究得到了完整的scFv基因序列,并以此构建的噬菌体scFv原始库容为1.26×10~6pfu,经扩增后初级库滴度为2.8×10~9pfu/mL;淘洗获得的嗜水气单胞菌重组外膜蛋白scFv抑制率最高达到81.7%,并实现了该scFv在大肠杆菌中的表达,SDS-PAGE检测其蛋白分子量约为53 ku。本研究构建的欧洲鳗鲡噬菌体天然scFv库及淘选获得的特异性嗜水气单胞菌scFv,为养殖鳗鲡病原菌的检测与免疫防治奠定了基础。     

牛病毒性腹泻病毒NS3蛋白纳米抗体的筛选及反应原性检测

本研究旨在获得高效特异性的牛病毒性腹泻病毒（BVDV）NS3（P80）非结构蛋白的纳米抗体。用BVDV灭活疫苗免疫羊驼,测得抗体效价后分离全血中的淋巴细胞。通过噬菌体展示技术构建羊驼重链抗体可变区噬菌体展示文库。经过连续3次吸附-洗脱-扩增的生物筛淘,从中挑选出与BVDV-NS3蛋白结合的噬菌体。对经菌液PCR、琼脂糖凝胶电泳鉴定到的单域抗体（VHH）克隆进行基因测序和同源性比对。用ELISA方法验证筛选出的纳米抗体的反应原性,找到与BVDV-NS3蛋白亲和力高的纳米抗体。结果表明,获得插入率为92.8%、库容为1.84×10¹⁴ CFU/mL的噬菌体展示文库。ELISA结果和氨基酸序列分析显示,成功得到1条与BVDV-NS3蛋白具有良好反应性且与VHH同源性较高的纳米抗体序列。本研究利用大肠杆菌成功表达BVDV-NS3抗原蛋白,建立BVDV纳米抗体噬菌体展示文库,筛选到针对BVDV重要抗原蛋白相应的纳米抗体且与VHH同源性较高。试验结果为牛病毒性腹泻/黏膜病的防控、诊断、治疗及纳米抗体药物的研制提供参考。     

猪流行性腹泻病毒S蛋白纳米抗体的筛选与鉴定

猪流行性腹泻病（porcine epidemic diarrhea,PED）是一种高度接触性肠道传染性疫病,主要危害1周龄以内的仔猪,仔猪感染死亡率高达100%,是目前危害世界养猪业的主要疫病之一。本研究旨在制备针对猪流行性腹泻病毒S蛋白的特异性纳米抗体并鉴定其结合活性。作者原核表达并纯化PEDV S1蛋白,将纯化后的PEDV S1重组蛋白免疫双峰驼,第4次免疫后分离其外周血淋巴细胞,提取淋巴细胞RNA,反转录得到cDNA,通过巢式PCR扩增VHH片段,并构建至pCANTAB-5E载体中,电转化至TG1感受态细胞,得到VHH噬菌体抗体展示文库;随后,对构建的噬菌体抗体展示文库进行救援和3轮富集,利用噬菌体展示技术从中筛选针对PEDV S蛋白纳米抗体,通过ELISA验证筛选的纳米抗体的特异性和结合力。通过Western blot和间接免疫荧光验证纳米抗体与PEDV的结合活性。结果显示：成功表达并纯化PEDV S1蛋白,经4次免疫后,双峰驼血清中的特异性抗体效价达到了1∶256 000。构建的噬菌体展示文库的库容量为2.1×10⁷,阳性率85%;对噬菌体展示文库3轮的淘选富集后,最终筛选出6株氨基酸序列不同的纳米抗体,ELISA结果显示,6株纳米抗体均对PEDV S1重组蛋白具有良好的结合力与特异性。随后验证了Nb3能够与PEDV结合,表明其具有良好的活性。成功筛选到针对PEDV S1蛋白的特异性纳米抗体,所筛选纳米抗体有望用于PED的诊断和治疗,同时为PEDV的致病机制研究提供抗体材料。     

牛病毒性腹泻病毒NS3蛋白纳米抗体的筛选及反应原性检测

本研究旨在获得高效特异性的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)NS3(P80)非结构蛋白的纳米抗体。用BVDV灭活疫苗免疫羊驼,测得抗体效价后分离全血中的淋巴细胞。通过噬菌体展示技术构建羊驼重链抗体可变区噬菌体展示文库。经过连续3次吸附-洗脱-扩增的生物筛淘,从中挑选出与BVDV-NS3蛋白结合的噬菌体。对经菌液PCR、琼脂糖凝胶电泳鉴定到的单域抗体(VHH)克隆进行基因测序和同源性比对。用ELISA方法验证筛选出的纳米抗体的反应原性,找到与BVDV-NS3蛋白亲和力高的纳米抗体。结果表明,获得插入率为92.8%、库容为1.84×1014 CFU/mL的噬菌体展示文库。ELISA结果和氨基酸序列分析显示,成功得到1条与BVDV-NS3蛋白具有良好反应性且与VHH同源性较高的纳米抗体序列。本研究利用大肠杆菌成功表达BVDV-NS3抗原蛋白,建立BVDV纳米抗体噬菌体展示文库,筛选到针对BVDV重要抗原蛋白相应的纳米抗体且与VHH同源性较高。试验结果为牛病毒性腹泻/黏膜病的防控、诊断、治疗及纳米抗体药物的研制提供参考。     

牛病毒性腹泻病毒E2蛋白纳米抗体筛选及反应原性检测

通过噬菌体展示技术筛选牛病毒性腹泻病毒(BVDV)重组E2蛋白特异性纳米抗体,验证纳米抗体反应原性。使用BVDV灭活疫苗免疫羊驼,分别在第0、21、49及70天采集全血,测得抗体效价后分离全血中淋巴细胞,提取总RNA,反转录后PCR扩增目的片段。目的片段和pCANTAB5E使用限制性内切酶酶切连接后转至TG1感受态细胞中,应用噬菌体展示技术构建VHH噬菌体展示文库。再经过3轮"吸附-洗脱-筛选"后得到与BVDV-E2结合的噬菌体,用ELISA鉴定其反应性。结果获得插入率为90.8%,库容为1.02×107 CFU/mL的文库。ELISA结果和序列分析显示,得到2条与E2蛋白具有良好反应性的纳米抗体且与VHH同源性较高的序列。研究结果为BVDV的防控和新型疫苗的研制奠定基础。     

Phage display selection and characterization of single-chain recombinant antibodies against Eimeria tenella sporozoites

A single-chain antibody library against Eimeria tenella sporozoites was constructed by phage display. Antibody-displaying phage was selected in five panning rounds against cryopreserved E. tenella sporozoites. A 1000-fold increase in phage output and a 3000-fold enrichment were obtained after three rounds of panning, as the binding clones became the dominant population in the library. Ten clones were randomly selected from the last selection round, and their nucleotide sequences were aligned and compared to chicken germ-line sequences. Analysis of the light chain variable regions revealed possible donor pseudogenes which act as donors in gene conversion events, and contribute to the diversification of the V(L) immune repertoire. Possible somatic hypermutation events, a consequence of affinity maturation, were also identified. Soluble antibody was produced in a non-suppressor E. coli strain, purified by nickel affinity chromatography, and characterized by immunoblotting. In an immunofluorescence assay, this recombinant antibody showed specific binding to E. tenella sporozoites.     

不同方法构建磺胺二甲氧嘧啶免疫抗原的比较研究

为探讨合成磺胺二甲氧嘧啶(SDM)免疫抗原的有效途径,采用重氮偶合法和戊二醛法分别合成SDM免疫抗原,并对其结构特征、光谱特征和SDM结合比进行比较.结果表明,在合成SDM-BSA中采用重氮偶合法比戊二醛法好.     

日本乙型脑炎病毒E抗原表位的筛选与鉴定

筛选日本乙型脑炎病毒（JEV）的E抗原表位,为开展用JEV模拟表位探索JEV的防治研究创造了条件,为多肽疫苗研制、药物筛选以及特异血清学诊断方法的建立提供重要的线索和依据。以抗JEvE蛋白的单克隆抗体作为固相筛选分子,应用噬菌体表面展示技术,按消减、结合、洗脱、扩增的顺序筛选噬菌体7肽库,挑取噬菌体单克隆培养并ELISA鉴定,对阳性克隆测序分析,确定JEVE抗原模拟表位的氨基酸序列。设计合成包含该表位的E抗原15肽（GGADSMSMAGMAVSY）cDNA序列,与pGEX-KG构建重组表达载体,诱导表达重组多肽并west-ernblot验证。经过4轮筛选后,噬菌体得到高度富集,挑取单克隆ELISA鉴定,有22个克隆呈阳性。对重组多肽进行Western blot验证,结果表明该重组多肽能够特异结合兔抗JEV多抗。应用上述方法成功筛选出JEV结构蛋白E的特异性噬菌体模拟表位,为下一步研究奠定了基础。     

禽流感免疫噬菌体抗体库构建及ELISA检测方法的建立

本研究应用噬菌体抗体库技术筛选禽流感亚型病毒Fab抗体,并建立相应ELISA检测方法。用禽流感亚型混合疫苗免疫小鼠,取其脾脏提取总RNA用于扩增免疫球蛋白轻链和重链基因,克隆至噬菌粒pComb3,然后转化入感受态细胞XL1-Blue中,以10¹² CFU辅助噬菌体VCSM13进行感染后,获得Fab抗体库容量为8×10⁷ CFU。以H5N1病毒为抗原进行4轮亲和筛选,获得特异性结合的克隆,利用获得的特异性克隆进行ELISA检测方法的建立。