应用SAS软件优化武夷菌素产生菌发酵培养基

武夷菌素是由不吸水链霉菌武夷变种(Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis)产生的一种农用抗生素,对多种作物的真菌病害防治效果显著。为进一步提高武夷菌素产生菌的产量、降低其生产成本,应用SAS软件提供的Plackett-Burman设计法和响应面分析法对该菌株的发酵培养基进行优化组合,以期找到适宜武夷菌素产生菌C-75生产的最佳发酵培养基配方。应用Plackett-Burman设计法从9种培养基成分中筛选出玉米粉和碳酸钙为两个重要因素;通过响应面回归分析结果建立响应面回归模型：Y=5826.99-91.56X2-180.69X8-194.31X22 -151.25X2X8-205.31X82。回归模型预测当玉米粉和碳酸钙的含量分别为2.314 g和0.205 g（50 ml培养基装量）时,该模型能取到最大值。摇瓶发酵实验结果表明,该模型稳定点处的实际效价平均值为5837 μg/ml,菌株C-75经优化培养基发酵后的效价较之前提高了5.59%。     

应用~(60)Coγ射线诱变选育武夷菌素高产菌的研究

武夷菌素是一种广谱、高效、低毒的生物农药,对蔬菜病害及果树、粮食作物病害有着明显的防治效果。但目前生产上所用的武夷菌素产生菌的效价都相对较低,为进一步提高武夷菌素产生菌药效,降低生产成本,研究以L7为出发菌株,采用3种不同剂量(500Gy,1000Gy,1500Gy)的60Coγ射线对其进行诱变处理。通过琼脂块法初筛,从3582株突变株中选育出78株相对高产菌株进行摇瓶复筛,最终选出5株效价最高的菌株(C-28,C-42,C-64,C-75,C-76)进行遗传稳定性测定。5次传代后,结果显示,菌株C-75遗传稳定性较好,能够稳定保持高效价不变(达到5 528μl/L),较出发菌株L7(效价4112μL/L)提高了34.4%。     

高活性苎麻脱胶菌的选育

苎麻生物法脱胶是一种绿色环保的脱胶方法,具有脱胶质量稳定和不损伤纤维的特点。为了选育稳定、高活性苎麻脱胶菌,以透明圈法和摇瓶发酵法从土壤中分离初筛得到的微生物脱胶菌株(15号)作为出发菌株,采用紫外和亚硝酸复合诱变处理,以青霉素抗性为标记,对大量初筛得到的突变株进行筛选,最终选育得到4株高活性苎麻脱胶菌株。与出发菌株相比,其中U-4使木聚糖酶活提高了15.81%,果胶酶活提高了6.49%,纤维素酶活降低了37.45%,残胶率降低了16.89%。     

产菊糖酶菌株的选育及特性研究

从发霉的菊芋中分离得到菌种,用平板透明圈法筛选出2株产菊糖酶活力较高的菌株H10和Q12。经菌种形态学观察和鉴定,确定菌株H10为黑曲霉,Q12为青霉,并对其进行了发酵条件的研究。两菌株产酶的环境条件有一定差异,黑曲霉以基质含2%菊糖,初始pH值7.0,装量50mL(250mL的三角瓶中),温度28℃,转速240r/min为摇瓶发酵最适条件;青霉以基质含3%菊糖,初始pH值6.0,装量50mL(250mL的三角瓶中),温度30℃,转速240r/min为摇瓶发酵最适条件。黑曲霉和青霉产酶分别在120h和96h时达到高峰。     

2,3-丁二醇脱氢酶基因(BudC)过表达菌株的构建和初步鉴定

旨在过表达BudC进而上调2,3-丁二醇（2,3-Butanediol, 2,3-BD）的合成,通过基因工程手段构建整合载体pR1SW-BudC,经PCR和酶切双重验证后将其电转化至产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca) HD79。结果经卡那霉素筛选,获得一株菌株K. oxytoca HD79-01。以原始菌株为对照,摇瓶发酵检测2,3-BD含量和相关酶活,q RT-PCR检测BudC表达差异,最终BudC在HD79-01中转录水平的表达量为HD79的45.25倍（p<0.01）。摇瓶发酵显示2,3-BD的最高产量、转化率和生产强度分别提高了24.54%、10.97%、45.08%（分别为30.818 ± 0.003 g/L、0.253 ± 0.013 g/g、0.43 ± 0.01 g/(L·h)）,酶活提高了3.61倍(0.563 ± 0.003 U/mg)。因此,2,3-丁二醇脱氢酶基因(BudC)过表达菌株构建不仅成功的提高了2,3-BD的产量也为实现2,3-BD的工业化生产奠定基础。     

微生物转化生产木糖醇工艺研究

从土壤中筛选获得了1株木糖醇高产菌株,该菌株发酵玉米芯水解液后获得的发酵液,通过离心去除菌体,用紫外分光光度法测得木糖醇产量。采用摇瓶发酵对发酵工艺条件进行优化,通过测定发酵液中木糖的残留量、木糖醇的产量、木糖醇的转化率来确定最佳的发酵工艺。结果表明,木糖醇的产量由最初3.12g/L增加到8.79g/L,转化率由15.6%增加到43.95%;优化后,最佳培养基条件为:选用木糖质量浓度为20g/L的玉米芯水解液为碳源,质量浓度为2.5g/L的蛋白胨和2.5g/L的酵母浸膏作为氮源,质量浓度为3.0g/L的KH2PO4,4.0g/L的NaCl,0.5g/L的MgSO4·7H2O,最佳发酵条件为:摇瓶发酵装液量80mL/250mL,转速160r/min,pH值为5.0,发酵温度30℃,发酵时间44h,在此条件下,木糖醇最大产量是13.84g/L,木糖转化率达69.0%。该菌株经初步研究,显示了良好的研究潜力和应用前景。     

替考拉宁发酵工艺优化研究

为了优化替考拉宁发酵工艺,提高其发酵水平,考察发酵培养基中碳源及部分氨基酸对发酵水平的影响。通过测定替考拉宁发酵生长、代谢曲线及分析替考拉宁的结构式,在对发酵特性有初步了解的基础上进行相关方面的工艺优化。结果表明发酵培养基中增加1%的淀粉量可在提高效价的基础上同时将残糖控制在较低水平;将1%的淀粉液化后在自控罐上进行流加实验,在平衡期进行补糖,可以使发酵水平提高35%以上;摇瓶实验表明在发酵初始培养基中添加氨基酸可以使发酵水平提高16%~25%。发酵培养基中淀粉量及氨基酸成分及含量对发酵水平影响较大,在原工艺的基础上补糖及添加氨基酸可大大提高发酵水平,这为降低发酵成本打下了一定的基础。     

离子注入生物学在D110菌诱变育种中的应用研究初报

本研究采用离子注入生物学技术，进行了D110菌为出发菌的诱变选育高产谷氨酸菌种的试验研究。通过研究已经筛选到高产菌株D5221,，其产酸幅度比出发菌提高了35％，传代稳定性达到8代，10批次摇瓶发酵平均糖酸转化率可以达到43％，RG％（残糖）达到2％以下。该研究为进一步的梯次注入奠定了基础。     

枯草芽孢杆菌RSS-1菌株产生抗菌物质条件的优化

为明确枯草芽孢杆菌RSS-1菌株产生抗菌物质的最佳条件,提高其抗菌活性物质的产量,以发酵液抑制油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)活性为指标,在摇瓶条件下采用单因素和正交实验对该菌株的最适发酵培养基成分及发酵条件进行了优化。结果表明,菌株RSS-1产生抗菌物质的最佳培养基组分比例为2.0%的玉米淀粉,1.5%的蛋白胨,0.05%的MgSO_4;最佳发酵条件为培养基初始pH 6.0,培养温度为28℃,培养时间为5天,100 mL三角瓶装液量25 mL,接种量为0.1%,转速为180 r/min。优化后的枯草芽孢杆菌RSS-1菌株的无菌培养滤液对油菜菌核病菌的抑菌活性显著增强。     

剪切力对链霉菌谷氨酰胺转胺酶发酵的影响

考察了以摇瓶发酵过程中添加玻珠为剪切力,对链霉菌(Streptomyces sp.)HS-1发酵生产谷氨酰胺转胺酶的影响,在10 L发酵罐上不同搅拌转速对产酶的影响。结果显示,摇瓶发酵中,在种子阶段添加玻珠,提高剪切力不能促进产酶;在发酵阶段,加入4颗玻珠时,酶活相对最高,比对照增加20%;36 h时添加玻珠,与对照相比,酶活提高12%,菌体浓度增加40%,且氨基氮消耗明显。10 L发酵罐中,适宜的搅拌转速为250 r/min,36 h调整转速至250r/min,酶活比维持90 r/min提高21%。因此剪切力对谷氨酰胺转胺酶发酵有明显影响。     

生防细菌SY286发酵条件优化

为探讨生防细菌SY286 菌株液体发酵条件,提高其活性次级代谢产物的产量,以菌体生物量和发酵液抑制葡萄霜霉病菌(Plasmopara viticola)活性为指标,采用单因子试验和正交试验对菌株的最适发酵培养基成分及发酵条件进行优化。结果表明,菌株SY286 最适发酵培养基为葡萄糖10 g/L、牛肉膏7.5 g/L、氯化钠2.5 g/L、硝酸钾5 g/L;最佳发酵培养条件为培养温度27℃、培养时间72 h、初始pH 7.0、250 mL三角瓶装液量90 mL、接种量体积分数5%、摇床转速150 r/min。在最佳发酵培养基和培养条件下,菌株SY286发酵液抑菌率达到99.19%,抑菌能力提高6.98%。     

小叶榕抗菌活性内生菌发酵条件的优化

为了优化小叶榕抗菌活性内生菌的发酵条件，提高其发酵液生物量和抗菌物质的量。笔者采用单因子试验对小叶榕内生细菌QYPT-B01菌株发酵条件优化，确定了QYPT-B01菌株在本试验中的最优发酵条件为：玉米粉3%，豆饼粉4%，K2HPO4·3H2O 0.3%，初始pH 8.0，装液量30%，接种量1%，摇床转速160 r/min，培养温度34℃。在上述条件下培养48 h，发酵液中生物量达到峰值，测得OD值为7.95，与优化前相比较，OD值提高了52.0%（优化前OD值为5.23）。培养72 h，抗菌物质产量达到峰值，此时发酵滤液对铜绿假单胞菌的抑菌圈直径为26.42 mm，与优化前相比较，抑菌圈直径提高了13.5%（优化前抑菌圈直径为23.28 mm）。在优化的发酵条件下，QYPT-B01菌株发酵液的生物量和抗菌物质的量均有明显增多，为后续分离纯化、鉴定其发酵滤液中的抗菌物质，探究其抑菌机制，开发生防菌剂或新型抗生素奠定基础。     

产紫丁香苷内生真菌CJ7的鉴定及发酵条件研究

为高效利用刺五加内生真菌资源,推动紫丁香苷的生产,采用HPLC法,以紫丁香苷为对照,分析内生真菌CJ7的次生代谢产物;采用琼脂糖扩散法,对内生真菌CJ7进行抑菌活性分析,并采用单因素实验及正交实验法对内生真菌CJ7发酵条件进行优选;采用形态学观察及ITS序列分析法对内生真菌CJ7进行菌种鉴定。结果表明,在内生真菌CJ7发酵液中含有紫丁香苷。抑菌活性实验结果表明,内生真菌CJ7对10种致病菌均有较好的抑制作用,尤其对金黄色葡萄球菌抑菌效果较为明显。经优化,CJ7的最佳发酵工艺为培养基中葡萄糖质量浓度2.5%,牛肉膏质量浓度2.0%,初始pH 7.0,装液量40%,接种量2%,培养8天,摇床转数120 r/min,发酵温度28℃。经鉴定,内生真菌CJ7为产烟曲霉(Aspergillus fumigatus)。上述研究说明,内生真菌CJ7为紫丁香苷产生菌。研究结果可为采用微生物发酵法生产紫丁香苷提供参考。     

响应面法对解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)12-7产抗菌蛋白条件的优化

解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)12-7是从发病棉田土壤中分离得到的1株生防细菌,其对棉花黄萎病致病菌大丽轮枝菌Verticillium dahliae Kleb.V190具有明显的拮抗作用,已证明其抗菌物质为蛋白质。采用响应面法对该生防菌株的产抗菌蛋白条件进行优化,以期为棉花黄萎病生物农药的研制开发以及抗菌蛋白的后续研究奠定基础。以发酵液上清液对大丽轮枝菌的抑菌圈面积为考察指标,首先采用单因子试验考察培养时间、温度、初始pH、碳源、氮源、无机盐等因素对菌株12-7发酵产抗菌蛋白的影响;再根据响应面分析法的基本原理和方法,对发酵条件进行优化。得出该菌株产抗菌蛋白的最优发酵培养基和培养条件为:1.5%(质量分数)蔗糖、1.5%(质量分数)大豆蛋白胨、0.3%(质量分数)NaCl、0.1%(质量分数)K2HPO4、初始p H7.3的培养基,31℃发酵培养60 h。优化后抑菌圈面积从试验设计初期的171.95 mm2提高至320.3 mm2,且经过验证试验证实预测值与实际值之间具有较好的拟合度。     

奶牛粪便酶解混合菌群的构建及产酶条件研究

为了确立酶解混合菌群的最佳培养条件,达到最好的降解效果,有效利用奶牛粪便。以筛选的几株菌株构建酶解混合菌群并研究其产酶条件。结果表明：F3-F9组合的纤维素降解率达到44.02%,比单一菌株提高了12.47%。温度、培养时间、起始pH值、培养基固液比、添加麸皮和氮源等因素都会对产酶有较大影响。在培养基中添加0.1%尿素,固液比为1:2,接种量为5%,起始pH 7,培养基中添加0.1%的尿素和40%的麸皮,温度为24℃,培养3天时,F3-F9混合菌株滤纸酶活和CMC酶活分别达到相对较高的值,分别为114.25 U和1617.92 U。     

解淀粉芽孢杆菌菌株P-r21抑菌广谱性及对番茄灰霉病的防治

为明确内生解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株P-r21的抑菌广谱性及对番茄灰霉病的防治效果,本研究优化了菌株P-r21发酵条件,利用平板对峙法测定了该菌株对6种病原菌的抑菌活性及对番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)孢子萌发的抑制作用,并通过离体接种试验研究了对番茄灰霉病的防效。结果表明：菌株P-r21最佳发酵条件为在PYJ中培养初始pH 6.0,培养时间为12 h。菌株P-r21对供试的6种植物病原菌(Botrytis cinerea、Fusarium proliferatum、Rhizoctonia cerealis、Gaeumannomyces graminis、Fusarium graminearum、Colletotrichum karstii)的生长均表现出抑制作用;对C. karstii和B.cinerea抑制作用最强,抑菌率达到88.0%和84.5%。发酵滤液对B. cinerea孢子萌发抑制率达80.6%,对叶片和果实灰霉病的防效达到100%和80.0%;发酵液10倍稀释后防效也可达到67.1%和60.7%。本研究明...     

盾壳霉固态发酵基质筛选和发酵条件优化

为了探索盾壳霉固体发酵的条件,提高其生防效果,比较了6种天然培养基对盾壳霉固体发酵的影响,测定了在不同发酵培养基、温度、初始湿度、接种比例条件下盾壳霉的产孢量。结果表明：盾壳霉在麦粒和谷粒培养基上产孢量最大;而在麸皮和棉籽培养基上生长和产孢也较好,且成本低,成为后续试验的发酵材料。在含麦麸、棉籽壳及无机盐的培养料作为基质时,采用温度为20℃,发酵料初始湿度为60%,接种比例为7%,最终孢子含量可达109个/g以上。同时对发酵的条件做了进一步优化,发现麦粒与谷粒的混合比例、光照条件、甘露糖和甘氨酸含量对盾壳霉产孢量的影响较大。     

响应面法优化木糖发酵产乙醇酵母发酵条件的研究

以诱变筛选的季也蒙毕赤酵母突变菌株C3-10为研究对象,对其发酵培养条件进行研究。采用响应面法研究了木糖发酵产乙醇酵母突变株不同温度、起始pH值、接种量的影响。结果表明,最佳发酵条件为:温度29℃,起始pH值5.6,接种量5%,在此优化条件下乙醇产量达到15.01%。     

天麻发酵酒的研制

以干天麻为原料,经超微粉碎、微波辅助浸提、菌种驯化、发酵、澄清等工艺制得天麻发酵酒,试验结果表明,主发酵的最佳工艺参数为:驯化酒母添加量10%,初始pH值4.5,天麻粉的添加量为2%,主发酵温度为30℃,主发酵时间为9 d;陈酿结束后,添加质量浓度2 mg/mL的硅藻土澄清效果相对最好。