ptsG基因敲除对肺炎克雷伯氏菌CCR效应的缓解及发酵产2,3-BD的影响

旨在解决Klebsiella pneumoniae在利用混合碳源发酵生产2,3-丁二醇（2,3-butanediol,简称2,3-BD）时会产生碳分解代谢抑制(Carbon catabolite repression,CCR)效应,导致生产效率下降的问题。本研究以Cm抗性基因为标记,采用λRed同源重组技术成功构建ptsG基因缺失菌株K. pneumoniae HD79-N。此外,在利用葡萄糖与木糖混合碳源（葡萄糖:木糖=2:1）发酵的结果显示,K. pneumoniae HD79-N菌株由于敲除ptsG基因显著减弱了CCR效应,使其能够同步利用葡萄糖与木糖生产2,3-BD且最终产量达9.81±0.38 g/L。同时,K. pneumoniae HD79-N[0.23±0.01 g/(L·h)]菌株木糖利用率也比K. pneumoniae HD79[0.15±0.00 g/(L·h)]菌株提高了57.82%。本研究结果为缓解ptsG基因对K. pneumoniae菌株的CCR作用及提升2,3-BD的产量提供技术参考。     

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)WBG3菌株发酵特性研究

通过对酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)WBG3进行菌株发酵特性的研究,旨在获得一株性能良好的2,3-丁二醇(2,3-BD)生产菌株。本研究采用摇瓶发酵法,改变发酵过程中的底物浓度、溶氧量和酸碱浓度,紫外分光光度法和高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)检测2,3-BD合成途径中关键中间产物(丙酮酸、α-乙酰乳酸、乙偶姻)含量和发酵产物浓度。结果表明:S. cerevisiae WBG3菌株生长良好,在80 g/L葡萄糖、30℃和200 r/min条件下,丙酮酸、α-乙酰乳酸和乙偶姻含量分别达到0.10±0.03 g/L、3.38±0.06 g/L和0.17±0.02 g/L,乙醇转化率最低为0.44±0.02 g/g。添加乙酸后,甘油产量和乙醇转化率分别较对照组降低了9.5%和10%,2,3-BD的最终产量为0.36±0.02 g/L。因此,S. cerevisiae WBG3具备生产2,3-BD的潜力。     

单倍体酿酒酵母的丙酮酸脱羧酶基因(pdc1)的敲除与鉴定

为了抑制单倍体酿酒酵母H14的副产物乙醇的合成,使得2,3-丁二醇产量的提升。利用基因工程手段构建载体pWCL-pdc1,获得两端含40 bp pdc1的同源重组片段-loxP-kanMX-loxP。利用Cre/loxP技术获得pdc1缺失菌株S. cerevisiae H14-01 (△pdc1)。并以野生型菌株S. cerevisiae H14为对照,进行摇瓶发酵试验。S. cerevisiae H14-01长势明显略低于原始菌株。在整个发酵期间,2,3-丁二醇的最高产量和转化率分别为0.373±0.016 g/L和0.005 g/g,分别较原始菌株提高了37.30%和4.66%,但原始菌株没有检测到乙偶姻和2,3-BD生成。另外S. cerevisiae H14-01的乙醇转化率降低了33.24%,但甘油产量提高了15.76%。说明了碳流流向乙醇被阻断之后,会增加2,3-丁二醇的产量,同时会使此部分碳流流向甘油。因此,并为进一步获得高产2,3-丁二醇的工程微生物群体奠定了基础。     

外源添加乙偶姻对酿酒酵母产2,3-丁二醇及其菌株的影响

通过对菌株发酵特性的研究,旨在获得一株性能良好的2,3-丁二醇(2,3-BD)生产菌株。本研究以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)W5/W5-$\Delta$pdc1/W5-$\Delta$pdc5/W141四株菌株为试材,利用高效液相色谱法(HPLC)对乙偶姻产量和BDH酶活进行检测,从而挑选出最适合作为产2,3-BD出发菌株,并外源添加不同浓度的乙偶姻,测定乙偶姻、葡萄糖和2,3-BD产量随发酵时间的变化情况。结果表明：S. cerevisiae W5与S. cerevisiae W141最适合作为产2,3-BD出发菌株,且S. cerevisiae W5最适添加量为12 g/L乙偶姻,且72 h时,2,3-BD的产量最大达到2.49 ± 0.02 g/L;S. cerevisiae W141最适添加量为8 g/L乙偶姻,且72 h时,2,3-BD的产量最大达到1.56 ± 0.04 g/L,外源添加乙偶姻后菌株生长状况良好,并且二者产生的乙偶姻在发酵结束前消耗完全,同时在24 h左右,二者产生的葡萄糖也均基本耗尽。这为研究和利用2,3-BD等可再生资源提供了思路,也为利用S. cerevisiae生产2,3-BD奠定了理论基础。     

外源添加乙偶姻对酿酒酵母W5/W141产2,3-丁二醇的影响

本研究旨在获得一株性能良好的2,3-丁二醇(2,3-BD)生产菌株。向酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) W5/W141两株产2,3-BD菌株中添加不同浓度乙偶姻,并测定2,3-BD、乙醇和甘油产量随发酵时间的变化情况。S. cerevisiae W5最适乙偶姻添加浓度为12 g/L,且2,3-BD的产量在72 h达到最大,产量为2.54±0.03 g/L,甘油和乙醇转化率分别较未添加时下降了17.6%和23.6%。S. cerevisiae W141最适乙偶姻添加浓度为10 g/L,且2,3-BD的产量在72 h达到最大,产量为1.71±0.02 g/L,甘油和乙醇转化率分别较未添加时下降了57.1%和16.7%。通过对比,本课题最终选用S. cerevisiae W5作为最适菌株,为微生物发酵法生产2,3-BD提供新的资源。     

乙酰乳酸合成酶基因(budB)整合表达载体的构建

为了进一步了解2,3-丁二醇合成路径中关键酶的表达量与产量之间的关系,本研究根据Gen Bank中乙酰乳酸合成酶基因(bud B)的基因序列设计引物,以产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)HD79基因组DNA为模板,通过PCR扩增技术得到目标酶基因,目的片段全长1680 bp。以表达载体p RSFDuet-1为骨架,利用基因工程手段构建整合表达载体p R1SW-bud B。电转化法将其转化至菌株HD79感受态细胞中,通过高浓度Kan筛选和PCR双重鉴定验证后测定ALS酶活力。结果表明,乙酰乳酸合成酶基因整合表达载体构建成功,酶活可达1.0627 U/mg,比原始菌株提高了4.35倍。在一定程度上为实现2,3-丁二醇的工业化生产奠定基础。     

外源添加乙酸对酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)产2,3-丁二醇影响初探

为验证乙酸作为信号分子的作用,本研究分别将酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)W141上清液(对照组)、W141-07 (△aldh6)上清液及1.5 g/L乙酸添加至对数生长期的W141发酵液中,检测2,3-BD产量、乙酰乳酸合成酶(ILV2)及2,3-丁二醇脱氢酶(BDH1)酶活。结果表明:当添加1.5 g/L乙酸时,2,3-BD产量、ILV2和BDH1酶活性均达到最高,分别为3.01±0.04 g/L、1.41±0.03 U/mg和0.12±0.002 U/mg,且较其余两组相比差异极显著(P0.01)。同时,测定3组条件下ilv2(24 h)和bdh1(60 h)基因的表达情况时发现,添加W141-07上清液后,ilv2和bdh1基因的表达量分别下调了31.6%和25.0%;而添加1.5 g/L乙酸后,ilv2和bdh1的表达量均发生上调,分别是对照组的4.38及1.24倍。表明乙酸可作为信号分子驱动相关基因的表达,进而提高2,3-BD产量。     

高产2,3-丁二醇的潜在酿酒酵母菌株筛选

为了获得潜在高产2,3-丁二醇的酿酒酵母菌株,探究不同菌株生产2,3-丁二醇的潜力。通过对不同供试菌株进行形态观察、产物耐受性检测、关键酶活测定、乙偶姻产量以及发酵试验,筛选出一株生产2,3-丁二醇最有潜力的菌株酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)W141。结果表明,发现W141菌株生长迅速,能分别耐受13%(w/v)乙醇和0.8%(w/v)乙酸,具有较高的乙醇得率(0.593 g/g)和碳源利用率（发酵24 h葡萄糖消耗率为100%）,关键酶α-ALS、BDH的酶活力较高,分别是0.046 U/mg和0.040 U/mg,2,3-丁二醇途径关键中间产物乙偶姻含量较高,可达0.246 g/L。说明该菌株在发酵工业中具有一定的改造空间和应用前景。     

Klebisella oxytoca HD79乙酸激酶部分基因(ack)的克隆与序列分析

乙酸是2,3-丁二醇典型代谢途径中的主要副产物之一,它的大量生成能够造成环境p H值的改变并且抑制菌体的生长,并对2,3-丁二醇的代谢产生影响。乙酸激酶是乙酸生成的关键酶,敲除其相关基因,理论上可以减少乃至消除乙酸的产生,从而提高2,3-丁二醇的产量和得率。本研究根据Klebisella oxytoca KCTC1686和Klebisella oxytoca HD79乙酸激酶基因ack序列的相似性设计引物,以产酸克雷伯氏菌基因组DNA和质粒载体p T-ack为模板,利用PCR克隆得到了乙酸激酶部分基因ack,长度为856bp,无碱基缺失。ORF分析发现该部分基因没有完整的开放阅读框,但是全部位于Klebisella oxytoca KCTC1686 ack基因的开放阅读框内。结果表明该片段为Klebisella oxytoca HD79乙酸激酶部分基因序列,为后续构建产酸克雷伯氏菌乙酸激酶突变株奠定了基础。     

诱变选育GOD酶活力高的黑曲霉菌株

以黑曲霉UCD69菌株为原始菌株,酶活为25.8μ/g,经过一次紫外诱变,筛选出UCD-69-4菌株,酶活为46.7μ/g,UCD-69-4菌株再经过一次γ-射线诱变,筛选出UC-19菌株,酶活为77.6μ/g. 通过实验,确定了几个影响菌体生长和产GOD的主要因素水平,其最适培养条件为旦白胨(动物)0.3%,蔗糖10%,MgSO_4·7H_2O0.01%,(NH_4)_2HPO_40.04%,在每个500ml三角瓶中装入100ml培养液,接种孢子量以200～300万个为宜,摇瓶培养32.5小时左右,温度30℃.     

枯草芽孢杆菌RSS-1菌株产生抗菌物质条件的优化

为明确枯草芽孢杆菌RSS-1菌株产生抗菌物质的最佳条件,提高其抗菌活性物质的产量,以发酵液抑制油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)活性为指标,在摇瓶条件下采用单因素和正交实验对该菌株的最适发酵培养基成分及发酵条件进行了优化。结果表明,菌株RSS-1产生抗菌物质的最佳培养基组分比例为2.0%的玉米淀粉,1.5%的蛋白胨,0.05%的MgSO_4;最佳发酵条件为培养基初始pH 6.0,培养温度为28℃,培养时间为5天,100 mL三角瓶装液量25 mL,接种量为0.1%,转速为180 r/min。优化后的枯草芽孢杆菌RSS-1菌株的无菌培养滤液对油菜菌核病菌的抑菌活性显著增强。     

土霉素菌种的自然分离 纯化及鉴定

以土霉素产生菌龟裂链霉菌(Streptomycesrimosus)D-7号为出发菌株,经自然分离,纯化处理后,再经摇瓶初筛、复筛获得高效价菌株10号,其摇瓶效价提高12.6%。经传代实验表明,该高产菌株遗传性能较为稳定。在15m罐上生产试验,与出发菌株相比,发酵效价提高7.18%,发酵总亿提高5.48%。3     

纤维素降解菌LY16的筛选鉴定和产酶条件研究

从腐烂朽木及附近的土壤采样,分离到25株具有纤维素分解能力的菌株,其中LY16菌株的纤维素酶活最高.采用形态学观察及分子生物学方法初步鉴定其为里氏木霉(Trichoderma reesei).通过碳氮源优化等试验进行产酶条件研究,得出该菌株最佳的产酶条件,培养基配方为(g/L):微晶纤维素10,麸皮40,蛋白胨4,尿素12,KH_2PO_42,MgSO_4·7H_2O 1,CaCl_2·2H_2O 1,FeSO_4 0.01,MnSO_4 0.004 5,CoCl_2 0.003 6,ZnSO_4 0.0035,培养温度30℃、装液量50mL,转速200 r/min,培养时间为72 h.优化后在该条件下,CMC酶活为202.6 U/mL,FPA酶活最大53.2 U/mL.     

农用抗寄生虫抗生素尼莫克汀发酵工艺的初步研究

为优化蓝灰链霉菌产尼莫克汀的发酵工艺。通过摇瓶法对其发酵条件进行了初步研究,采用单因素分析法,考察了时间、温度、溶氧及接种量对蓝灰链霉菌发酵产尼莫克汀的影响。结果表明：菌龄为8天的蓝灰链霉菌孢子适用于制种,并以甘油管法低温保存建成工作细胞库,但保存时间应不超过2个月;将工作细胞库中的菌种接入种子培养基中,置于28℃培养28 h,种子质量较好。摇瓶发酵的较优条件是容量为250 mL的三角瓶中装有发酵培养基50 mL,以5 %的比例加入培养好的种子液,将发酵瓶置于25℃以250 r/min的转速发酵8天,尼莫克汀产量可达164.90 μg/mL。     

大丽轮枝菌拮抗细菌B.subtilis LZ2-70产芽孢条件优化

 为了提高大丽轮枝菌（Verticillium dahilae Kleb.）拮抗细菌枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis LZ2-70菌株的芽孢形成率及芽孢数量,在摇瓶发酵基础上对影响该菌芽孢形成的主要因素进行了考察。通过单因素试验确定了最佳的碳源、氮源和无机盐等,通过正交试验研究了培养基最佳浓度和组合,以及种龄、接种量、培养液初始pH和培养时间等发酵条件。摇瓶发酵生产芽孢的最佳条件为:0.5% 麦芽糖、2% 黄豆饼粉、0.05% KH₂PO₄和0.1% MnSO₄·H₂O、培养液初始pH值8.0、种龄24 h、装瓶量30 mL/ 250 mL 、接种量10%、发酵时间48 h、培养温度为30 ℃、摇床转速为200 r·min^-1。在此优化条件下,发酵液中LZ2-70菌株的芽孢数量达到6.6×10⁹ 个·mL^-1,芽孢形成率为98.94%。