棉花黄萎病拮抗细菌筛选与B-1O1菌株抗菌蛋白分离

棉花黄萎病（Cotton Verticillium wilt）是由大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）侵染引起的真菌性维管束系统病害,因该菌菌丝体产生的大量微菌核在土壤中存活时间长,寄主广泛,传播途径多,使得化学防治非常困难,且化学防治方法易污染环境、破坏生态平衡;另外病菌变异快,很难培育高抗病品系,且抗病品种存在选育年限长、抗性单一、有时农艺性状不如感病品种等问题。因此,采用基因工程手段向优良作物品种导入外源抗性基因,为抗病育种开辟了新的途径,达到这一目标的关键是分离有效的目的基因。     

大丽轮枝菌拮抗细菌枯草芽孢杆菌8-28菌株产芽孢条件优化

为提高大丽轮枝菌(Verticillium dahilae Kleb)拮抗细菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)8-28菌株的芽孢形成率及芽孢数量,在摇瓶发酵基础上对影响菌株芽孢形成主要因素进行研究.通过单因素试验确定最佳碳源麦芽糊精、氮源黄豆饼粉、无机盐K2HPO4和MuSO4·H2O;采用正交试验对发酵培养基进行优化,摇瓶发酵生产芽孢的最佳条件为:麦芽糊精2.0%、黄豆饼粉2.0%、K2HPO40.05%和MnSO4·H2O0.01%、培养液初始pH值为7.0、种龄18 h、装瓶量50mL·(250mL)-1.在此优化条件下,发酵液中8-28茸株的芽孢微量迭到2.67×1 08个·mL-1.芽孢形成率迭到90%.     

顶头孢霉原生质体制备、再生及带vgb基因的质粒DNA转化条件的研究

对头孢菌素C的工业生产菌种顶头孢霉(Cephalosporium acremonium)原生质体形成和再生条件进行了研究。优化后的制备及再生条件为:在蛋白胨固体培养基上培养110~120 h的菌丝体,30℃条件下经1%蜗牛酶和1%纤维素酶混合液酶解3.5 h,原生质体得率最高可达2.377×107个/mL;在以KC(0.6 mol/L KCl+25mmol/L CaCl2.2H2O)为渗透压稳定剂的再生培养基上进行培养,再生率可达40%。用pMK4-LV质粒通过电击法对原生质体进行转化,成功得到了重组子,转化率约为10个转化子/μg质粒DNA。转化子的PCR鉴定结果表明,外源基因已转入顶头孢霉基因组。     

解淀粉芽孢杆菌复合菌剂对玉米秸秆的降解作用及表征

为获得能提高秸秆饲草品质的微生物发酵菌剂,本研究在前期获得2株具有木质素和纤维素降解能力的解淀粉芽孢杆菌菌株的基础上,将两者混配成复合菌剂,考察复合菌剂对玉米秸秆的降解作用,并通过傅立叶红外光谱(FTIR)、核磁共振氢谱(¹H-NMR)、扫描电镜(SEM)及气质联用色谱(GC/MS)等技术对玉米秸秆的微观结构及降解产物进行表征。研究发现,复合菌剂可以有效降解玉米秸秆中的木质纤维素。在发酵24 d时,玉米秸秆中木质素、纤维素和半纤维素的降解率分别达到48.4%,30.5%和41.4%。FTIR和¹H-NMR谱图中能观察到木质纤维素分子结构中主要连接共价键,如木质素单体间的β-O-4和β-β键、木质素与碳水化合物连接键以及碳水化合物中糖环内的价键等明显断裂,木质纤维素被部分降解;SEM扫描电镜图则显示发酵后秸秆的组织结构出现松散和破坏。发酵后秸秆中小分子物质的GC/MS分析结果显示,其中包含苯丙胺和苯丙酸等保留苯丙烷结构单元的木质素单体衍生物以及苄醇和苯甲酸酯类等木质素单体被进一步降解后的芳香族化合物。玉米秸秆中碳水化合物的GC/MS分析结果表明:复合菌剂可将玉米秸秆中的结构性多糖等大分子碳水化合物降解成葡萄糖、木糖、甘露糖及乳糖等还原性单糖。并利用这些还原性单糖生长代谢,进一步产生乙二醇、丙三醇及短链脂肪酸类等代谢产物。以上研究结果表明,解淀粉芽孢杆菌复合菌剂可有效降解玉米秸秆中的木质纤维素,在玉米秸秆饲草化利用中极具应用前景。     

发酵玉米秸秆对獭兔生长性能的影响及其促生长机理的研究

试验旨在研究经复合菌剂发酵后的玉米秸秆粗饲料对獭兔的促生长效果。用以发酵玉米秸秆为主要粗饲料配制的日粮饲喂獭兔,从试兔生长性能、肠道菌群结构、消化酶活力的变化来揭示发酵玉米秸秆对獭兔生长的影响。选择体况良好,9周龄、体重（1.90±0.14） kg獭兔150只,将其分为对照组（饲喂常规基础日粮）和试验组（发酵玉米秸秆为主要粗饲料的日粮）,预试期10 d,正试期30 d。结果显示,与对照组相比,试验组獭兔平均日增重（ADG）提高了14.60%（P<0.05）,料重比（F/G）降低了10.50%（P<0.05）;盲肠内容物中大肠杆菌数量降低了46.13%（P<0.01）,乳酸菌、双歧杆菌、芽孢杆菌数量分别提高了30.64%（P<0.05）、29.27%（P>0.05）和39.23%（P<0.01）;盲肠中蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、葡聚糖酶活力较对照组分别提高了23.20%（P<0.05）、32.96%（P<0.05）和12.63%（P<0.01）、21.09%（P<0.05）。综合以上结果,发酵玉米秸秆可促进獭兔生长,改善肠道微生态环境。试验结果可为发酵玉米秸秆在獭兔中的应用提供理论基础。     

产芽孢木质素降解菌MN-8的筛选及其对木质素的降解

【目的】分离、筛选产芽孢的高效木质素降解细菌,并进一步研究其对木质素的降解作用,为木质素微生物降解规模化应用提供理论依据。【方法】采用苯胺蓝（Azure-B）变色圈法,结合木质素降解酶活力测定从牛粪中分离筛选出产芽孢的木质素降解菌。通过形态特征观察、生理生化试验、16S rDNA以及gyrB序列分析对其中活性最强的菌株进行种属鉴定。利用菌株进行玉米秸秆堆积发酵,监测发酵过程中木质素过氧化物酶（LiP）酶活力、锰过氧化酶（MnP）酶活力以及玉米秸秆中木质素含量的变化,考察菌株对玉米秸秆木质素的降解作用。利用气相色谱-质谱联用（GC/MS）方法对菌株发酵后玉米秸秆中的木质素降解产物进行分析,推测菌株对木质素的降解机制。【结果】分离筛选到一株活性较高的产芽孢的木质素降解细菌MN-8,经形态特征观察、生理生化试验以及16S rDNA序列分析,鉴定菌株MN-8属于芽孢杆菌属（Bacillus）。利用16S rDNA序列分析发现MN-8菌株与地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）和解淀粉芽孢杆菌（B. amyloliquefaciens）同源性均高于99%。而基于gyrB序列构建的系统发育树显示,该菌株与解淀粉芽孢杆菌同源性最高,为99%。因此确定MN-8菌株为解淀粉芽孢杆菌。在玉米秸秆堆积发酵16 d后木质素降解率可达24%;发酵的6-8 d及10-12 d 两个阶段内,分别出现MnP酶活力及LiP的产酶高峰期,相对应两个阶段内秸秆木质素的降解最为显著;GC/MS分析显示菌株MN-8可将玉米秸秆中木质素降解成4-羟基-3,5二甲氧基苯乙酮等芳香族类化合物及短链脂肪酸类等小分子物质。【结论】高效木质素降解菌解淀粉芽孢杆菌MN-8可以通过断裂木质素单体之间的连接键β-O-4,高效降解秸秆木质素成为小分子芳香族化合物等物质,且其对秸秆木质素的降解依赖于LiP及MnP的产生。     

高活性木质素降解菌株T-8的分离、筛选与鉴定

为了筛选对木质素有降解能力的菌株,本试验从菜地土壤、动物粪便、青贮饲料中分离筛选出79株产芽孢细菌,初筛获得具有木质素降解能力的菌株20株,经过复筛,筛选出一株具有较高木质素降解能力的菌株T-8,其木质素过氧化物酶酶活为626.67 U/L。对T-8进行形态鉴定、生理生化特征鉴定和16S rDNA序列分析,鉴定该菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens),其与B. amyloliquefaciens的相似性高达99.91%。     

大黄中大黄素提取条件的优化

为确立大黄素的最佳提取工艺,本研究采用紫外分光光度法测定大黄素的纯度,并以大黄素的产量为指标,通过单因素试验从4种常规溶剂中确定出1种对大黄素提取效果最佳的溶剂,再采用正交试验对影响大黄素提取工艺的因素——提取溶剂的用量、所加入的酸水量、提取温度及时间4个水平进行了研究。结果表明:最佳提取条件为:大黄粉∶苯∶20%硫酸=1∶6∶1(m∶v∶v),提取3次,每次3 h,提取温度为65℃。     

兰花炭疽病颉颃细菌Z-62的发酵条件优化

通过单因素试验和正交试验确定了兰花炭疽病颉颃细茵的最佳发酵条件为:葡萄糖3%、大豆蛋白胨3%、FeSO4·7H2O 0.05%、KCl 0.05%、种龄20 h、培养基初始pH值为6.0、250 mL三角瓶装液量30 mL、接种量4%、发酵时间60 h.在该条件下培养得到的发酵液抑菌圈直径可达26,28min,抑菌活性提高了29.4%.     

棉花黄萎病拮抗细菌DS45-2菌株抗菌蛋白的分离纯化

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) DS45-2菌株产生的抗菌蛋白对棉花黄萎病有较强的抗性。用NB培养基摇床振荡培养DS45-2菌株(30℃,180r/min,48h),发酵液经硫酸铵盐析得到抗菌蛋白。经分析,抗菌蛋白对热稳定;对胃蛋白酶、胰蛋白酶均不敏感,对蛋白酶K部分敏感;在碱性条件下稳定,酸性条件下抑菌活性减弱。抗菌蛋白经DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析和反相层析后,分离纯化出一个抗菌蛋白0组分,经SDS-PAGE检测分子.质量约为23 kDa。