2,3-丁二醇脱氢酶基因(BudC)过表达菌株的构建和初步鉴定

旨在过表达BudC进而上调2,3-丁二醇（2,3-Butanediol, 2,3-BD）的合成,通过基因工程手段构建整合载体pR1SW-BudC,经PCR和酶切双重验证后将其电转化至产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca) HD79。结果经卡那霉素筛选,获得一株菌株K. oxytoca HD79-01。以原始菌株为对照,摇瓶发酵检测2,3-BD含量和相关酶活,q RT-PCR检测BudC表达差异,最终BudC在HD79-01中转录水平的表达量为HD79的45.25倍（p<0.01）。摇瓶发酵显示2,3-BD的最高产量、转化率和生产强度分别提高了24.54%、10.97%、45.08%（分别为30.818 ± 0.003 g/L、0.253 ± 0.013 g/g、0.43 ± 0.01 g/(L·h)）,酶活提高了3.61倍(0.563 ± 0.003 U/mg)。因此,2,3-丁二醇脱氢酶基因(BudC)过表达菌株构建不仅成功的提高了2,3-BD的产量也为实现2,3-BD的工业化生产奠定基础。     

枯草芽孢杆菌α-乙酰乳酸脱羧酶基因(alsD)的克隆和生物信息学分析

[目的]α-乙酰乳酸脱羧酶是2,3-丁二醇生物合成途径的关键酶之一,利用生物信息学方法对α-乙酰乳酸脱羧酶基因(alsD)进行分析。[方法]根据GenBank中α-乙酰乳酸脱羧酶基因(alsD)的基因序列设计引物,以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CICC10026基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到Bacillus subtilis CICC10026基因片段alsD。对该片段进行序列测定,利用生物信息学分析软件对该序列进行同源性分析、二级结构和功能性分析及3D 结构预测等。[结果] 结果表明,获得的alsD片段为768bp,未发生碱基突变,该片段为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CICC10026的α-乙酰乳酸脱羧酶基因(alsD)的基因序列。[结论]本研究结果为构建产2,3-丁二醇的工程菌株奠定了理论基础。     

Klebisella oxytoca HD79乙酸激酶部分基因(ack)的克隆与序列分析

乙酸是2,3-丁二醇典型代谢途径中的主要副产物之一,它的大量生成能够造成环境p H值的改变并且抑制菌体的生长,并对2,3-丁二醇的代谢产生影响。乙酸激酶是乙酸生成的关键酶,敲除其相关基因,理论上可以减少乃至消除乙酸的产生,从而提高2,3-丁二醇的产量和得率。本研究根据Klebisella oxytoca KCTC1686和Klebisella oxytoca HD79乙酸激酶基因ack序列的相似性设计引物,以产酸克雷伯氏菌基因组DNA和质粒载体p T-ack为模板,利用PCR克隆得到了乙酸激酶部分基因ack,长度为856bp,无碱基缺失。ORF分析发现该部分基因没有完整的开放阅读框,但是全部位于Klebisella oxytoca KCTC1686 ack基因的开放阅读框内。结果表明该片段为Klebisella oxytoca HD79乙酸激酶部分基因序列,为后续构建产酸克雷伯氏菌乙酸激酶突变株奠定了基础。     

ptsG基因敲除对肺炎克雷伯氏菌CCR效应的缓解及发酵产2,3-BD的影响

旨在解决Klebsiella pneumoniae在利用混合碳源发酵生产2,3-丁二醇（2,3-butanediol,简称2,3-BD）时会产生碳分解代谢抑制(Carbon catabolite repression,CCR)效应,导致生产效率下降的问题。本研究以Cm抗性基因为标记,采用λRed同源重组技术成功构建ptsG基因缺失菌株K. pneumoniae HD79-N。此外,在利用葡萄糖与木糖混合碳源（葡萄糖:木糖=2:1）发酵的结果显示,K. pneumoniae HD79-N菌株由于敲除ptsG基因显著减弱了CCR效应,使其能够同步利用葡萄糖与木糖生产2,3-BD且最终产量达9.81±0.38 g/L。同时,K. pneumoniae HD79-N[0.23±0.01 g/(L·h)]菌株木糖利用率也比K. pneumoniae HD79[0.15±0.00 g/(L·h)]菌株提高了57.82%。本研究结果为缓解ptsG基因对K. pneumoniae菌株的CCR作用及提升2,3-BD的产量提供技术参考。     

CRISPR/Cas9技术敲除酿酒酵母gpd2基因对产2,3-丁二醇的影响

旨在利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除酿酒酵母甘油-3-磷酸脱氢酶基因(gpd2),探究其对2,3-丁二醇产量的影响。根据酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)W5甘油-3-磷酸脱氢酶基因(gpd2)设计供体片段及gRNA片段,将gRNA片段与可表达Cas9蛋白的敲除载体相连,之后将重组质粒及供体DNA片段转化到S. cerevisiae W5细胞中,根据表型筛选及PCR验证获得gpd2基因缺失菌株。结果表明目的基因gpd2敲除成功,基因缺失菌株与原始菌株经发酵实验相比,甘油产量下降22.01%,乙醇产量提高24.65%,2,3-丁二醇产量下降10.60%。gpd2基因的敲除并没有提高2,3-丁二醇的产量,原因可能是逐渐积累的NADH会优先被细胞内大量的乙醇脱氢酶所氧化,作用于乙醇的产生,而不是优先作用于2,3-丁二醇的合成。本实验构建了适用于酿酒酵母的基因敲除系统,该系统对进一步探究酿酒酵母其他代谢产物与2,3-丁二醇合成之间的关系具有实际的借鉴意义。     

阴沟肠杆菌乳酸脱氢酶基因缺失突变株的构建及其生物学特性

旨在应用自杀质粒重组技术,构建阴沟肠杆菌乳酸脱氢酶突变株,为进一步提高乙偶姻的产量和扩大菌株选择范围奠定基础。利用双酶切的方法将同源片段插入到自杀质粒pKR6K中,构建出ldh基因敲除质粒,然后利用细菌接合的方法敲除E. cloacae的ldh基因。成功克隆出两段E. cloacae乳酸脱氢酶基因的同源序列,长度分别为526 bp,通过序列比对分析,E. cloacae乳酸脱氢酶基因序列相似性为100%。通过对E. cloacae进行乳酸脱氢酶基因的敲除,成功构建一株ldh缺失重组菌株E. cloacae△ldh,同时2,3-丁二醇提高6.8%,乙酸提高了24.3%。E. cloacae乳酸脱氢酶缺失工程菌株构建成功,对利用微生物法工业化生产乙偶姻奠定基础。     

木霉双价基因表达载体的构建

利用几丁质酶基因和β-1,4-葡聚糖酶基因构建双价基因表达载体,为木霉转化奠定基础。利用限制性内切酶酶切得到目的基因片段,通过T4 DNA ligase将基因插入表达框中,并采用PCR、酶切和核苷酸序列分析验证双价基因表达载体的正确性。利用启动子CaMV35S和终止子PolyA构建几丁质酶基因chi42的表达框,获得表达载体pC1302-C42;利用启动子CaMV35S和终止子Nos构建β-1,4-葡聚糖酶基因glu14的表达框,获得表达载体pC1300-2-G14;在单基因表达载体的基础上,通过串联构建双价基因表达载体pC1300-2-G14-C42,该表达载体含有潮霉素B抗性基因。经检测证实表达元件35S-chi42- PolyA和35S-glu14-Nos连接成功。得到的双价基因表达载体pC1300-2-G14-C42可直接用于木霉等丝状真菌的遗传转化,为构建木霉广谱高效工程菌株奠定基础。     

海藻糖-6-磷酸合成酶基因的序列优化与表达研究（英文）

为了获得一个优良的玉米抗旱育种基因资源,借助于生物信息学手段和分子生物学实验操作技术,从木棉植物中获得了一个编码海藻糖-6-磷酸合成酶的抗旱基因序列。根据玉米对密码子使用的偏爱性,合成了1个可用于玉米转化并提高其耐旱性的新的海藻糖-6-磷酸合成酶基因,进一步通过DNA分子的酶切和连接等操作将该基因构建成表达质粒,再导入大肠杆菌和酵母细胞以鉴定其是否能在原核和真核细胞中表达。最后该基因被构建到植物表达载体上,并转入农杆菌细胞。结果表明,新合成基因全长为2 586 bp,包含完整的开放阅读框,编码861个氨基酸;构建出的原核和真核表达质粒与预期的结果相符,该基因可用于细胞转化试验;该新合成基因能在大肠杆菌和酵母细胞中有效表达出海藻糖-6-磷酸合成酶;该基因被成功构建到植物表达载体p CAMBIA-2300上,并转入了农杆菌细胞LBA4404工程菌株。综合上述结果认为,获得了1个新的海藻糖-6-磷酸合成酶基因,该基因能在原核和真核细胞中有效表达出海藻糖-6-磷酸合成酶,构建的植物基因表达质粒可以直接用于玉米抗旱转基因育种。     

棉花GhEPSPS基因的原核表达载体的构建及诱导表达

目的在于构建棉花GhEPSPS基因的原核表达载体,并在宿主大肠杆菌中成功诱导表达。利用RT-PCR技术从陆地棉苏棉18中克隆获得GhEPSPS基因的开放阅读框序列,连接到p EASY-Blunt平端载体,构建获得重组载体p EASY-Blunt-GhEPSPS;以该重组载体为模板,PCR获得两端含有Eco RⅠ和XhoⅠ酶切位点的GhEPSPS基因CDS序列,通过这2个酶切位点插入到p ET32a载体,构建获得原核表达重组载体p ET32a-GhEPSPS,转化到宿主菌株BL21(DE3)中,经IPTG诱导后,SDS-PAGE检测目的基因的表达情况。研究结果表明,成功克隆获得了棉花GhEPSPS基因的CDS序列,并成功构建了该基因的原核表达载体,目的基因能够在宿主菌中被诱导大量表达。该研究结果将为深入研究棉花EPSPS酶的结构、功能以及酶学特性提供重要的研究基础。     

过表达海藻糖-6-磷酸合成酶拮抗酵母菌工程菌株的构建

本研究构建了带G418抗性的载体pFL61-G418,从酿酒酵母WT303菌株中克隆了真菌抗逆境基因tps1（海藻糖-6-磷酸合成酶基因）,再将tps1基因插入到pFL61-G418载体的NotI位点,构建pFL61-G418-tps1表达载体,并将该表达载体转化进入野生型拮抗酵母膜醭毕赤酵母菌株中。构建过表达海藻糖-6-磷酸合成酶拮抗酵母菌工程菌株,增强拮抗酵母菌的抵抗逆境的生存能力,从而提高其生活力及与病原菌的竞争力。结果表明成功地构建了过表达海藻糖-6-磷酸合成酶拮抗酵母菌工程菌株,说明pFL61穿梭质粒可以用来转化野生型拮抗酵母,G418抗性可以作为转化子筛选的阳性标记。该重组表达载体的成功构建,为野生型拮抗酵母的遗传改良提供了重要的理论依据。     

外源添加乙偶姻对酿酒酵母产2,3-丁二醇及其菌株的影响

通过对菌株发酵特性的研究,旨在获得一株性能良好的2,3-丁二醇(2,3-BD)生产菌株。本研究以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)W5/W5-$\Delta$pdc1/W5-$\Delta$pdc5/W141四株菌株为试材,利用高效液相色谱法(HPLC)对乙偶姻产量和BDH酶活进行检测,从而挑选出最适合作为产2,3-BD出发菌株,并外源添加不同浓度的乙偶姻,测定乙偶姻、葡萄糖和2,3-BD产量随发酵时间的变化情况。结果表明：S. cerevisiae W5与S. cerevisiae W141最适合作为产2,3-BD出发菌株,且S. cerevisiae W5最适添加量为12 g/L乙偶姻,且72 h时,2,3-BD的产量最大达到2.49 ± 0.02 g/L;S. cerevisiae W141最适添加量为8 g/L乙偶姻,且72 h时,2,3-BD的产量最大达到1.56 ± 0.04 g/L,外源添加乙偶姻后菌株生长状况良好,并且二者产生的乙偶姻在发酵结束前消耗完全,同时在24 h左右,二者产生的葡萄糖也均基本耗尽。这为研究和利用2,3-BD等可再生资源提供了思路,也为利用S. cerevisiae生产2,3-BD奠定了理论基础。     

单倍体酿酒酵母的丙酮酸脱羧酶基因(pdc1)的敲除与鉴定

为了抑制单倍体酿酒酵母H14的副产物乙醇的合成,使得2,3-丁二醇产量的提升。利用基因工程手段构建载体pWCL-pdc1,获得两端含40 bp pdc1的同源重组片段-loxP-kanMX-loxP。利用Cre/loxP技术获得pdc1缺失菌株S. cerevisiae H14-01 (△pdc1)。并以野生型菌株S. cerevisiae H14为对照,进行摇瓶发酵试验。S. cerevisiae H14-01长势明显略低于原始菌株。在整个发酵期间,2,3-丁二醇的最高产量和转化率分别为0.373±0.016 g/L和0.005 g/g,分别较原始菌株提高了37.30%和4.66%,但原始菌株没有检测到乙偶姻和2,3-BD生成。另外S. cerevisiae H14-01的乙醇转化率降低了33.24%,但甘油产量提高了15.76%。说明了碳流流向乙醇被阻断之后,会增加2,3-丁二醇的产量,同时会使此部分碳流流向甘油。因此,并为进一步获得高产2,3-丁二醇的工程微生物群体奠定了基础。     

虾青素合成关键酶基因bkt植物表达载体的构建 及对玉米的遗传转化

虾青素是一种具有极强抗氧化活性的类胡萝卜素，具有广泛的应用价值。β-胡萝卜素酮化酶（Bkt）是由玉米黄素合成虾青素生物合成途径中的关键酶。采用La Taq DNA聚合酶用PCR的方法从pET-28a（+）bkt中扩增得到bkt基因，用bkt基因替换pBI221中的GUS基因形成含有CaMV 35S启动子和NOS终止子的bkt基因表达盒，然后插入植物表达载体pCAMBIA1301的多克隆位点，最终获得带有选择标记和报告基因的植物表达载体pCAMBIA1301-bkt。通过农杆菌LBA4404介导将其转化进入玉米自交系齐319，转化后的愈伤经GUS组织化学染色分析表明bkt基因已经转入玉米胚性愈伤组织     

拟南芥WUS基因的克隆及植物表达载体的构建与鉴定

克隆得到正确的拟南芥WUS基因,成功构建WUS基因组成型植物表达载体和WUS-EGFP融合基因诱导型植物表达载体,分别转化了根癌农杆菌EHA105,并用WUS基因组成型植物表达载体转化橡胶树愈伤组织,得到组织化学检测阳性的愈伤组织,为深入研究WUS基因生理生化功能做准备。用双酶切切下植物表达载体PBI121的35S-GUS片段,将其连接到pCAMBIA2301上成为中间植物表达载体pCAMBIA2301-35S-GUS。提取拟南芥总RNA,通过RT-PCR方法获得WUS基因,经过TA克隆连接到pEASY-T1载体上,再用双酶切切下WUS基因,将其取代pCAMBIA2301-35S-GUS中的GUS片段,形成pCAMBIA2301-35S-WUS植物表达载体。同时以质粒pCAMBIA2301-EGFP为模板,PCR获得EGFP,用重叠延伸PCR技术（gene splicing by overlap extension PCR,简称SOE PCR）获得WUS- EGFP融合基因,经双酶切将融合基因连接到诱导型植物表达载体pER8上,构成pER8-WUS-EGFP诱导型植物表达载体。通过电击转化法将这两个载体成功转入根癌农杆菌EHA105中,经过双酶切检测、PCR检测与测序分析,检测结果皆完全正确,克隆的WUS基因与WUS-EGFP融合基因序列和NCBI上公布的序列也完全一致,说明这两个植物表达载体已经构建成功。另外用pCAMBIA2301-35S-WUS植物表达载体遗传转化橡胶树易碎胚性愈伤组织,经GUS染色为蓝色,说明愈伤组织转化成功。     

逆转录病毒介导的天蚕抗菌肽B在奶牛乳腺中的表达

摘要：为了研究天蚕抗菌肽在奶牛乳腺组织较长期表达的可行性及对天蚕抗菌肽对大肠杆菌的抑制作用,将天蚕抗菌肽B(cecropin B,CB)的基因序列,以哺乳动物偏爱的密码子优化后,设计合成了四条相互重叠的DNA片段,通过重叠延伸PCR法合成了天蚕抗菌肽B的基因,亚克隆至T载体,测序正确后构建逆转录病毒载体pLNCX-bCP-cecB,经过包装细胞的包装,获得含有天蚕抗菌肽B表达框的逆转录病毒,注射入奶牛乳腺组织,通过琼脂板孔穴扩散法检测基因的表达及活性;实验结果表明,克隆的抗菌肽基因在乳腺中获得了表达,表达产物对大肠杆菌具有抑制作用,抑制效果可以持续至13天以上。     

O型口蹄疫病毒VP1蛋白的原核表达及功能鉴定

为获得具有免疫原性的FMDV VP1蛋白,以O型FMDV重组质粒PMD18T-VP1为模板,利用PCR技术扩增得到O型FMDV VP1基因片段,将此基因片段与原核表达载体pET32a连接,构建重组表达载体,命名为pET-VP1,经PCR和测序鉴定后,用IPTG诱导表达,收集诱导的菌液进行SDS-PAGE电泳和Western-Blot分析.结果显示,在分子量约为45 ku处有1条明显的蛋白条带,且能被口蹄疫阳性血清识别,表达产物通过包涵体纯化后用透析法复性;ELISA检测结果显示,所复性的蛋白具有较高的活性.结果表明,FMDV VP1蛋白在大肠杆菌中得到高效表达,为开发诊断制剂和疫苗的研制打下基础.     

GbTCP10基因植物表达载体的构建及拟南芥转化

TCP转录因子广泛参与植物细胞生长和增殖调控,本研究构建海岛棉GbTCP10基因沉默和过量表达植物表达载体。以GbTCP10基因pGEM-T Easy-GbTCP10质粒为模板进行PCR扩增,连接至植物表达载体pCAMBIA3301中,再利用冻融法和热激法转到农杆菌GV3101菌株中,通过农杆菌浸染法转化拟南芥植株,初步证明已获得海岛棉GbTCP10基因的拟南芥。利用重叠PCR方法替换拟南芥At-MIR319的成熟链和互补链序列,构建含有amiRTCP10前体的植物表达载体amiRTCP10-pCAMBIA3301,本试验结果有助于进一步研究海岛棉GbTCP10基因的生物学功能和棉花纤维发育机制。