2,3-丁二醇脱氢酶基因(BudC)过表达菌株的构建和初步鉴定

旨在过表达BudC进而上调2,3-丁二醇（2,3-Butanediol, 2,3-BD）的合成,通过基因工程手段构建整合载体pR1SW-BudC,经PCR和酶切双重验证后将其电转化至产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca) HD79。结果经卡那霉素筛选,获得一株菌株K. oxytoca HD79-01。以原始菌株为对照,摇瓶发酵检测2,3-BD含量和相关酶活,q RT-PCR检测BudC表达差异,最终BudC在HD79-01中转录水平的表达量为HD79的45.25倍（p<0.01）。摇瓶发酵显示2,3-BD的最高产量、转化率和生产强度分别提高了24.54%、10.97%、45.08%（分别为30.818 ± 0.003 g/L、0.253 ± 0.013 g/g、0.43 ± 0.01 g/(L·h)）,酶活提高了3.61倍(0.563 ± 0.003 U/mg)。因此,2,3-丁二醇脱氢酶基因(BudC)过表达菌株构建不仅成功的提高了2,3-BD的产量也为实现2,3-BD的工业化生产奠定基础。     

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)WBG3菌株发酵特性研究

通过对酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)WBG3进行菌株发酵特性的研究,旨在获得一株性能良好的2,3-丁二醇(2,3-BD)生产菌株。本研究采用摇瓶发酵法,改变发酵过程中的底物浓度、溶氧量和酸碱浓度,紫外分光光度法和高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)检测2,3-BD合成途径中关键中间产物(丙酮酸、α-乙酰乳酸、乙偶姻)含量和发酵产物浓度。结果表明:S. cerevisiae WBG3菌株生长良好,在80 g/L葡萄糖、30℃和200 r/min条件下,丙酮酸、α-乙酰乳酸和乙偶姻含量分别达到0.10±0.03 g/L、3.38±0.06 g/L和0.17±0.02 g/L,乙醇转化率最低为0.44±0.02 g/g。添加乙酸后,甘油产量和乙醇转化率分别较对照组降低了9.5%和10%,2,3-BD的最终产量为0.36±0.02 g/L。因此,S. cerevisiae WBG3具备生产2,3-BD的潜力。     

日光温室与露地栽培凯特杏生理指标变化的研究

以凯特杏叶片为试材,露地栽培为对照,研究了河南地区日光温室凯特杏树体6项生理指标的变化.结果表明:与露地同期比较,日光温室栽培的凯特杏,MDA含量和CAT活性均增加,在果实成熟期达到最大值为5.054 0μmol·g-1,310.072 5 U·g-1·min-1,分别比露地高39.6%和36.43%;而可溶性糖含量、SOD、POD活性和可溶性蛋白质含量均下降.可溶性糖含量在硬核期达到最大值为3.464 3%,比露地低28.60%.SOD和POD活性在果实成熟期达到最大值,为249.103 6 U·g-1,110.875 0 U·g-1·min-1,分别比露地低30.10%,73.73%.可溶性蛋白质含量则不同,幼果期含量最低为14.081 1 mg·g-1,比露地低76.27%,而此期露地含量最高.以上指标均达到差异极显著水平.日光温室内不同部位比较,在果实发育期的MDA、可溶性糖含量、可溶性蛋白质、SOD和POD活性均表现出南部比北部高,但CAT活性则是南部比北部低.     

编码酿酒酵母丙酮酸脱羧酶(Pdc6)基因克隆及其生物信息学分析

旨在从生物信息学角度更好地研究酿酒酵母丙酮酸脱羧酶(Pdc6)的结构和功能,克隆酿酒酵母H5的丙酮酸脱羧酶基因pdc6。利用Primer 5.0软件设计1对20 bp引物,以H5基因组DNA为模板克隆获得pdc6,并利用生物信息学分析方法对其序列进行验证及分析。该序列长度为1692 bp,无碱基缺失,且该基因具有完整的开放阅读框,该基因编码的Pdc6包含563个氨基酸残基,该蛋白质中酸性氨基酸残基数量和碱性氨基酸残基数量大致相同;Pdc6理论等电点5.8,疏水性最大值为2.32,亚细胞定位预测其位于细胞外基质,属于酸性蛋白质,并预测了空间结构模型。本研究说明该蛋白结构与Pdc1和Pdc5结构类似,对酿酒酵母H5编码丙酮酸脱羧酶(Pdc6)基因序列克隆和生物信息学分析后,可为后续单基因敲除选取基因顺序的研究提供一定的理论基础。     

单倍体酿酒酵母的丙酮酸脱羧酶基因(pdc1)的敲除与鉴定

为了抑制单倍体酿酒酵母H14的副产物乙醇的合成,使得2,3-丁二醇产量的提升。利用基因工程手段构建载体pWCL-pdc1,获得两端含40 bp pdc1的同源重组片段-loxP-kanMX-loxP。利用Cre/loxP技术获得pdc1缺失菌株S. cerevisiae H14-01 (△pdc1)。并以野生型菌株S. cerevisiae H14为对照,进行摇瓶发酵试验。S. cerevisiae H14-01长势明显略低于原始菌株。在整个发酵期间,2,3-丁二醇的最高产量和转化率分别为0.373±0.016 g/L和0.005 g/g,分别较原始菌株提高了37.30%和4.66%,但原始菌株没有检测到乙偶姻和2,3-BD生成。另外S. cerevisiae H14-01的乙醇转化率降低了33.24%,但甘油产量提高了15.76%。说明了碳流流向乙醇被阻断之后,会增加2,3-丁二醇的产量,同时会使此部分碳流流向甘油。因此,并为进一步获得高产2,3-丁二醇的工程微生物群体奠定了基础。