牛结核病抗体胶体金快速检测技术的建立和应用

为了建立一种快速检测牛分支杆菌抗体的新方法用于诊断牛结核病,利用胶体金免疫层析技术原理,用原核诱导表达的牛分支杆菌抗原蛋白MPB83和MPB70分别作为胶体金标记抗原和检测线上的捕获抗原,制备牛结核抗体检测试纸条.结果表明,粒径为40 nm的胶体金制备的试纸条敏感性最高,胶体金最佳标记pH为6.0,MPB83抗原最适标记量为每毫升胶体金6.5 μg,MPB70抗原的最适包被浓度为3.0 mg/mL,抗MPB83蛋白IgG的最佳包被浓度为2.5 mg/mL,交叉试验证明试纸条不与牛的其他非相关疾病的阳性血清反应,具有较高的特异性.比较试验证明其敏感性显著高于韩国进口试纸条.在上述试验条件下生产了一批胶体金试纸条进行临床样品检测,并与细菌分离培养、结核菌素皮内变态反应(TST)和韩国试纸条比较.本试纸条与牛分支杆菌分离培养的符合率为85%,与TST的符合率为79.73%,与韩国试纸条的符合率为98.75%.快速检测牛结核抗体的免疫层析试纸条具有敏感、特异、简便、快速的特点,适用于对牛结核病进行普查和检疫,也可作为TST的辅助诊断方法,在牛结核病根除计划中具有良好的应用前景.     

牛结核病抗体胶体金快速检测技术的建立和初步运用

目的:建立一种快速检测牛结核抗体的新方法,用以诊断牛结核病。方法:利用胶体金免疫层析技术原理,用大肠杆菌表达的牛分枝杆菌重组抗原MPB83和MPB70分别作为胶体金标记抗原和检测线上的捕获抗原,制备牛结核抗体检测试纸条。结果:粒径为40nm的胶体金制备的试纸条敏感性最高;胶体金最佳标记pH值为6.0;MPB83抗原最适标记量为每毫升胶体金6.5μg;MPB70抗原的最适包被浓度为3.0mg/mL;抗MPB83蛋白IgG的最佳包被浓度为2.5mg/mL;交叉试验证明试纸条不与牛的其他非相关疾病的阳性血清反应,具有较高的特异性。比较实验证明其敏感性显著高于韩国进口试纸条。在上述试验条件下生产了一批胶体金试纸条进行临床样品检测,并与细菌分离培养、结核菌素皮内变态反应(TST)和韩国试纸条比较。本试纸条与牛分枝杆茵分离培养的符合率为85%,与TST的符合率为79.73%,与韩国试纸条的符合率为98.75%。结论:快速检测牛结核抗体的胶体金免疫层析试纸条具有敏感、特异、简便、快速的特点,适用于对牛结核病进行普查和检疫,也可作为TST的辅助诊断方法,在牛结核根除计划中具有良好的应用前景。     

猫杯状病毒抗原检测胶体金试纸条的研制

以浓缩纯化的猫杯状病毒(feline calicivirus, FCV)免疫BALB/c小鼠，取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合，用间接ELISA试验检测细胞培养上清，获得5株阳性杂交瘤细胞克隆株，命名为1E2、4C3、5F11、6G9和7D2,分别制备腹水后进行纯化。以多克隆抗体为金标抗体，腹水ELISA和中和效价较高的单抗(4C3)作为检测线抗体，羊抗兔二抗为质检抗体，制备检测FCV病毒抗原的免疫胶体金快速诊断试纸条。在pH为7.4的条件下，金标抗体的最适质量浓度为0.1 g/L,检测线最佳包被质量浓度为1.0 g/L,质控线最终质量浓度为0.5 g/L。经检测该试纸条具有敏感性高，特异性强，稳定性好的特点，用制备的胶体金试纸条与RT-PCR方法同时对76份猫鼻咽拭子进行检测，比较两者的符合率，符合率在90%以上。结果表明，本试验研制的胶体金试纸条可以用于FCV的临床检测。     

犬轮状病毒单克隆抗体制备及胶体金试纸条检测方法的建立

【目的】 研发犬轮状病毒（Canine ratavirus,CRV）免疫学诊断试剂,制备并鉴定CRV特异性单克隆抗体,建立可用于检测CRV的胶体金免疫层析法。【方法】 以CRV临床分离株SL006株为免疫原免疫BALB/c雌性小鼠,用杂交瘤细胞法进行细胞融合,通过间接免疫荧光法（IFA）筛选可稳定分泌CRV单克隆抗体的杂交瘤细胞,并制备腹水,亲和层析法进行纯化获得单克隆抗体。对获得的单克隆抗体进行鉴定,经条件优化建立胶体金试纸条检测方法,对试纸条的灵敏度、特异性、重复性和应用情况进行评价。【结果】 获得了4株杂交瘤细胞,分别命名为2C12、4A5、1H3、5F3,IFA效价分别为1：6 400、1：12 800、1：1 600和1：3 200;重链亚类分别为IgG2b、IgG2a、IgG1和IgG2a,轻链亚类均为kappa;制备的胶体金试纸条检测线包被单克隆抗体4A5,对照线包被羊抗鼠IgG,金标垫包被胶体金标记的单克隆抗体2C12,对CRV病毒液的检测灵敏度为10^4.2 TCID₅₀/mL,检测犬源其他病毒犬细小病毒（Canine parvovirus,CPV）、犬副流感病毒（Canine parainfluenza virus,CPIV）、犬腺病毒Ⅰ型（Canine adenovirus-Ⅰ,CAV-Ⅰ）、CAV-Ⅱ、犬瘟热病毒（Canine distemper virus,CDV）病毒液及CRV阴性肛拭子和阴性粪便均为阴性;批内和批间重复性良好;利用制备的胶体金试纸条和RT-PCR方法对47份样品进行检测比较,两者符合率为93.6%。【结论】 本研究建立的CRV胶体金试纸条检测方法具有良好的敏感性、特异性、重复性,与RT-PCR方法符合率较高,可为CRV的临床快速诊断提供有效的检测方法。     

旋毛虫53kuES重组蛋白单克隆抗体的制备及其免疫金标试纸条的研制

为建立一种简易、快速检测动物血清中的旋毛虫排泄分泌(Excretory-secretory,ES)抗原的胶体金免疫层析试纸法,本研究选用旋毛虫53 ku ES重组蛋白免疫BALB/c小鼠,应用杂交瘤细胞技术制备单克隆抗体(MAb).利用辛酸-饱和硫酸铵法和亲和层析柱联合法纯化MAb及兔抗旋毛虫53 ku ES多克隆抗体,利用枸橼酸三钠还原法制备的胶体金颗粒标记MAb,制备免疫金标试纸条.结果表明,获得的2株IgG1型杂交瘤细胞系4D10和5A2能够稳定分泌抗体,且效价高;胶体金标记MAb 4D10所制备的试纸条具有重复性好、灵敏性和特异性高的优点;该试纸条4℃条件下可密封保存6个月以上.     

柱状黄杆菌胶体金免疫层析快速检测方法的建立

为建立一种通过胶体金免疫层析技术快速检测柱状黄杆菌的方法,试验采用柠檬酸三钠还原法制备粒径为20 nm的胶体金颗粒,将其标记纯化的抗柱状黄杆菌单克隆抗体(McAb)制备出金标抗体结合垫。纯化的兔抗柱状黄杆菌多克隆抗体(PcAb)和羊抗鼠IgG分别包被在硝酸纤维素膜的检测线(T)与质控线(C)上,制备出胶体金免疫层析试纸条,并对试纸条的灵敏度、特异性及稳定性进行测定。结果显示,该试纸条检测灵敏度为1×10³ CFU,检测时间为3.5 min,制备的试纸条与迟钝爱德华氏菌、大肠杆菌、嗜水气单胞菌、鳗弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、哈维氏弧菌均无交叉反应,且稳定性好。本研究首次成功建立了柱状黄杆菌胶体金快速检测方法,所制备的试纸条具有灵敏、特异、稳定、快速等优点,可用于柱状黄杆菌的检测。     

鱼类病毒性出血性败血症病毒诊断胶体金免疫层析方法的建立

为建立一种快速检测鱼类病毒性出血性败血症病毒(Viral haemorrhagic septicaemia virus,VHSV)的胶体金免疫层析方法(GICA),采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,以标记纯化的VHSV G蛋白单克隆抗体(MAb)10A7为捕捉抗体,将纯化的抗VHSV N蛋白的MAb 10EN单克隆抗体和羊抗鼠IgG抗体包被在硝酸纤维素膜上,作为检测带与质控带,经试验条件优化,组装形成胶体金免疫层析试纸条。用本试验研制的胶体金试纸条检测VHSV感染的CHSE细胞培养物。结果显示:在检测线和质控线均呈现红色条带,而健康的CHSE细胞培养物对照仅在质控线呈现红色条带;试纸条检出病毒培养物的病毒量最低限为10~(4.0) TCID_(50);随机挑取3个不同批次的试纸条,对阳性样品和阴性样品进行重复试验,未发现差异。特异性试验表明,该试纸条与传染性造血器官坏死病毒(IHNV)、传染性胰坏死病毒(IPNV)、鲤春病毒血症病毒(SVCV)、牙鲆弹状病毒(HRV)、草鱼呼肠孤病毒(GCRV)无交叉反应。将同一批次的试纸条在4℃条件下保存不同时间后进行检测,发现保存6个月的试纸条仍具有良好的稳定性。本试验研发的胶体金诊断试纸条具有良好的特异性、灵敏性和重复性,在快速辅助检测方面具有推广应用价值。     

快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒胶体金免疫层析方法的建立

为建立一种快速、简便、灵敏的检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的胶体金免疫层析方法(GICA),本研究采用柠檬酸三钠还原法制备了胶体金颗粒,标记抗PRRSVN蛋白的单克隆抗体(MAb) 2D7制备免疫检测探针,将抗PRRSVN蛋白的MAb 1G7和羊抗鼠IgG抗体印迹在硝酸纤维素膜上,分别作为检测线和质控线,经条件优化,组装成胶体金免疫层析试纸条.本研究制备的PRRSV胶体金试纸条的最低检测限度为103.0 TCID50/mL;在特异性试验中,试纸条检测PRRSV呈阳性,其它主要猪病病原均为阴性;不同批次试纸条重复检测,结果无差异;对现地猪场送检的150份病料进行PRRSV病原检测,与RT-PCR相比较,试纸条的特异性和敏感性分别为98.13％和88.37％.两种方法的一致性Kappa值为0.882.建立的PRRSV抗原胶体金免疫层析检测方法具有良好的的敏感性、特异性、重复性及现地应用性.该试纸条的研制为PRRS的快速诊断及免疫预防提供了技术手段.     

牛诺瓦病毒和牛轮状病毒双重RAA-LFD快速检测方法的建立及应用

为建立能同时检测牛诺瓦病毒(bovine norovirus, BNoV)和牛轮状病毒(bovine rotavirus, BRV)的重组酶辅助扩增-侧流层析试纸条(recombinase aided amplification-lateral flow dipstick, RAA-LFD)快速检测方法。本试验按照RAA引物探针设计原则,分别针对BNoV RdRp基因和BRV VP7基因的保守区设计引物和探针,制备标准重组质粒,建立并优化RAA-LFD反应体系,同时对该检测方法进行特异性、敏感性及重复性评估,用建立的RAA-LFD法与PCR法、qPCR法分别对采集的168份腹泻犊牛的临床样本进行平行检测。结果显示,该方法可在20 min, 39℃的条件下扩增目标片段,对BNoV和BRV敏感度均为10³ copies·μL^-1,与PCR的检测结果基本一致,且与牛冠状病毒(bovine coronavirus, BCoV)、牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus, BVDV)和牛传染性鼻气管炎病毒(infecti...     

鸭坦布苏病毒E蛋白Domain Ⅲ单克隆抗体胶体金试纸条的创制及应用

为建立一种快速诊断鸭坦布苏病毒（DTMUV）的方法,以2株（B9D7B8G10和B9D10C7株）抗DTMUV的单克隆抗体制备DTMUV胶体金免疫层析试纸条。采用经典的柠檬酸钠还原法制备胶体金溶液,利用rProtein G琼脂糖凝胶亲和层析法对两株单克隆抗体腹水进行纯化并鉴定;以纯化的B9D7B8G10株单克隆抗体作为标记抗体,通过调节单克隆抗体浓度与pH确定胶体金探针最佳结合条件;同时,在硝酸纤维素膜（NC膜）检测带包被纯化的B9D10C7株单克隆抗体,质控带包被山羊抗小鼠IgG抗体,建立检测DTMUV胶体金免疫层析试纸条;成功建立试纸条后,对试纸条敏感性、特异性、重复性和稳定性进行检测,并与RT-PCR检测方法进行比较,对200份临床疑似感染样品进行检测。结果显示：制备的胶体金试纸条在15 min内即可完成检测,最低检测稀释度为1:50,且不与鸭瘟病毒、番鸭细小病毒、鹅星状病毒、禽白血病病毒发生交叉反应;应用试纸条和RT-PCR方法分别对200份临床疑似样品进行检测,两者符合率达98%。结果表明,制备的胶体金试纸条敏感性高、特异性强、稳定性好、重复性好,为DTMUV的快速检测提供了...     

H5亚型虎源流感病毒血凝素单抗制备及胶体金试纸条的研制

以H5N1亚型虎源流感病毒免疫Balb/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合,用间接ELISA试验检测细胞培养上清,获得2株阳性杂交瘤细胞克隆株,命名为3A13和1B8.分别制备腹水后进行纯化,获得了抗H5亚型虎源流感病毒血凝素的单克隆抗体,用制备的单克隆抗体结合胶体金免疫层析技术,制备了H5亚型虎源流感病毒免疫胶体金快速诊断试纸条.该试纸条对H5N1虎源流感病毒鸡胚培养毒、H5亚型禽流感病毒标准抗原,以及24份虎疑似感染H5N1亚型虎源流感病毒感染病料和小鼠模型病料等检测结果为阳性,同时对H7和H9亚型禽流感病毒标准抗原及传染性支气管炎、新城疫抗原等检测结果为阴性;与HA-HI和RT-PCR的平行对比试验表明,试纸条检测敏感度与血凝试验和血凝抑制试验的敏感性相符.本试验所研制的免疫胶体金诊断试纸条可用于H5亚型虎源流感病毒的特异诊断和流行病学调查,为开发成品化检测试纸条奠定基础.     

犬瘟热病毒单克隆抗体的研制及胶体金试纸条检测方法的建立

本研究利用原核表达、纯化的犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)N 蛋白免疫BALB/C小鼠,成功筛选到两株分泌CDV N 蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为D3、D6。2株杂交瘤细胞分泌单克隆抗体敏感性、特异性良好,能识别不同来源的犬瘟热病毒株,单抗亚类均为IgG1。以D3作为金标抗体,D6作为检测抗体,兔抗鼠IgG作为质控线抗体,制备犬瘟热病毒胶体金检测试纸条,检测犬瘟热病毒敏感性为1000TCID50,能有效检测区分犬瘟热病毒、犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)、犬腺病毒2型(Canine adenovirus type 2,CAV2)、狂犬病病毒(Rabies virus,RV)。综上,本研究建立的胶体金试纸条检测方法,灵敏度高、特异性强,适用于犬瘟热病毒临床快速诊断。     

牛病毒性腹泻病毒抗体胶体金检测试纸条的制备

采用sf9昆虫细胞-杆状病毒系统重组表达牛病毒性腹泻病毒P80蛋白抗原,经纯化鉴定后将P80蛋白用胶体金标记作为示踪抗原,未标记的P80抗原作为捕获抗原,并以羊抗牛IgG抗体作为质控抗体,建立了牛病毒性腹泻病毒抗体快速诊断试纸条。试验结果表明,该试纸条检测灵敏度高,特异性良好,与牛口蹄疫病毒、牛传染性鼻气管炎病毒无交叉反应。使用建立的胶体金试纸条和IDEXX牛病毒性腹泻病毒ELISA抗体检测试剂盒同时检测80头份牛血清,阳性结果符合率为86.7%,阴性结果符合率为100%,总符合率为95%。该试纸条可用于临床牛病毒性腹泻病毒抗体的诊断和检测。     

兔出血症病毒胶体金免疫层析试纸条诊断方法的建立及初步应用

为了建立一种快速、简便的兔出血症病毒(RHDV)的检测方法,用胶体金标记纯化的RHDV多克隆抗体,以杆状病毒表达系统表达的重组RHDV VP60蛋白为免疫原制备RHDV的单克隆抗体(McAh,简称单抗)A3C,将RHDV McAb和羊抗兔IgG抗体包被在硝酸纤维素膜上,分别作为检测线和质控线,经条件优化研制成RHDV免疫胶体金试纸条.该试纸条可以检出红细胞凝集试验(HA)效价为1:10的RHDV悬液,即HA检测为阴性的样品,该试纸条检测为阳性,其敏感性高于HA;特异性试验结果显示,该试纸条不与家兔其他常见病菌发生交叉反应.应用该试纸条对127份疑似兔出血症家兔肝脏样品进行初步检测,同时用HA做平行试验,阳性符合率为100％.因此,该试纸条是一种快速、灵敏、特异的兔出血症病毒检测方法,为兔出血症的现场诊断提供了有效的方法,显示出很好的临床应用前景.     

抗原ELISA检测试剂盒和胶体金试纸条用于禽白血病病毒检测时的比较

为比较不同禽白血病病毒(avian leukosis virus,ALV)抗原ELISA检测试剂盒和胶体金试纸条的灵敏度,本研究将A、B、J 3种不同ALV亚群分别以50,100,500TCID503种剂量接种培养于DF1细胞上,接种后2~8d,每天收取上清,每份上清用3种不同的抗原ELISA检测试剂盒(A、B、C)和2种胶体金试纸条(D、E)同时检测。结果显示,3种亚群3种剂量分别应用A、B、C 3种ELISA检测试剂盒,灵敏度基本一致,但在针对3种亚群的个别剂量时B试剂盒灵敏度略高于A和C;2种胶体金试纸条检测结果完全一致,但其灵敏度均比ELISA试剂盒低,检出时间延后1~2d。同时应用ELISA试剂盒A、B和胶体金试纸条D、E对60枚种蛋蛋清进行了检测,结果显示胶体金试纸条检出率远低于ELISA试剂盒检出率,在某些应用方面还无法完全替代ELISA检测试剂盒。本研究为广大种鸡场开展禽白血病净化选择灵敏度高、操作简便的检测方法及其适用范围提供了借鉴。     

牛结核胶体金免疫层析快速诊断方法的建立及初步应用

建立一种快速检测牛结核抗体的方法,用以诊断牛结核病。根据胶体金免疫层析技术原理,用兔抗牛血清蛋白和大肠埃希菌表达的牛分支杆菌MPB70-83-ESAT-6蛋白分别作为胶体金标记抗原和检测线上的捕获杭原,制备牛结核抗体检测试纸条。结果表明,MPB70-83-ESAT-6抗原的最适包被浓度为2.5mg/mL;研制的试纸条不与牛的其他疾病的阳性血清反应,具有较高的特异性;该试纸条的最高检出稀释度为1∶640;试纸条与TST的符合率为80%。该试纸条具有敏感、特异、简便、快速的特点,适用于对牛结核病进行普查和检疫,具有良好的应用前景。     

猪δ冠状病毒胶体金试纸条检测方法的建立

为建立一种方便、快捷、实用的检测猪δ 冠状病毒(PDCoV)方法,本研究利用原核表达猪δ 冠状病毒N 蛋白,以纯化的N 蛋白免疫BALB/C小鼠,利用杂交瘤细胞技术研制2株分泌PDCoV N 蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为E8、A10。2株杂交瘤细胞分泌单克隆抗体敏感性及特异性良好,E8亚类为IgG2a,A10亚类为IgG1。以E8作为金标抗体,A10作为检测抗体,兔抗鼠作为质控线抗体,制备猪δ 冠状病毒胶体金检测试纸条,检测猪δ 冠状病毒敏感性为100TCID50,检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒、猪δ 冠状病毒阴性对照均为阴性。本研究建立的胶体金试纸条检测方法敏感性及特异性良好。该检测方法的建立,为猪δ 冠状病毒(PDCoV)流行病学调查提供一种方法,同时为规模化养殖集团及基层兽医组织提供一种检测猪δ 冠状病毒产品。     

犬细小病毒病免疫胶体金诊断技术的研究

建立一种简便、快速、准确检测犬细小病毒(CPV)的胶体金免疫层析法(GICA).采用柠檬酸三钠法制备胶体金颗粒,标记纯化的CPV单克隆抗体,在玻璃纤维素膜上喷加纯化的CPV多克隆抗体,制成诊断CPV抗原的快速诊断试纸条.用本试验研制的CPV试纸条检测收集到的120份犬粪便样品,其结果与HA结果相比对,HA效价在1:40以上,试纸条均能检测到为阳性.CPV试纸条与犬瘟热病毒及犬传染性肝炎病毒无交叉反应.且试纸条保存6个月后,其检测结果重复性为100%.试验证明,本研究建立的GICA是一种快速、灵敏、特异的抗原检测方法,可在临床上广泛应用,也可用于CPV的流行病学调查.     

牛传染性鼻气管炎病毒抗体胶体金检测试纸条的制备

采用SF 9昆虫细胞-杆状病毒系统重组表达牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白抗原,经纯化鉴定后将gD蛋白用胶体金标记作为示踪抗原,未标记的gD抗原作为捕获抗原,并以羊抗牛IgG抗体作为质控抗体,建立了牛传染性鼻气管炎病毒双抗原夹心法胶体金检测试纸条。试验结果表明,该试纸条检测灵敏度高,特异性良好,与牛口蹄疫病毒、牛病毒性腹泻病毒等阳性血清无交叉反应。使用建立的胶体金试纸条和IDEXX牛传染性鼻气管炎病毒抗体ELISA检测试剂盒同时检测112份牛血清,阳性符合率为93.5%,阴性符合率为96.0%,总符合率为94.6%。说明该试纸条可以应用于临床牛传染性鼻气管炎病毒抗体的诊断和检测。     

牛冠状病毒和轮状病毒的双重RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立一种快速诊断牛病毒性腹泻疾病的方法,利用本研究室分离鉴定的牛冠状病毒(BCV)和牛轮状病毒(BRV)毒株,根据GenBank中登录的BCV、BRV核苷酸序列分别设计并合成了两对能特异性扩增BCV、BRV的引物,经过条件优化,建立了检测BCV、BRV的双重PCR方法,扩增两种病毒的片段分别为244 bp和382 bp.该方法检测BCV和BRV的敏感度分别为1个和100个TCID50/100μL.应用这一方法能从病料中检测出这2种病毒.结果表明该双重RT-PCR方法具有很好的特异性和敏感性,可用于这2种病毒性疾病的快速诊断.