暴发高致病禽流感疫区鸟类禽流感的血清学调查

本研究应用血凝抑制试验(H I),2004年初H 5亚型禽流感在中国内地发生前后,于湖北、广西二疫区市县的生态系中,自健康的鹰、鸽子、野鸭和鹌鹑中采集了54份血清,对其进行了血清学检测,并将获得的血清学检测数据进行了统计学分析。分析结果显示,在总共采集的54份血清样品中,抗H 6亚型禽流感病毒(H 6)抗体、抗H 9亚型禽流感病毒(H 9)抗体、抗H 5亚型禽流感病毒(H 5)抗体阳性率分别为64.8%、75.9%、29.6%。推断,这一时期,H 6亚型禽流感病毒(H 6)、H 9亚型禽流感病毒(H 9)和H 5亚型禽流感病毒(H 5)共循环于该生态系中,其中H 9、H 6亚型禽流感病毒长期、稳定循环于该生态系中,为该生态系禽流感主要流行血清型。血凝抑制试验检测结果发现,H 5亚型禽流感病毒抗体滴度较低,最高仅为640×,其阳性率为29.6%,推断其可能为新近传入的病毒或新近重组变异出现的新病毒,可能为与该次禽流感暴发相关的新病毒,这一推断还有待于通过对病毒基因序列的分析而做进一步验证。     

黑龙江省部分地区散养畜禽流感病毒感染的血清学调查与分析

本研究应用血凝抑制试验（HI），在2005年初，于黑龙江省绥化、海林两地区散养的临床健康的猪、家禽中采集血清样品178份，对其进行了血清学检测，并将获得的血清学检测数据进行了统计学分析。分析结果显示，绥化地区采集的血清样品共计60份，其中家禽中抗H9亚型流感病毒抗体阳性样品24份，占家禽检测总样品数（45份）的53．3％；在海林市地区采集的血清样品共计118份，其中家禽中抗H9亚型流感病毒抗体阳性样品29份，占家禽被检测总样品数（88份）的32．9％。在两地猪群中的血清学检测结果发现，抗H9亚型流感病毒抗体阳性率较高，分别占猪血清检测样品（14／15，19／30）的93，3％和63．3％，两地的畜禽检测中均未检测到H5、H7亚型抗流感抗体。本次试验检测结果表明，在黑龙江省的畜禽养殖中，尤其是猪与家禽当中，存在抗H9亚型流感病毒的抗体，推断可能有该亚型流感病毒的传播；未检到H5、H7亚型流感病毒抗体，在本次检测中可以初步判定在被检测的畜禽当中不存在高致病性禽流感病毒感染与流行。     

抗禽流感病毒H5亚型血凝素特异性单克隆抗体的研制

以禽流感H5亚型病毒免疫Ballb/c小鼠，取其脾细胞与SP2／0骨髓瘤细胞融合，用血凝抑制试验检测细胞培养上清，结果获得3株阳性细胞株，分别命名为4B6、4A3、3H1。经2次亚克隆后，100％杂交瘤细胞保持了分泌抗禽流感病毒H5亚型抗体的能力。实验证明，所有这3株单克隆抗体仅与试验的H5病毒株反应，而不能与禽流感H9亚型病毒、鸡新城疫病毒、鹅新城疫病毒和鹅腺病毒等反应。间接免疫荧光试验检测结果表明这3株单克隆细胞的培养上清均能与感染H5亚型病毒的成纤维细胞呈现亮绿色荧光。     

禽流感疫苗的应用效果观察与分析

2003年以来，H5N1亚型禽流感病毒不仅在60多个国家和地区（包括中国）引起禽流感暴发，而且感染动物种类不断增多。我省目前主要应用的疫苗有H5N2，H5N1两种灭活疫苗，部分区域试推广应用禽流感（H5亚型）重组鸡痘病毒载体活疫苗和禽流感-新城疫重组二联苗（rLl-H5株），本文将以上4种疫苗的使用效果综述如下。     

抗禽流感病毒H5和H9亚型血凝素特异性单克隆抗体的研制及应用

以禽流感题H5和H9亚型病毒分别免疫Balh／c小鼠，取其脾细胞与SP2／0的骨髓瘤细胞融合，用血凝抑制试验(HI）检测细胞培养上清，结果获得了6株特异性单克隆抗体，其中抗禽流感题亚型病毒血凝素特异性单克隆抗体细胞株3株，分别命名为4B6、4A3、3H1；抗H9亚型病毒血凝素单克隆抗体细胞株3株，命名为6E6、6B6和5B4。这些单克隆抗体小鼠腹水HI效价为2^13-15，细胞培养上清抗体HI效价为2^7-8。研究结果表明，所有这些单克隆抗体仅与试验的相应题或ID亚型病毒株发生特异性反应，而不能与鸡新城疫病毒、鹅新城疫病毒、鹅腺病毒和鸡产蛋下降综禽征病毒(EDS76)等反应。实验室检测结果证明，应用这些单克隆抗体能在24h内迅速检测出相应的禽流感病毒。所有这些单克隆抗体将在禽流感的预警预报工作中发挥重要作用。     

新城疫与禽流感(H9亚型)二联油乳剂灭活苗免疫效力试验

用新城疫病毒（NDV）LaSota株与禽流感病毒（AIV）F株尿囊腔接种非免疫难胚，取72－120小时死亡鸡胚液。灭活后分别制成新城疫油乳剂灭活苗、禽流感（H9亚型）油乳剂灭活苗、新城疫与禽流感（H9亚型）二联油乳剂灭活苗，免疫7日龄非免疫雏鸡，一周后开始检测ND、AI血凝抑制（HI）抗体体，两周时各免疫组鸡的抗体效价都达到6log2以上，3周达到高峰，后维持在较高水平达45天以上，在65日龄进行攻毒，结果单苗和二联苗免疫鸡全部得到保护。     

抗禽流感H9亚型血凝素单克隆抗体的病毒中和作用

通过血凝抑制(HI)和鸡胚中和试验(VN)证实，本实验室制备的抗禽流感H9M2单抗11A5和11B2株可特异性地抑制H9亚型禽流感病毒的血凝特性，而与禽流感H5和H7亚型以及其他具有血凝性感染禽类的病毒(如新城疫等)不反应。两株单抗腹水HI效价均达到15Log2。中和试验表明：上述两株单抗均可有效抑制H9N2病毒在SPF鸡胚中的增殖，使病毒失去血凝活性．测得11A5和11B2株腹水对H9N2禽流感病毒的半数保护量分别为10^-3.35和10^-4.58。该单抗的研制成功对于进一步建立快速鉴别诊断禽流感H9亚型病毒具有重要意义。     

鲁北地区商品肉鸭AIV和NDV抗体效价的检测与分析

为了解鲁北地区商品肉鸭中禽流感病毒(AIV)和新城疫病毒(NDV)的母源抗体、免疫抗体消长规律,分析在养殖过程中潜在的疫病风险,选择了三个规模化鸭场,分别采集了不同日龄鸭的血液样品,通过血凝试验和血凝抑制试验检测了AIV H5亚型(Re-6,Re-8)、H9亚型、H7亚型和NDV的抗体情况。结果表明:三个鸭场的AIV H5亚型和NDV抗体效价均处于较高水平,说明AIV H5免疫后的抗体能够产生有效保护,AIV H9亚型母源抗体在肉鸭12日龄左右消失,存在被感染的隐患;仅有两份血清样品检测到AIV H7亚型抗体效价,其余都为0;NDV在鸭群中存在不同程度的隐性感染。建议做好对AIV和NDV的抗体监测工作,并为防控相关疾病做好技术与产品储备。     

H3亚型禽流感病毒血凝素特异性单克隆抗体的制备

以H3亚型禽流感病毒(AIV)免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,用血凝抑制试验(HI)筛选阳性杂交瘤细胞并克隆化。结果获得了4株针对H3亚型禽流感病毒血凝素的单克隆抗体,分别命名为1D7、1F9、5A4、5F5。这些单克隆抗体小鼠腹水HI效价为212～214。用H1、H6、H10亚型禽流感病毒各2株,H4、H5、H9和新城疫病毒(NDV)各1株进行特异性试验。结果表明:所有这些单抗仅与H3亚型AIV发生特异性HI反应,而不与其他亚型AIV及NDV反应。用28株H3亚型禽流感病毒进行排谱试验,结果证明:4株单抗均具有广谱性,其中1F9、5A4、5F5与受试的28株H3亚型AIV均反应,而1D7只与其中的26株反应。以上单抗将为控制畜禽及人类的流感提供必需的诊断试剂。     

蛋鸡禽流感和新城疫母源抗体消长规律的研究

为了探讨种鸡场禽流感和新城疫母源抗体消长规律,制定科学的免疫程序,本试验对父母代种鸡和出壳当日蛋雏鸡进行禽流感和新城疫抗体检测以及对1、8、15、22及29日龄蛋雏鸡进行禽流感H5、H9亚型和新城疫母源抗体跟踪检测。结果表明,父母代种鸡禽流感和新城疫免疫抗体水平较高,且通过卵黄传递给蛋雏鸡,使其产生较高的母源抗体抵抗病毒侵袭。同时发现蛋雏鸡在出壳当日禽流感和新城疫母源抗体水平最高,均达到6log2以上,且群体抗体合格率均达90%以上,随后母源抗体逐渐下降,在15日龄时禽流感H5亚型和新城疫母源抗体下降到抗体保护水平以下,22日龄时禽流感H9亚型母源抗体也已下降到抗体保护水平以下,因此在15日龄时进行禽流感H5亚型和新城疫首免,在22日龄时进行禽流感H9亚型首免,可以有效降低禽流感H5和H9亚型和新城疫的发生风险。     

绿头鸭卵黄硒含量与禽流感新城疫病毒抗体滴度关系探讨

绿头鸭(Anas platyrhynchos)是大庆龙凤湿地的优势物种,为研究绿头鸭卵黄硒含量与病毒抗体之间的相关关系,采用血凝抑制试验及原子荧光光谱法(AFS)检测105枚绿头鸭卵黄内硒含量及H1、H5、H9亚型禽流感病毒(AIV)和新城疫病毒(NDV)抗体。结果表明,卵黄硒含量为0.48μg/g±0.15μg/g;卵黄内H1、H5、H9亚型AIV和NDV抗体阳性率分别为:100%、59.05%、71.43%、68.57%;其评价抗体滴度分别为:6.17log2、2.89log2、3.34log2、4.22log2。经相关分析结果表明,卵黄内H1、H5、H9亚型AIV和NDV抗体滴度与卵黄硒含量的相关系数分别为:0.077、0.714、0.690、0.611。由此可见,龙凤湿地绿头鸭种群卵黄硒含量与相关病毒抗体之间呈明显的正相关,说明硒元素对动物机体抗病毒能力起到一定的增强作用。     

鸡新支流三联灭活疫苗免疫AA+肉种鸡的子代母源抗体测定及攻毒试验

用新支流三联苗（批号200701）免疫AA+父母代肉种鸡,子代雏鸡1日龄母源抗体的变化情况与其种鸡血清抗体的消长情况相似,呈强正相关。1日龄雏鸡母源抗体平均滴度越高,其15～17日龄后下降越迅速,至28日龄时已接近为0。结果表明,种鸡免疫后1～3个月,其子代在14日龄内的母源抗体可对ND的攻击获得全保护,传染性支气管炎母源抗体≥6log2。种鸡免疫后4～4.5个月,其子代对ND、IB的攻击在7日龄内能全保护。证明三联疫苗免疫种鸡后1～3个月可保护子代抵抗病毒攻击至14日龄;免疫后4～4.5个月,其子代可保护至7日龄;而免疫后5～6个月可保护子代至1日龄。     

H9N2亚型禽流感病毒中和单克隆抗体的制备与应用

为建立H9N2亚型禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）免疫层析快速检测技术,本研究以差速离心法纯化H9N2亚型AIV免疫BALB/c小鼠,将免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合和HAT选择性培养;以H9N2亚型AIV感染MDCK细胞建立异源免疫过氧化物酶单层细胞试验（IPMA）的单克隆抗体检测方法,通过对杂交瘤细胞的IPMA筛选和连续克隆化筛选鉴定抗H9N2亚型AIV中和性单克隆抗体;以胶体金标记HA单克隆抗体,配对HA单克隆抗体和羊抗小鼠IgG为检测线和质控线,制备H9N2亚型AIV快速检测试纸条,测定其特异性和敏感性。结果显示,获得了11株稳定分泌抗H9N2亚型AIV单克隆抗体的杂交瘤细胞,其单克隆抗体腹水IPMA效价在1.28×10^-4至2.56×10^-5之间。单克隆抗体3A2、5H6、6B8、7E10和9G12血凝抑制试验（HI）显示血凝抑制活性,其（HI）效价在6log2~9log2之间。单克隆抗体3A2、6B8和9G12在病毒中和试验中对H9N2亚型AIV有显著病毒中和活性,中和效价分别1∶6 400、1∶25 600和1∶25 600。Western blotting结果提示,该中和单克隆抗体识别HA蛋白线性抗原表位。利用配对单克隆抗体3A2和9G12研制的H9N2亚型AIV检测试纸条检测H9N2亚型AIV尿囊液的效价为9log2,灵敏度与经典血凝试验（HA）相当,与其他亚型AIV （H1、H3、H5、H7）,以及新城疫病毒和鸡传染性法氏囊病病毒等相关病毒均无交叉反应。本研究制备了具有病毒中和活性的抗H9N2亚型AIV单克隆抗体,并初步研制了H9N2亚型AIV检测试纸条,为H9N2亚型AIV新型疫苗研制和快速检测奠定良好的研究基础。     

不同剂型新城疫-禽流感二联灭活疫苗免疫SPF鸡后抗体水平对比试验

不同剂型的佐剂对疫苗的免疫效果有较大的影响,本试验旨在对比不同剂型佐剂的新城疫-禽流感(简称"新-流")二联灭活疫苗的免疫效果,从而为生产上选择最佳剂型佐剂应用于新城疫-禽流流感二联灭活疫苗提供依据。分别将油包水型、水包油型、水包油包水型佐剂与新城疫及禽流感灭活抗原乳化成不同剂型的新城疫-禽流感(H9亚型,HP株)二联灭活疫苗,将这三种不同剂型的新城疫-禽流感(H9亚型,HP株)二联灭活疫苗分别免疫一组7日龄SPF鸡。每羽颈部皮下注射0.2 m L,同时设一组未免7日龄SPF鸡作为对照组,各免疫组与对照组SPF鸡于免疫组免后6、10、15、21、28、35 d进行采血,检测新城疫与禽流感抗体水平。结果表明:免疫油包水型疫苗组SPF鸡免疫后新城疫与禽流感抗体上升最快,在免后10、15、21、28、35 d的新城疫与禽流感抗体也最高,其次是免疫水包油包水型的,而免疫水包油型疫苗组的SPF鸡新城疫与禽流感抗体上升最慢,而且在免后10、15、21、28、35 d的新城疫与禽流感抗体也最低。此外,从各免疫组可以看出,在免后6 d时新城疫抗体已开始产生,在1log2以下,而禽流感抗体仍未产生。可见免疫新-流二联苗后,新城疫抗体比禽流感抗体更早产生,油包水型新-流二联苗的免后抗体高于水包油包水及水包油型,而且能持续刺激机体产生高水平抗体,更具优势。     

白翅浮鸥H5亚型禽流感及新城疫的卵黄抗体监测

白翅浮鸥是大庆龙凤湿地保护区的优势物种,为了解白翅浮鸥对H5亚型禽流感病毒(AIV)与新城疫病毒(NDV)的感染和被动免疫状况,本研究于2010年春季采集白翅浮鸥巢卵144枚,采用血凝抑制试验检测H5亚型AIV和NDV的卵黄抗体.结果表明,龙凤湿地白翅浮鸥种群卵黄抗体的阳性率分别为38.89％和36.11％,平均卵黄抗体滴度分别为3.76 (log2)和4.08 (log2).因此,白翅浮鸥繁殖个体H5亚型AIV和NDV感染率均较高,提示需要进一步加强对其种群的病毒携带情况进行监测研究.     

Newcastle disease and avian influenza A virus in wild waterfowl in South Africa

In an intensive ostrich farming area in South Africa with a history of ostrich influenza outbreaks, we conducted a survey of avian influenza virus (AIV) and Newcastle disease virus (NDV) in wild aquatic birds. During late autumn and winter 1998, the time of year when outbreaks in ostriches typically start to occur, 262 aquatic birds comprising 14 species were sampled and tested for both virus infections. From eight samples, AIV, serotype H10N9, could be isolated. All isolates were apathogenic as determined by the intravenous pathogenicity index (0.00). Conversely, none of 33 sera of these wild birds showed antibodies against H10. However, one bird was found serologically positive for H6 AIV. This AIV serotype was later isolated from ostriches during an avian influenza outbreak in this area. No NDV was isolated although 34 of 46 serum samples contained NDV-specific antibodies. This is the first H10N9 isolate to be reported from Africa. In addition, our data support the notion that wild aquatic birds may function as a reservoir for AIV and NDV in South Africa.     

朗德鹅禽流感病毒的分离与鉴定

用禽流感病毒ELISA试剂盒对某朗德鹅养殖场的病鹅气管粘液进行了检测，发现5份粘液样本均呈禽流感阳性；随后取相应气管组织材料接种于9～11日龄鸡胚分离病毒．发现尿囊液能使鸡红细胞发生凝集，用禽流感病毒H5、H7、H9标准阳性血清和新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒、传染性法氏囊炎病毒抗血清作HI试验，结果禽流感病毒H5亚型抗血清的血凝抑制滴度达到2^7，而禽流感病毒H7、H9亚型及其他病毒抗血清无血凝抑制滴度，说明从朗德鹅分离到的病毒为H5亚型禽流感病毒。     

H5亚型虎源流感病毒血凝素单抗制备及胶体金试纸条的研制

以H5N1亚型虎源流感病毒免疫Balb/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合,用间接ELISA试验检测细胞培养上清,获得2株阳性杂交瘤细胞克隆株,命名为3A13和1B8.分别制备腹水后进行纯化,获得了抗H5亚型虎源流感病毒血凝素的单克隆抗体,用制备的单克隆抗体结合胶体金免疫层析技术,制备了H5亚型虎源流感病毒免疫胶体金快速诊断试纸条.该试纸条对H5N1虎源流感病毒鸡胚培养毒、H5亚型禽流感病毒标准抗原,以及24份虎疑似感染H5N1亚型虎源流感病毒感染病料和小鼠模型病料等检测结果为阳性,同时对H7和H9亚型禽流感病毒标准抗原及传染性支气管炎、新城疫抗原等检测结果为阴性;与HA-HI和RT-PCR的平行对比试验表明,试纸条检测敏感度与血凝试验和血凝抑制试验的敏感性相符.本试验所研制的免疫胶体金诊断试纸条可用于H5亚型虎源流感病毒的特异诊断和流行病学调查,为开发成品化检测试纸条奠定基础.     

Immuno-PCR for one step detection of H5N1 avian influenza virus and Newcastle disease virus using magnetic gold particles as carriers

Detecting avian influenza virus (AIV) and Newcastle disease virus (NDV) at low concentrations from tracheal and cloacal swabs of avian influenza- and Newcastle disease-infected poultry was carried out using a highly sensitive immunological-polymerase chain reaction (immuno-PCR) method. Magnetic gold particles were pre-coated with a capture antibody, either a monoclonal anti-AIV/H5 or monoclonal anti-NDV/F and viruses serially diluted ten-fold from 10(2) to 10(-5)EID(50)/ml. A biotinylated detection antibody bound to the viral antigen was then linked via a streptavidin bridge to biotinylated reporter DNA. After extensive washing, reporter DNA was released by denaturation, transferred to PCR tubes, amplified, electrophoresed and visualized. An optimized immuno-PCR method was able to detect as little as 10(-4)EID(50)/ml AIV and NDV. To further evaluate the specificity and the clinical application of this IPCR assay for AIV H5N1 and NDV, the tracheal swab specimens, taken from chickens which were infected with H5N1/AIV, H9N2/AIV, H7N2/AIV, NDV, IBDV, IBV/H(120), were detected by IPCR. Our data demonstrated that this monoclonal antibody-based immuno-PCR method provides a platform capable of rapid screening of clinical samples for trace levels of AIV H5 and NDV in one step.