1株H1N1亚型猪流感病毒的全基因组特征及其对小鼠的致病性

旨在了解河南省猪流感病毒的流行情况及其遗传进化和基因组特征。2018年4月，从河南省某一出现疑似流感症状猪群中采集鼻拭子样品150份用于分离病毒，对分离病毒的全基因组进行序列测定和分析。同时感染6周龄BALB/c小鼠，研究其对小鼠的致病性。结果显示，获得1株H1N1亚型病毒[命名为A/swine/Henan/NY20/2018（H1N1）]。遗传进化表明，其HA和NA基因属于欧亚类禽H1N1分支，PB2、PB1、PA、NP和M基因属于2009甲型H1N1分支，NS基因属于经典H1N1分支。HA蛋白的裂解位点序列为PSIQSR↓GL，具有低致病性流感病毒的分子特征，在小鼠肺和鼻甲有效复制并能引起肺组织病理学变化。本研究分离到1株3源重排H1N1亚型病毒，对小鼠呈现一定致病力，提示应进一步加强对SIV的监测。     

一株新型三源重配H1N2亚型猪流感病毒的进化分析及对小鼠的感染性研究

为了研究我国广西地区流行的猪流感病毒分子特征和感染性,本研究对分离自广西临床健康猪群中的H1N2亚型猪流感病毒(SIV)A/swine/Guangxi/238/2018(H1N2)(简称GX238株)进行了分子进化分析和致病性研究。扩增该病毒株8个基因节段后进行分子进化分析,结果显示其8个节段均与2015年～2016年在美国分离的H1N2亚型SIV有高度同源性(98.9%～99.7%),其中HA基因可能来自于2009年之前的人季节性H1N1亚型流感病毒,PB2、PB1、PA、NP、NA和NS可能来自北美三重配H1N2亚型SIV,M基因可能来自H1N1/2009。以10~6EID_(50)SIV GX238株病毒鼻腔感染BALB/c小鼠后记录小鼠的体质量变化及死亡情况,感染后第3 d检测小鼠各脏器病毒复制情况。结果显示,感染组小鼠体质量与PBS对照组小鼠相比有明显下降趋势,感染小鼠40%死亡;在小鼠肺脏和鼻甲中病毒滴度分别达6.3 Log_(10)EID_(50)/mL、4.8 Log_(10)EID_(50)/mL,表明该病毒对小鼠表现出中等的致病力。本研究结果表明输入型SIV持续对我国猪群造成威胁,凸显了在世界范围内开展猪流感监测的必要性。     

两株H4N3禽流感病毒全基因组序列分析及对小鼠的致病性研究

2009年在我国南方活禽交易市场进行流行病学调查时,从鸭体内分离到2株H4N3亚型禽流感病毒(AIV),DK/FJ/S1419/09(H4N3)(FJ/419/2009)和DK/HUN/S1010/09(H4N3)(HuN/010/2009)。为了解这2株H4N3亚型AIV的生物学特性,本研究对其进行全基因组分析及对小鼠致病性研究。结果显示:其HA基因来源于近两年流行的H4亚型病毒株,NA基因来源于其它亚型病毒株。内部基因来源较复杂,与FJ/419/2009内部基因同源性最高的病毒株均来自国内H5、H6等亚型分离株,但与HuN/010/2009同源的内部基因则差异较大,与PA、M和NS同源性最高的病毒株分别为A/wild/duck/Korea/UP122/2007(H1N1),A/muscovy/duck/Thailand/CU-LM1983/2009(H4N6)and A/avian/Japan 8KI0068/2008(H3N6)。用106EID50病毒剂量感染6周龄BALB/c小鼠,结果显示试验组小鼠感染后第3 d采脏器样品,仅在鼻甲和肺部能检测到病毒存在。以上数据表明,尽管这2株H4N3特殊亚型组合病毒来源复杂,但对小鼠的致病性较低。     

鸭源H5N5和H5N1亚型禽流感病毒BALB/c鼠感染试验

比较鸭源H5N5亚型禽流感病毒(A/Duck/Changchun/01/2010)和鸭源H5N1亚型禽流感病毒(A/Duck/Liaoning/N/2011)对BALB/c鼠的致病性。以106EID50/50μL剂量鼻腔感染6周龄BALB/c鼠,攻毒后3,5,7,10,14 d取小鼠的肺、脑和肝脏,处理后接种10日龄SPF鸡胚做病毒回收试验,取死亡鸡胚的尿囊液进行RT-PCR检测;分别取接种病毒后5 d小鼠的脑、肝脏、肺脏、脾脏、肾脏进行病理组织学检测。结果显示,小鼠接种H5N5和H5N1亚型禽流感病毒后,均无明显的临床症状,肝脏中分别于接种后3,5 d分离到病毒,肺脏中于接种后5 d分离到病毒,脾脏、肾脏和粪便中均未分离到病毒。病理组织学检测发现,病毒对小鼠的脏器组织产生了不同程度的病理损伤,以肺脏、脑和肝脏较为明显,且H5N1亚型禽流感病毒引起小鼠脑和肝脏的病理损伤比H5N5亚型更严重。这表明2株鸭源禽流感病毒对小鼠均有一定的致病性,且H5N1亚型强于H5N5亚型。     

两株H6N8亚型禽流感病毒分离株的分离与鉴定

为了解禽流感病毒(AIV)在我国华南地区的流行情况,我们对活禽市场中分离得到的两株鸭源H6N8亚型AIV[A/duck/Fujian/S2191/2011 (H6N8) (FJ/191/11)和A/duck/Guizhou/S4035/2011 (H6N8) (GZ/035/11)]进行全基因序列测定,并进行其对SPF鸡和BALB/c小鼠的致病性试验.序列分析显示:HA裂解位点基序为339pQIETR ↓GLFG348,为低致病性AIV特征.内部基因分别源于两个国内流行的H6亚型病毒家系(ST339-like和HuN573-like).序列分析表明FJ/191/11和GZ/035/11为H6亚型病毒与其他亚型AIV的N8NA基因发生重组,呈现明显的异源性.两分离株的感染性试验显示,它们对鸡和小鼠均呈低致病性;而且不能在鸡体内有效复制;对小鼠的感染性实验结果显示,小鼠肺脏和鼻甲病毒分离结果为阳性,其他脏器病毒滴定结果为阴性.     

猪流感病毒H1N1亚型HA蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为获得H1N1亚型猪流感病毒(SIV)血凝素(HA)蛋白的单克隆抗体(McAb),选取A/swine/NanChang/H1N1/2009毒株,病毒经增殖、超速离心后,收集病毒粒子作为免疫原,将SIV粒子包被建立了间接ELISA方法。将免疫4次的BALB/c小鼠,经间接ELISA测定小鼠血清效价,将效价高的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞(sp2/0)进行融合。采用间接ELISA的方法筛选效价高的阳性细胞孔,采用有限稀释法进行3轮亚克隆,得到了5株杂交瘤细胞株,分别命名为2C6、5G5、1D5、3G3、4F11。随后对5株杂交瘤细胞的亚型进行鉴定,显示2C6、1D5、4F11为IgM亚型,5G5、3G3为IgG1亚型,5株杂交瘤的L链均为k链。间接免疫荧光(IFA)和Western blot检测表明,5G5能够与HA蛋白发生特异性的结合。本研究为进一步建立H1亚型SIV的相关检测方法及对HA蛋白的功能研究奠定基础。     

一株H10N1亚型禽流感病毒的遗传演化及其对小鼠的感染性研究

为了解从湖南省某活禽市场分离的一株鸭源H10N1亚型禽流感病毒(AIV) A/duck/Hunan/S10078/2015(H10N1)(简称Hu N/78/15)的生物学特性,本研究对其进行全基因组序列的测定及遗传演化分析,并对其进行BALB/c小鼠的感染试验。序列分析结果显示,该病毒HA基因的裂解位点只含有一个碱性氨基酸,为低致病性AIV (LPAIV)的分子特征。遗传演化分析结果表明该病毒的HA基因与NA基因分别来源于H10N7与H5N1亚型AIV,内部基因来源于H7N9、H4N6、H3N2、H11N7亚型AIV,呈现明显的遗传多样性。小鼠感染试验结果显示,Hu N/78/15能够在小鼠的鼻甲和肺脏中有效复制,但仅引起小鼠轻微的体重变化,表明其对小鼠呈低致病性。本研究结果为H10亚型AIV的持续监测和生物学特性研究提供相应的参考依据。     

一株低致病性H5N6亚型禽流感病毒（AIV）的生物学特性分析

2019年11月本实验室从家禽监测样品中分离鉴定到一株低致病性H5N6亚型禽流感病毒(AIV),命名为A/chicken/Hebei/S1/2019(H5N6)(简称CK/HeB/S1/19)。为进一步了解其生物学特点,本实验对其全基因组测序并进行遗传演化分析,结果显示,该病毒属于2.3.4.4h分支,碱性裂解位点为PLRESR↓GLF,属于低致病性AIV(LPAIV)。对其各基因节段分别经BLAST比对后发现,其外部基因来源于H5N6亚型AIV,内部基因完全来源于H9N2亚型AIV,推测该分离株为一株重组病毒。将CK/HeB/S1/19病毒株接种SPF鸡及BALB/c小鼠研究其致病性,结果显示,该病毒虽然能够感染鸡,但不能在鸡体内有效复制,而该病毒未经适应就可在3只小鼠的鼻甲和肺中进行复制,对小鼠呈低致病性。本研究为H5亚型AIV的检测和其感染的综合防控提供了参考依据。     

一株重配型H1N2猪流感病毒的进化分析及对小鼠的致病性

为了进一步了解我国辽宁省猪流感(SI)的流行情况及病原的进化规律,对2016年年末在辽宁省某生猪屠宰场进行SI病原学监测时分离到的一株H1N2亚型猪流感病毒(SIV)A/swine/Liaoning/FX575/2016(简称FX575)进行全基因组序列测定,通过对其8个基因片段的基因来源进行分析,确定基因型;构建系统进化树;分析相关分子特征;进一步以6周龄雌性BALB/c小鼠为感染模型,通过测定感染后小鼠的体重变化和脏器病毒含量评估病毒的致病性。结果显示:FX575为一株三重重配型的H1N2病毒,遗传进化分析结果显示病毒的HA基因来自于欧亚类禽型H1N1(EA H1N1)分支的SIV,NA基因来自于北美三重配型H1N2分支的SIV,6个内部基因(PB2、PB1、PA、NP、M和NS)均来自于2009/H1N1分支的病毒。以10~6EID₅₀的剂量经鼻腔途径感染小鼠后,能够引起小鼠出现明显的体重下降,其中有1只小鼠在感染后第7天体重下降的比率超过25%,判为死亡;感染后第3天在小鼠肺及鼻甲骨中均检测到较高滴度的病毒,含量分别为4.82、4.20 log₁₀EID₅₀·mL^-1。结果表明SIV在不断流行的过程中,不同基因型病毒之间发生重组导致出现基因三重配的病毒,病毒对小鼠呈现中等致病力特征,提示应进一步加强对SI的主动监测,从而降低病毒对兽医及公共卫生学风险。     

一株鸭源H5N2禽流感病毒全基因组序列分析及对鸡的致病性研究

2012年在我国重庆市活禽交易市场进行流行病学调查时,从鸭体内分离到1株H5N2亚型禽流感病毒(AIV),DK/CQ036/12(H5N2).为了解该株H5N2亚型AIV的生物学特性,本研究对其进行了全基因组分析及对SPF鸡和BALB/c小鼠的致病性试验.序列分析显示:HA裂解位点序列为341R-----346TRGLF350,为低致病性AIV特征.内部基因来源较复杂,与KD/CQ/036/12分离株的M基因NP基因同源性最高的病毒株均来自H4、H7等亚型分离株,呈明显的异源性.分离株的感染性试验显示,该分离株在鸡体内可以通过呼吸道和消化道向外排毒,但并不能在鸡体内有效的复制.对小鼠的感染性试验结果显示,仅在鼻甲和肺能检测到病毒存在,其他脏器病毒滴定结果为阴性,表明病毒对鸡和小鼠均呈低致病性.     

我国和欧盟兽药质量监督抽检工作机制对比研究

为更好地完善我国兽药质量监督抽检计划,通过对欧盟药品抽检管理工作机制的研究,本文分析了欧盟和我国兽药监督抽检管理方式的不同,从抽检责任部门、抽检目的、抽检计划内容、抽检计划制定流程、抽检品种的遴选和检测参数的确定等6方面进行了对比分析,探讨我国兽药质量监督抽检工作的管理中可以借鉴的方面。     

H1N1亚型猪流感病毒A/Swine/GD/2/12基因特征分析

2012年从广东省某猪场的疑似流感猪群采集鼻拭子样品,接种鸡胚并收集尿囊液,通过血凝、血凝抑制和RT-PCR,鉴定出1株H1N1亚型猪流感病毒,命名为A/Swine/GD/2/12。RT-PCR扩增得到全基因8个片段,与GenBank收录的参考毒株比对并构建进化树,发现本毒株可能是H1N1亚型重组株,其8个片段与我国猪源和北美地区1985—1992年间的猪源、禽源(A/turkey/IA/1992)和人源(A/Maryland/12/1991)流感毒株在同一个大分支上,其中与我国猪源参考株同源性在95.8%以上,与北美地区的H1N1参考株同源性在94%以上。HA受体位点分析表明,本毒株既具备结合Saα2,6Gal型人类流感病毒SA受体的特点,也有结合Saα2,3Gal型禽类流感病毒SA受体的可能。提示本毒株可能是由北美地区猪源、禽源和人源的H1N1亚型流感病毒重排形成的。HA蛋白裂解位点分析、NS和PB2蛋白位点分析表明,本毒株具备低致病性毒株的特点。小鼠致病性试验进一步证实本毒株能够引起小鼠运动减少、食欲欠佳、体重减轻等表现,但不会引起咳嗽和死亡等严重反应。     

Susceptibility of bacterial pathogens against lincomycin/spectinomycin (1/2), penicillin G/neomycin (1/1), and penicillin G/dihydrostreptomycin (1/1) as determined in the BfT-GermVet monitoring program 2004-2006

A total of 368 bacterial pathogens, including 72 coagulase-positive and coagulase-variable staphylococci, 97 beta-haemolytic streptococci, 51 Escherichia coli, 75 Pasteurella multocida, 25 Mannheimia haemolytica, 25 Pseudomonas aeruginosa, and 23 Arcanobacterium pyogenes, were investigated for their susceptibility to the three combinations of antimicrobial agents lincomycin/spectinomycin (1/2), penicillin G/neomycin (1/1), and penicillin G/dihydrostreptomycin (1/1) in comparison to their susceptibility to the corresponding single substances. When comparing the minimum inhibitory concentrations (MICs) determined for any of the three combinations with those for the single substances, the lowest MIC of one of the two substances usually determined the MIC of the combination.This observation was made for all three combinations and all bacterial pathogens tested.Thus, it is assumed that the combination of lincomycin with spectinomycin as well as that of penicillin with either neomycin or dihydrostreptomycin resulted in an extended spectrum of target bacterial pathogens rather than in an increase in antimicrobial efficacy.     

A/H1N1研究进展

2009年3以来,包括墨西哥、美国和加拿大在内的许多国家发生了甲型H1N1流感[Swine-origin Influenza A (A/H1N1)]疫情,WHO已于2009年6月20日将此次流感流行的预警级别提升至6级.现已基本明确,引起此次流感疫情的A/H1N1流感病毒是猪流感病毒(Swine Influenza Virus, SIV)的一种新型变异株.此次流感疫情的发生,再次使猪流感成为社会各界关注的焦点之一.本文就甲型H1N1流感的临床表现、病毒特征、相互关系及其对动物卫生监督工作的影响等作一综述.     

猪流感病毒分离株A/swine/Shanghai/3/2014(H1N1)分子特性研究

采用套式PCR检测方法,结合鸡胚分离鉴定,从20份患呼吸道疾病猪的鼻咽拭子样品中分离到1株流感病毒。经亚型鉴定及全基因组序列分析,证实该分离株为H1N1流感病毒,命名为A/swine/Shanghai/3/2014(H1N1)。遗传进化分析表明该分离株与类禽猪流感病毒(Avian-Like H1N1)相似性最高。蛋白序列分析发现,该分离株具有低致病性流感病毒特征,即其HA蛋白的裂解位点为PSIQSR↓GLFGAI。此外,该基因中有7个潜在的糖基化位点,受体结合位点为108(Y)、148~152(GVTAA)、167(W)、197(H)、204~212(DQQ SLYQNA)和238~243(RDQEGR);其中225~228EQAG显示该分离株具有结合SAα2,6Gal受体的能力,证明该分离株具有感染哺乳动物的能力。同时PB2蛋白的627E、701N及NS蛋白的92D位点均证明了该分离株的低致病性和感染哺乳动物的能力。     

H1N2亚型猪流感病毒A／Swine／Guangdong／1／06分离鉴定和对猪致病性研究

2006年5月从广东某大型猪场采集具有流感症状保育猪鼻拭子共98份,无菌常规处理猪鼻拭子后接种MDCK细胞,分离到4株流感病毒.用血凝抑制和PCR方法鉴定均为H1N2亚型.挑选其中一株A/Swine/Guangdong/1/06(H1N2),进行全基因组测序,并与GenBank中相关序列进行比较.核苷酸同源性分析表明:A/Swine/Guangdong/1/06(HIN2)与A/Swine/Guangxi/13/06不同基因之间同源性为96.6%～98.1%.以106EID50的剂量,将H1N2病毒鼻腔感染35日龄仔猪,结果表明H1N2亚型流感病毒可以感染猪上呼吸道.但不表现临床症状.本研究结果对于揭示H1N2亚型猪流感流行规律和病毒的致病机理具有一定的意义.     

Morphologic heterogeneity of a strain of swine influenza virus (A/swine/Wisconsin/1/68, Hsw1N1) propagated at different temperatures.

Strain A/swine/Wisconsin/1/68 (WI/68) swine influenza virus (SIV) was propagated in embryonating chicken eggs at 33, 35, or 37 C. The SIV harvested from eggs incubated at 33 C invariably had higher hemagglutination (HA) and egg infectivity titers than did SIV propagated in eggs at the 2 higher temperatures. When SIV inoculum propagated at 33 C was inoculated into separate groups of eggs and incubated at 33, 35, and 37 C, the SIV harvested from inoculum incubated at the 2 higher temperatures had significantly lower infectivity and HA titers than did that propagated at 33 C. By electron microscopy (EM), viral particles of Wi/68 were of various sizes and shapes regardless of the temperature used to propagate the virus. However, in contrast to what was seen in SIV harvested from innoculum incubated at 33 C incubation, pleomorphic shapes and particles with surface abnormalities were much more frequent in SIV harvested from inoculums kept at the 2 higher temperatures. Approximately one-third of the particles from 35 and 37 C incubation either were spikeless or were relatively deficient in surface spikes.     

H5N1亚型禽流感病毒A/goose/Guangdong/1/96的NS基因对鸡致病能力的影响

为了解H5N1亚型禽流感病毒经自然途径感染SPF鸡后，病毒的致病能力与NS基因的关系，本文主要从病理学角度比较了两株利用反向基因操作技术拯救的病毒RGSGD／1／96和RGSGD／1／2NS的致病能力。虽然只有NS基因不同，但是这两株病毒经鼻腔感染4周龄SPF鸡后表现出完全不同的致病能力，RGSGD／1／96对鸡的致死率为100％，感染鸡只的各组织脏器均可发现严重的病理损伤，该病毒在鸡体内复制能力很强，感染后3d、6d，各组织脏器均可发现大量的病毒抗原；GSGD／1／2NS对鸡的致死率为0，病毒在感染鸡体内只引起肺间质少量淋巴细胞浸润，免疫组织化学检查未发现病毒抗原信号。由于两株病毒只有NS基因不同，说明NS基因决定了H5N1亚型禽流感病毒A／goose／Guangdong／1／96对SPF鸡的致病能力。     

瘤胃调节剂在反刍动物生产中的应用研究进展

随着反刍动物规模化养殖的发展,高精料饲喂是促进反刍动物快速生长的常用策略,但这通常会导致动物瘤胃代谢紊乱等问题。瘤胃调节剂作为一类高效、安全、价格低廉的营养代谢调控剂在反刍动物饲养中得到广泛应用,但其使用的效果和作用机制目前还存在着不同的观点。本文综述了瘤胃调节剂在反刍动物中应用的国内外研究进展,以期为今后开展瘤胃代谢调控研究提供参考。     

H5N1亚型禽流感病毒A/Guangxi/1/2005株抗药机制的研究

为研究H5N1亚型禽流感病毒(AIV)的抗药机制,本研究选取Clade2.3.4亚群中一株对金刚烷胺敏感的人源AIV A/Guangxi/1/2005(H5N1)(S-GX05),用抗流感病毒药物金刚烷胺对其进行定向诱导,筛选出一株抗药性病毒株,命名为R-A/Guangxi/1/2005(R-GX05)。通过全基因测序并与S-GX05全基因序列进行对比,结果显示S-GX05只在其M2蛋白中有一个氨基酸位点发生突变,即A30P;抗药性鉴定这两株病毒的半数药物抑制浓度(IC50)分别为0.9μM和48.9μM,表明R-GX05对金刚烷胺表现出一定程度的抗性。动物实验证实,这两株病毒对BALB/c小鼠的致病性基本一致,均表现出高致病性,其MLD50分别为4.7 log10 EID50和5.0 log10 EID50,两株病毒在小鼠体内各组织脏器中的分布及增殖能力也基本相同。这些结果表明,S-GX05在药物压力下产生抗药性后,并未引起其它生物学特性的改变。A30P的发现为进一步从分子水平上研究H5N1亚型AIV的抗药机制及新型抗流感新药的研发奠定了基础。