Rep-PCR技术及其应用现状

文章着重介绍了Rep-PCR技术原理、特点及其在细菌、真菌、环境微生物遗传多样性研究方面的应用.Rep-PCR目前发展迅速并被广泛应用于多种细菌基因分类,此方法操作方便,可以大样本进行,且Rep-PCR分辨效果好,可重复性强.现在Rep-PCR可自动化分型,并可建立各种细菌REP、ERIC-PCR分型标准数据库.但Rep-PCR也存在一定问题,不同来源的或不同批次的引物和酶,对Rep-PCR结果都有一定的影响.     

大肠杆菌的耐药机制及中药对大肠杆菌R质粒消除作用的研究

抗生素的发展和广泛应用使许多细菌引起的疾病得到了一定的控制，但是其发病率和病死率仍居高不下。究其原因，与细菌耐药性（特别是多重耐药现象）的产生有一定的相关性。产生耐药的机制十分复杂，耐药性主要由染色体或耐药质粒（R质粒）介质，R质粒可通过接合、转化、转导等方式在不同菌株之间传递，使敏感菌成为耐药菌，造成了R质粒的流行。R质粒的传递使得耐药性在细菌间广泛播散，又使一部分体内正常菌群成为耐药基因库，大大增加了治疗和预防的困难。     

RT—PCR快速诊断鸽新城疫

2008年11月成都市某种鸽场5120只种鸽发生急性疾病并出现大批死亡。临床表现有下痢和歪头缩颈等明显神经症状,剖检变化有全身性的黏膜和浆膜出血,并伴有呼吸道和消化道病变,经实验室细菌分离鉴定和RT—PCR检测,确诊为鸽新城疫。目前使用LaSota、V4等鸡新城疫疫苗进行免疫,可有效地控制该病在鸽群中的流行。     

PCR技术用于病原微生物的血清型鉴定研究进展

PCR技术已被广泛应用于各种病原细菌及病毒的检测，而且已从用于鉴定病原微生物的种属发展到血清型及微生物株间差异的鉴定。作者综述了有关血清分型的PCR研究进展，重点关注了引种的选择。     

表达绿色荧光蛋白的伪狂犬病毒Bartha-K61株TK-突变株的构建

提取伪狂犬病毒(PRV)Bartha—K61株基因组DNA为PCR扩增模板，并根据GenBank已发表的PRV Ka—plan株UL区UL25、UL24、UL23、UL22基因序列，选择保守序列设计了两对引物，分别扩增出位于UL23(TK)两侧(含部分TK基因)的可用于同源重组的左臂片段(L)和右臂片段(R)，L包括部分UL25、全部UL24、部分TK，R包括部分TK及部分UL22，L和R的拼接片段中TK基因内部缺失270个核苷酸。将L片段和R片段克隆于pBlueseript M13—载体上，获得pSKLR；再将绿色荧光蛋白载体pEGFP—C1上含GFP及其多克隆位点的完整的基因表达盒插人pSKLR的L片段和R片段之间构成转移载体pSKLRG。提取pSKLRG质粒，经单酶切线性化后用脂质体与PRV Bartha—K61株共转染143TK^-细胞，在细胞培养液中有5—溴脱氧尿嘧啶(BrdU)存在的条件下筛选出表达绿色荧光蛋白的重组PRV Bartha—K61毒株：PRV rBGFP。     

中医辨证和中药方剂防治动物细菌性肺炎的研究进展

<正>细菌性肺炎是由于细菌病邪感染肺部引起的炎症反应，给畜禽养殖业造成巨大损失。目前，临床治疗细菌性肺炎多针对不同的病原菌选取相应的抗菌药进行对因治疗。为有效遏制动物源细菌耐药，整治兽药残留超标，我国农业农村部制定了减量化使用兽用抗菌药物相关标准^[1]。中医药治疗细菌性肺炎有独特优势，现代药理学研究表明，中药的活性成分丰富，且具有抗菌、抗炎、增强免疫力等作用。中医以病证为核心，根据症状对个体辨证分型，在疾病的不同阶段配以相对应的药物。目前，已有从中医入手治疗动物细菌性肺炎的报道，并取得了较好的效果^[2-4]。本文对治疗细菌性肺炎常用的中药方剂进行了分析和整理，希望为治疗细菌性肺炎的新型药物研发以及细菌性肺炎的临床治疗提供一定的参考依据。     

SYBR GreenⅠ荧光RT—PCR方法检测禽流感病毒

为建立检测禽流感病毒（AIV）的SYBR Green Ⅰ荧光RT-PCR方法，根据AIV的M基因保守区的核苷酸序列设计引物。用4株不同亚型的AIV感染MDCK细胞，收集感染6、12、24、48、72h的病毒。另外采取169份鸡的泄殖腔拭子和咽喉拭子。对上述样品的M基因进行检测，试图建立快速检测AIV的SYBR GreenⅠ荧光RT—PCR方法，并与普通RT—PCR方法和传统的病毒滴定方法进行比较。结果表明：此次建立的检测AIV的SYBR GreenⅠ荧光RT-PCR方法能检测到感染MDCK细胞后72h的AIV，对169份泄殖腔拭子和咽喉拭子中的AIV检出率为5．33％（9／169），而普通RT—PCR方法检出率为6．51％（11／169），病毒滴定检出率为5．62（9／160）。对其他病毒（NDV、IBDV、IBV、VA）则未检测到，且整个检测过程只需4h，表明该方法特异、准确、快速。     

五重PCR检测大肠杆菌O157:H7菌体抗原和毒素基因

针对O157：H7大肠杆菌O抗原抗血清同多种细菌有交叉反应，而单一毒素基因并不是O157：H7所独有这一特点，建立了五重和四重PCRA-法，同时检测大肠杆菌O157：H7的O抗原、H抗原和4种毒素基因，可在较短的时间内检测、鉴定大肠杆菌O157：H7，并有较高的特异性，解决了传统细菌检测方法耗时长、灵敏度低，并有交叉反应等问题。     

应用多重PCR快速诊断山羊猝死症的研究

对2例突然死亡的山羊病料进行细菌分离培养，再应用多重PCR方法对可疑菌进行鉴定和基因分型，结合流行病学、临床症状、病理变化，诊断为A型产气英膜梭菌引起的山羊猝死症，通过毒素中和试验加以验证，两者结果相一致，说明多重PCR方法可以用于动物猝死症的快速诊断。     

犬产气荚膜梭菌的分离和PCR检测方法的建立

从12头疑似产气荚膜梭菌感染的猝死警犬中分离获得了18株病原菌，经生化试验及毒素中和试验，确定为A型和C型产气荚膜梭菌。参考GenBank中登录的基因序列，设计合成了针对产气荚膜梭菌α、β、ε、ι、CPE和β2共6对分型毒素基因的引物，对以前昆明地区分离的1株产气荚膜梭菌进行了PCR扩增，结果扩增出了与预期大小相同的6个基因片段，分别为233、196、324、446、567和665 bp。建立的PCR方法能同时用于产气荚膜梭菌鉴定和毒素分型，较细菌毒素检测方法快速，与细菌分离鉴定的结果一致。     

PCR检测感染鸡沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌

用ＰＣＲ技术检测鸡感染沙门氏菌ＤＮＡ并与常规细菌分离培养作比较。从感染鸡沙门氏菌或鼠伤寒沙门氏菌的鸡组织中提取ＤＮＡ。所用的一对引物是ＩｎｖＡ中的定向序列合成的，细菌分离自样品的顶培养物。用ＰＣＲ技术从感染鸡组织ＤＮＡ中扩增了２８４ｂＰ的一个片段，与预期的结果一致。用ＰＣＲ方法不仅可检测出细菌分离阳性鸡组织中的ＤＮＡ，而且可以检出细菌分离阴性鸡组织中的ＤＮＡ，从２０个感染鸡沙门氏菌２１ｈ后的样品中     

一例副猪嗜血杆功病的诊断与防治

为了对辽宁省副猪嗜血杆菌血清进行分型及对优势疫苗株进行筛选，将2013年5月份就诊的一例猪副猪嗜血杆菌病疑似病例，通过流行病学、临床症状和病理剖检变化初步诊断后，进行细菌的分离培养、生化试验鉴定和PCR检测，确诊为副猪嗜血杆菌病，同时对分离的菌株进行药敏试验，并根据药敏试验结果进行治疗，取得了良好的治疗效果。     

鸽圆环病毒SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法的建立及应用

为建立一种针对鸽圆环病毒(PiCV)的快速诊断方法,试验根据PiCV的Rep保守基因序列,设计合成一对特异性引物,建立了PiCV荧光定量PCR检测方法,对其敏感性、特异性、重复性进行评价并利用该方法对临床样本进行检测。结果表明:在最佳反应条件下,所建立的PiCV荧光定量PCR方法在1.43×10²~1.43×10⁸copies/μL标准品范围内具有良好的线性相关性,线性相关系数为0.998;敏感性试验结果显示,该方法最低可检测到1.43×10²copies/μL标准品,是常规PCR检测方法的1000倍;特异性试验结果显示,该方法与其他常见的鸽病病原不发生交叉反应;重复性评价结果显示,批内与批间的变异系数均小于0.8%;所建立PiCV荧光定量PCR方法对临床鸽血清样品检测结果显示,PiCV阳性率达38.7%,高于常规PCR方法的检测阳性率(28.7%),说明该方法具有良好的适用性。研究结果PiCV的流行病学调查、病原学监测及定量研究奠定了基础。     

沙门菌基因分型研究进展

沙门菌是一种常见的致病菌,种类繁多,具有2 600多种血清型。近年来,基于基因序列的分型方法被应用于沙门菌基因分型的研究中,并且显示了很好的分型能力,并成为沙门菌传染病暴发调查和分子流行病学分析中的常规工具。基因分型方法主要有:脉冲场凝胶电泳(pulsed field gel electrophoresis,PFGE)、基因组重复序列PCR(repetitive extragenic palindromic PCR,Rep-PCR)、多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)、全基因组单核苷酸多态性分型(whole gene single nucleotide polymorphism,wgSNP)、核心基因组多位点序列分型(core genome multilocus sequence typing,cgMLST)等,每种分型方法也有各自的优缺点和使用条件及适用范围。其中,随着全基因组测序(WGS)时代的到来,cgMLST和wgSNP方法已经成为当前研究热点。     

应用PCR-RFLP及PCR-SSCP技术检测猪RN基因的研究

RN(Rendement Napole)基因是影响猪肉肉质性状的一个主效基因，已被定位在猪的15号染色体上(15q25)，该基因在猪肉品质上存在严重的负面效应。应用限制性片段长度多态性(RFLP)和单链构象多态性(SSCP)分析技术快速检测猪RN基因，根据RN向200Q突变的原理设计引物，PCR扩增后得到一段长约577bp的片段，两种方法得到相同的结果。     

传染性支气管炎病毒山东及北京分离株血清型及RFLP基因分型的比较研究

分离并鉴定出山东省不同地区的IBV分离株A、B、C、D和北京分离株F，利用中和试验分别对各分离株及标准株M41、T等进行血清分型。设计一对此物，分别对各毒株的S1基因进行RT－PCR扩增，扩增片段长约1700bp，利用其PCR产物进行HaeⅢ酶切，根据酶切图谱，进行基因分型。结果表明：A、C、D和M41酶切图谱相同，属Mass基因型，分别为900、400和300bp左右的片段；北京F株有4条酶切条带，与4／91基因型不同，分别为1000、300、200和小于100bp左右的片段；B株有4条酶切条带，理论推断与T株相似，分别为700、500、300和180bp左右的片段，可能为同一基因型。血清学分型结果与基因分型结果不符。     

胶体金法与荧光RT-PCR法检测禽流感病毒结果比对分析

禽流感是养禽业毁灭性疾病之一，尤其是高致病性禽流感可导致100％的发病率和死亡率，对养殖户造成巨大的损失，禽流感的防控与监测更是引起社会各界的关注。本次研究通过荧光RT—PCR检测法和胶体金检测法分别对江门市活禽交易市场随机抽取的样品进行禽流感病毒检测，并对检测结果进行比对，分析了2种检测方法的优缺点及其检测结果的准确率，结果表明，胶体金法检测相对荧光RT—PCR法有一定漏检和误检现象存在。     

细菌全基因组测序技术用于沙门氏菌流行病学调查的可行性分析

为探讨细菌全基因组测序（whole genome sequencing，WGS）技术在基层沙门氏菌防控中的优势与可行性，对前期分离的9株沙门氏菌进行细菌全基因组测序，并进行血清型预测、多位点序列分型（multilocus sequence typing，MLST）和耐药基因分析，将全基因组测序结果与传统血清分型和耐药性分析结果进行对比。结果显示：基于全基因组测序数据的血清分型结果与传统血清分型结果符合率为100%，两种方法对9株沙门氏菌血清分型结果完全一致；两种方法分析出的β-内酰胺类、氯霉素类、喹诺酮类和氨基糖苷类药物的耐药基因与耐药表型符合率为100%，即耐药菌株中均含有4大类抗菌药物的耐药基因；用全基因组测序检测到利福平、磺胺类和四环素3大类抗菌药物的7个耐药基因，表明9株沙门氏菌可能对这3大类抗菌药物耐药。结果表明：全基因组测序结果与传统实验室诊断结果完全一致，且具有快速、低成本、操作简单等优势，并且随着测序技术的发展，其检测成本和周期将进一步缩减，因此基于细菌全基因组测序开发沙门氏菌快速分型和耐药性分析方法有一定的应用价值和可行性。     

我国部分地区新城疫病毒的流行现状分析

从近年来由我国不同地区、不同宿主分离到的新城疫病毒(NDV)野外分离株中，选取其中具有代表性的16株，用RT—PCR技术扩增其F基因重要的功能区片段，进一步进行克隆和序列测定。参照国内外已发表的部分毒株的F基因序列，构建了59株NDV的遗传进化树，分析其毒株间的遗传进化关系。序列分析表明，所扩增的目的片段长度为535bp，所分离的毒株在分裂位点的氨基酸顺序为^112R—R—Q／R—K／R—R—F^117，均相当于NDV的强毒株。通过遗传进化树分析表明，16株分离株中有13株为基因Ⅶ型NDV，说明目前基因Ⅶ型NDV所引起的新城疫在国内呈流行趋势。     

应用PCR技术检测鸭疫里默氏杆菌的研究

根据已发表的鸭疫里默氏杆菌15型CVL110／89株编码42－kDa主要外膜蛋白的基因序列设计并合成一对引物，建立PCR方法，对7个血清型的鸭疫里默氏杆菌纯培养菌及野外病死鸭病科组织进行检测。结果表明，7个血清型的鸭疫里默氏杆菌纯培养菌DNA都可扩增出809bp的DNA片段，而对照的2株大肠杆菌和1株沙门氏菌纯培养物DNA扩增结果为阴性；在对24只不同鸭场病死鸭肝、脑的检测中，脑的检出率为19／24（高于细菌分离的13／24），肝脏的检出率为11／24（高于细菌分离的8／24）。由此可见，建立的PCR技术可用于鸭疫里默氏杆菌的鉴定和快速诊断（取脑组织）。但此方法是否对其他血清型的鸭疫里默氏杆菌也适用，有待于收集这些血清型的菌株进行验证。