小鼠MSCs体外定向诱导分化神经及脂肪细胞的研究

 【目的】建立昆明小鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养体系,并鉴定其定向诱导分化为神经及脂肪细胞的能力。【方法】采用贴壁培养法分离培养昆明小鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）,通过相差倒置显微镜对其进行形态学特征观察;通过碱性磷酸酶（AKP）染色、Hoechst 33258染色、瑞士-姬姆萨复合染色检测MSCs的表型特征;通过β-ME诱导MSCs定向分化为神经样细胞,诱导后的细胞进行H.E染色,观察其形态学特性;通过NF-200、NSE免疫荧光细胞化学方法对已分化的神经样细胞进行鉴定和分化率分析;通过马血清诱导MSCs定向分化为脂肪细胞,观察其体外生长过程,并对诱导后的脂肪细胞进行油红O染色鉴定和分化率分析。【结果】分离得到的MSCs为成纤维样细胞,可见多个核仁,AKP染色阳性率为93.2%±1.5%;β-ME诱导后,MSCs分化为多种表型的神经细胞与原代培养的小鼠全脑细胞的外形相似,诱导后的神经细胞NF-200、NSE免疫荧光细胞化学染色均呈阳性,NF-200阳性率为85.4%±1.8%,NSE阳性率为82.7%±2.1 %;马血清诱导后,MSCs可100%分化为脂肪细胞,油红O染色为阳性。【结论】 采用贴壁培养法能够成功分离和培养昆明小鼠的MSCs,分离得到的MSCs具有定向分化成多种神经细胞和脂肪细胞的能力。     

奶山羊骨髓间质干细胞的分离培养及生物学特性研究

【目的】分离、培养奶山羊骨髓间质干细胞(MSCs),探讨其生物学特性,为心血管、神经退化,尤其是不育症患者的细胞移植治疗及相关细胞发育分化研究奠定基础。【方法】采用贴壁培养法进行MSCs的分离和培养,通过形态学观察、生长曲线测定、免疫细胞化学染色和RT-PCR技术等进行检测;并采用免疫细胞化学法对自发分化的细胞及定向诱导分化的神经样细胞、心肌样细胞、生殖样细胞进行检测,计算生殖样细胞的阳性率。【结果】分离得到的MSCs为成纤维样细胞,其增殖能力强,无致瘤性,已连续传代至22代;其表达胚胎干细胞(ESCs)的表面标记Oct4、Nanog、C-myc和TERT;MSCs形成类胚体自发分化的细胞表达3胚层特异标志基因AFP、β-ⅢTubulin和心肌α-actin;MSCs经β-巯基乙醇诱导,定向分化为表达Nestin和β-ⅢTubulin的早期神经样细胞,经5-氮胞苷(5-Aza)诱导,可定向分化为表达CT3及心肌α-actin的心肌样细胞,并出现肌管样结构,经维甲酸(RA)诱导,分化的细胞表达生殖细胞减数分裂前期的蛋白Vasa、Scp3和CD49f(α6整合素)等生殖细胞标记,其阳性率分别达到35.7%,24.0%和14.0%。【结论】自奶山羊骨髓分离得到MSCs,其具备间质干细胞的基本特性,并具有向神经细胞、心肌细胞、生殖细胞分化的潜能。     

小鼠EG细胞体外分化为神经细胞的一种简单有效方法

【目的】探讨一种简单有效的小鼠EG(Embryonic germ cells,EG)细胞体外分化为神经细胞的方法。【方法】将昆明小鼠EG细胞在老化饲养层上培养3~4周,使EG细胞在高密度条件下向神经细胞分化,研究不同浓度维甲酸(Retinoic acid,RA)对EG细胞分化的诱导效果。【结果】小鼠EG细胞在高密度培养条件下向神经细胞分化,可获得较高比例的神经细胞样克隆,nestin染色阳性率达62.9%;经检测EG细胞分化产生的神经细胞样克隆外层细胞,以及从克隆中迁出的细长细胞均表达神经前体细胞标志nestin;在相同RA浓度下,随着EG细胞分化时间的延长,TH+(tyrosine hydroxylase,TH)神经细胞的比例增加;而在不同RA浓度下,随着RA浓度的升高,TH+神经细胞的比例呈增加趋势,经RA诱导14 d,最高可获得(2.3±0.2)%的TH+神经细胞。【结论】昆明小鼠EG细胞在老化饲养层上高密度培养条件下,能自发分化为神经细胞,RA诱导可显著提高分化细胞群体中TH+神经元细胞的比例。试验建立的这种简单有效方法可用于EG细胞体外分化为神经细胞。     

牛诱导性多能干细胞向心肌细胞的诱导分化

【目的】研究牛诱导性多能干细胞(Bovine induced pluripotent stem cells,biPSCs)向心肌细胞的分化能力。【方法】将biPSCs悬浮培养制备类胚体,采用类胚体介导体外自由分化与定向诱导分化(添加RA、DMSO和RA+DMSO3种诱导物)的方法,使biPSCs在体外分化,比较了biPSCs在3种不同心肌诱导条件下定向分化为心肌细胞的诱导效率;分别提取biPSCs、类胚体及不同诱导体系分化细胞的总RNA,用RT-PCR检测心肌细胞发育标志基因的表达。【结果】biPSCs在悬浮条件下培养7d,能够形成典型球形和囊腔样类胚体。类胚体再贴壁培养7d,经过免疫细胞化学检测,贴壁细胞大量分化为α-actin阳性的心肌样细胞。在体外诱导分化体系中,RA+DMSO共同诱导的效率较RA和DMSO单独诱导显著增高(P0.05)。RT-PCR结果显示,各组分化后的细胞中心肌细胞发育特异性基因ACTA2与GATA4均有高水平表达。【结论】biPSCs在体外悬浮培养能够形成类胚体,类胚体贴壁培养后可以分化为α-actin阳性的心肌样细胞;分化形成的心肌样细胞均表达心肌特异性基因。     

3种培养体系下人胚胎干细胞神经诱导分化的比较

【目的】比较人胚胎干细胞在人胚胎成纤维细胞、鼠胚胎成纤维细胞饲养层和无饲养层3个诱导体系下形成神经上皮祖细胞的能力。【方法】将人胚胎干细胞在人、鼠胚胎成纤维细胞饲养层或无饲养层体系中诱导10 d后,检测其胚胎干细胞和神经上皮祖细胞相关基因(Oct4、Nestin、Pax6、Sox1、Sox2、Sox3、β-actin)的表达,用免疫荧光染色法检测神经上皮祖细胞抗原标记Pax6、Musashi、Nestin和胚胎干细胞抗原标记SSEA4的表达。【结果】3种诱导体系下均有神经上皮祖细胞形成,均表达神经上皮祖细胞抗原标记Pax6、Musashi、Nestin及Pax6、Nes-tin、Sox家族基因。无饲养层体系诱导后的细胞,Oct4基因的表达高于有饲养层体系;其SSEA4染色阳性细胞比例为(26.3±3.5)%,高于有饲养层体系;其Pax6和Musashi染色阳性细胞比例分别为(81.0±3.0)%,(79.0±4.4)%,均低于有饲养层细胞体系。【结论】人胚胎干细胞在有饲养层和无饲养层体系中均可诱导分化形成神经上皮祖细胞,但无饲养层体系的效率相对较低,且有未分化胚胎干细胞残余。     

牛iPSCs向神经细胞的诱导分化

【目的】通过类胚体介导体外自由分化与诱导分化,验证所建立的牛诱导性多能干细胞(Bovine induced pluripotent stem cells,biPSCs)能否分化为外胚层的神经细胞。【方法】将biPSCs悬浮培养以制备类胚体,通过类胚体介导使biPSCs在添加全反式维甲酸(RA)和β巯基乙醇(β-Me)诱导体系中分化为神经细胞,比较其诱导效率;提取不同诱导体系的分化细胞与类胚体的总RNA,利用RT-PCR方法鉴定分化细胞中神经细胞特异性基因的表达。【结果】培养的biPSCs集落呈球形,中央隆起,周围界限清晰,与胚胎干细胞集落形态类似。biPSCs碱性磷酸酶(AP)染色为阳性,并表达SSEA-4干细胞特异性表面蛋白。biPSCs通过类胚体介导分化,在未添加化学诱导物的条件下,可自由分化为Nestin、GFAP与NSE阳性神经细胞,其阳性细胞率分别为(15.14±1.13)%,(6.25±0.35)%和(5.45±0.62)%;biPSCs在RA诱导组中分化的神经细胞的数量最多,诱导后表达Nestin、GFAP和NSE细胞的阳性率分别为(49.56±2.33)%,(16.58±1.28)%和(13.66±2.21)%;在β-Me诱导组中,表达Nestin的阳性细胞率为(42.23±1.25)%。2个诱导组的诱导效率与无化学诱导物组有显著差异(P0.05)。RT-PCR检测结果显示,不同诱导体系获得的分化细胞均能扩增到神经细胞特异性基因Nestin和βⅢ-Tubulin片段,产物长度与预期结果完全一致。【结论】biPSCs在体外具有向神经细胞发育的能力;RA是诱导biPSCs向神经细胞分化的良好诱导物。     

胚胎干细胞诱导分化研究进展

哺乳动物胚胎干细胞一般可从胚胎囊胚内细胞团分离得到 ,具有在体外保持不分化的无限增殖能力 ,在合适的培养条件下 ,胚胎干细胞可定向诱导分化形成多种细胞类型。人们对胚胎干细胞进行体外培养与定向分化可以得到大量同源细胞 ,以应用于患疾病的细胞或器官移植治疗等研究。文章概述了胚胎干细胞增殖与分化的信号调节机制、诱导分化方法 ,国内外研究概况及展望 4个方面的内容     

胎猪胰岛源胰腺干细胞分离培养与诱导分化试验

 【目的】分离培养胎猪胰腺干细胞对其进行功能检测。【方法】用先悬浮后贴壁的方法从胎猪胰岛获得胰腺干细胞，用免疫组化方法鉴定该细胞，以MTT法测定其不同代次的生长活性，诱导该细胞成为胰腺内分泌细胞并检测其功能。【结果】分离得到的细胞不表达nestin，而表达导管上皮细胞标志ck-19、平滑肌标志α-actin,其在体外的生长行为有类似胚胎干细胞样生长形态，细胞体外增殖活力很强，现已传至18代，细胞经诱导后分化为分泌胰岛素的胰腺内分泌细胞，并且伴随着细胞超微结构的改变。【结论】通过本方法可以分离到胎猪胰腺干/祖细胞，经诱导分化可形成有功能的胰岛样细胞团并释放胰岛素。     

转EGFP基因猪胎儿神经干细胞的体外分化

 【目的】获得转EGFP基因神经干细胞并监测其自我更新、增殖和多向分化潜能;通过用EGFP对神经干细胞进行标记和体外追踪实验,为EGFP作为示踪标记对神经干细胞进行体内移植研究奠定基础。【方法】利用神经干细胞培养技术体系,从胎龄30 d猪胎儿脑组织中分离培养神经干细胞,通过脂质体介导转染技术,将EGFP基因导入神经干细胞,诱导转基因神经干细胞贴壁分化,观察其体外增殖、分化特点。采用RT-PCR技术检测干细胞和分化细胞表面标志或相关基因。【结果】成功分离培养出神经干细胞,获得转EGFP基因神经干细胞,神经干细胞在表达EGFP的同时仍具有多向分化潜能。神经干细胞中Nestin表达强阳性,NogoA、DCX、CyclinD2、CD133、Hes1、Oct4、CD-90、Nanog和Sox2表达阳性;体外诱导的神经干细胞可以分化为星形胶质细胞(表达GFAP)、少突胶质细胞(表达GalC)和神经元细胞(表达NF、NSE和MAP2);能分化为脂肪细胞(表达LPL和PPARγ-D)、成骨细胞(表达Osteonectin和Osteocalcin)、肌细胞(表达myf-5、myf-6和myoD)、内皮细胞(表达CD31、CD34、CD144和eNOS)和软骨细胞(表达COL2A1)。【结论】从猪胎儿大脑组织分离神经干细胞具有可行性和有效性,转EGFP基因神经干细胞具有自我更新、增殖和多向分化潜能,可以用EGFP对神经干细胞进行标记、追踪,作为示踪标记进行神经干细胞体内移植研究。     

脂代谢通路对鸡雄性生殖细胞分化的调控机制

【目的】探索家鸡雄性生殖细胞分化过程中脂代谢相关基因以及信号通路的调控机制,以期为完善体外诱导体系提供依据。【方法】采用流式细胞分选法获得纯度较高的胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)、原始生殖细胞(primitive germ cells,PGC)和精原干细胞 (spermatogonial stem cell,SSC),提取细胞总RNA。利用RNA-seq高通量分析方法对这三种细胞进行转录组水平测序,进行GO（Gene ontology）分析和KEGG通路富集,寻找脂代谢相关基因以及信号通路;并利用脂代谢--视黄醇代谢通路终产物视黄酸（retinoic acid,RA）以及抑制剂苯磺酰异羟肟酸 (piloty’s acid)在体外诱导ESC向雄性生殖细胞分化和体外鸡胚注射后孵化,qRT-PCR（quantitative real time PCR）检测视黄醇代谢通路上差异基因的表达变化,与RNA-seq结果进行比较分析同时检测雄性生殖细胞标记基因的变化情况。【结果】GO功能显著性富集和 Pathway 显著性富集分析结果发现：在ESC向SSC分化过程中共存在328个基因持续参与脂代谢调控,富集到27条脂代谢通路中,包括视黄醇代谢、初级胆汁酸的合成、甾类激素的生物合成、脂肪酸代谢、甘油酯代谢以及类固醇的生物合成等通路。在视黄醇代谢通路中ADH5在PGC中特异表达,ALDH1A1在整个发育过程中持续上调,ADH5和ALDH1A1在细胞中参与视黄酸的合成;CYP26b1在整个发育过程中持续上调,参与视黄酸的降解过程;RA体外诱导ESC向SSC方向诱导试验结果表明ADH5、ALDH1A1和CYP26b1家族基因在体外RA诱导过程中变化与体内分化过程一致,RA诱导组产生的SSC样细胞显著高于控制组和Piloty’s Acid+RA组。鸡胚注射抑制剂试验结果表明视黄醇通路被抑制后孵化至18d后SSC细胞表面特异标记基因integrinα6和integrinβ1的表达水平显著的低于正常的孵化组(CON)和阴性对照组（BLANK）【结论】脂代谢--视黄醇代谢通路在家鸡雄性生殖细胞的分化过程中起重要作用,体外利用视黄醇代谢通路终产物RA进行诱导时第2天出现类胚体,第4、6天类胚体逐渐增大,第8天开始裂解,在第10天出现SSC样细胞,而在诱导过程中抑制视黄醇通路信号后则会降低SSC样细胞的产生,而在体外孵化过程中视黄醇通路抑制后也能影响SSC细胞的产生。     

蛋白质代谢通路对鸡雄性生殖细胞分化的调控

【目的】探究蛋白质代谢在鸡雄性生殖细胞分化过程中的作用机制,为完善鸡胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)体外向雄性生殖细胞诱导分化体系研究提供依据。【方法】采用流式分选的方法获取高纯度的ESC、原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)和精原干细胞(spermatogonia stem cell,SSCs),分别提取细胞的总RNA,采用RNA-Seq方法对3种细胞的转录本进行深度测序,然后进行WEGO(web gene ontology)和KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路富集分析,筛选出鸡雄性生殖细胞分化过程中参与蛋白质代谢的关键通路及其关键基因,RT-q PCR(Real time Quantitative PCR)检测部分关键差异基因的表达变化,并与RNA-Seq(RNA sequencing)结果进行比较分析,同时分别从体内和体外水平对关键基因NOS2进行抑制,观察各分组不同天数的细胞形态变化及检测NOS2和C-kit、Cvh、Stra8、Dazl、integrinα6和integrinβ1等生殖标记基因表达变化情况。【结果】在雄性生殖细胞分化的整个阶段,有697个差异基因参与生物代谢,显著富集于精氨酸-脯氨酸代谢通路、酪氨酸代谢通路以及色氨酸代谢通路,在这3条通路上筛选出NOS2、FAH和IDO等关键性基因,这些基因的在ESCs向SSCs分化过程中表达变化趋势与其在RNA-Seq中的结果一致。体内抑制NOS2基因后,NOS2及C-kit、Cvh、Stra8、Dazl、integrinα6和integrinβ1等生殖标记基因在空白组和对照组之间无显著性的差异,而在抑制剂组中,NOS2及C-kit、Cvh、Stra8、Dazl、integrinα6和integrinβ1等生殖标记基因的m RNA表达量均出现了降低;而体外抑制NOS2基因后,对照组中的ESCs在2、4、6、8和10d内细胞不断增殖,但是未出现类胚体;RA诱导组中,2d出现小的类胚体,4d类胚体增大,且数量增多,6d类胚体边缘开始出现破裂,8d类胚体解体,10d出现类精原样细胞;抑制剂组中,ESCs在2、4、6、8和10d内无类胚体出现,且相较于对照组细胞增殖缓慢;RA+抑制剂组中,2和4d内无类胚体出现,细胞增殖缓慢,6d出现小的类胚体,8d类胚体数量少量增多,且体积稍显增大,10d类胚体开始裂解。并且经过抑制剂的抑制后,NOS2及C-kit、Cvh、Stra8、Dazl、integrinα6和integrinβ1等生殖标记基因的表达量在RA诱导组、抑制剂组和RA+抑制剂组中相对于对照组均呈显著性或极显著性的下调趋势。【结论】基于RNA-Seq技术及生物信息学方法筛选出ESCs向雄性生殖细胞分化过程中精氨酸-脯氨酸代谢通路及关键基因NOS2的基础上,通过对NOS2基因在鸡体内和体外的抑制,发现NOS2在被抑制后,ESCs向雄性生殖细胞分化的过程受到抑制。说明了精氨酸-脯氨酸代谢通路及关键基因NOS2对ESCs向雄性生殖细胞分化过程中起到重要的调节作用。     

猪肌肉干细胞在三维水凝胶中的分化研究

【目的】 探究猪肌肉干细胞在三维水凝胶中的分化效果,为体外诱导肌肉干细胞分化成为肌肉组织提供方法指导。【方法】 将一定数目的猪肌肉干细胞分别在二维和三维条件下诱导分化（二维条件指在培养皿中培养细胞,三维条件指在水凝胶中培养细胞）,分别收取增殖阶段、预分化阶段、分化初期、分化成熟、分化末期的二维培养细胞的RNA和蛋白样品,以及分化7和14 d的三维培养细胞的RNA和蛋白样品。利用RT-qPCR技术检测细胞在两种条件下分化至不同阶段时成肌相关基因MYOG、CAV-3、MyHC-slow、MyHC-2a的表达水平;利用Western Blot技术检测细胞在两种条件下分化至不同阶段时MYOG、MyHC蛋白的表达水平;利用免疫荧光染色技术观察猪肌肉干细胞在二维和三维条件下融合形成的肌管;使用氨基酸自动分析仪检测分化14 d培养肌肉组织的氨基酸含量及组成。【结果】 二维培养的猪肌肉干细胞在分化第3天时开始发生肌融合,在分化第7天形成成熟肌管,随后进入分化末期,肌管开始脱落。三维培养的猪肌肉干细胞在分化第7天时还未完全伸展,细胞的MYOG和CAV-3表达水平低;分化第14天时水凝胶内已形成多核肌管,MYOG和CAV-3表达达到二维分化水平。三维分化有利于终末分化基因MyHC-slow和MyHC-2a的表达,分化14 d时MyHC-slow的表达量是二维分化7 d的12倍,MyHC-2a的表达量是二维分化7 d的4倍,但是MyHC蛋白的表达量仅为二维分化7 d时的1/6。氨基酸分析结果表明体外培养肌肉组织中17种水解氨基酸含量均低于猪肉,且必需氨基酸在总氨基酸的占比也低于猪肉,但是呈味氨基酸的占比相较猪肉更高。【结论】 猪肌肉干细胞可以在三维胶原水凝胶中分化形成肌管,且三维条件有利于成肌分化相关基因表达,但要实现MyHC蛋白的高表达还需进一步研究,按此方法体外培养的肌肉组织有较高的呈味氨基酸含量,可能会有较好的风味。     

猪干扰素α在昆虫细胞中分泌表达及其抗病毒活性检测

 【目的】为获得重组猪干扰素α。【方法】本研究应用Bac-to-Bac杆状病毒/昆虫细胞表达系统,将编码成熟猪干扰素α基因插入供体质粒pFastBacⅠ多克隆位点,置于pH启动子控制下,昆虫可识别的蜂素信号肽（honeybee melittin signal peptide,HBM）取代猪干扰素α原有信号肽以实现分泌型表达,并在C端融合6个组氨酸标签以利于纯化。将构建质粒转化DH10感受态细胞进行同源重组,经抗性和蓝白斑筛选,获得重组穿梭质粒Bacmid,转染对数生长期的Sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒。【结果】重组蛋白通过间接免疫荧光、Western-blot证明重组蛋白在重组杆状病毒感染的昆虫细胞中获得分泌表达。通过在猪肾细胞（PK-15）上抑制水泡性口炎病毒（VSV）致病变作用检测重组蛋白的抗病毒活性,结果表明：昆虫细胞上清的抗病毒效价达到1.07×105 U?ml-1,昆虫细胞裂解液的抗病毒效价为3.15×104 U?ml-1。【结论】应用蜂素信号肽实现猪干扰素α在昆虫细胞上分泌表达,为临床上防治猪病毒性疫病奠定了基础。     

干扰KISS1基因对猪卵巢颗粒细胞功能的影响

【背景】卵泡是卵巢的基本结构和功能单位,其主要功能是排卵和分泌激素。颗粒细胞能促进卵泡发育,其过度凋亡能抑制卵泡发育,诱导卵泡闭锁,进而降低雌性动物发情频率,影响雌性动物繁殖力。现已有研究发现,KISS1在卵巢组织中发挥着重要作用。【目的】研究通过干扰KISS1,以阐释KISS1对猪卵巢颗粒细胞凋亡、周期及分泌雌激素能力的影响,为完善KISS1在猪颗粒细胞中的分子调控机制提供一定的依据。【方法】设计KISS1的干扰片段KISS1-siRNA,转染体外培养的母猪卵巢颗粒细胞,通过实时定量PCR（quantitative real time PCR, qRT-PCR）检测干扰KISS1对母猪卵巢颗粒细胞中磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase, PI3K）信号通路部分基因转录水平的影响;采用流式检测法、Annexin V- FITC及ELISA技术,分别探究干扰KISS1对颗粒细胞周期、凋亡及雌二醇（estradiol, E₂）分泌量的影响,最后使用qRT-PCR技术检测KISS1对雌激素受体及雌激素信号通路关键基因转录水平的影响。【结果】在猪颗粒细胞内,干扰KISS1后,PI3K通路激活相关基因PIK3CG、PI3CI、PDK1及AKT1转录水平下降,其中关键基因AKT1的转录水平显著降低（P<0.05）,PI3K通路激活抑制相关基因FOXO3、TSC2及BAD转录水平也有所降低;干扰KISS1后,颗粒细胞周期在细胞分裂间期（G0/ G1）阻断,细胞的凋亡率显著上升,细胞中E₂的浓度显著降低（P<0.01）,雌激素受体ESR1和ESR2及雌激素通路的基因Star、CYP17、3B-HSD、17B-HSD和CYP19A转录水平也相应显著下降（P<0.05）。【结论】KISS1能够参与猪颗粒细胞PI3K和雌激素通路,干扰KISS1能够使卵巢颗粒细胞阻滞在细胞分裂间期,促进颗粒细胞凋亡,降低颗粒细胞分泌雌激素的能力,表明KISS1对于卵巢颗粒细胞的分裂与生长、雌激素分泌具有重要作用。     

动物胚胎干细胞的研究与应用

胚胎干细胞(Embryonicstemcells,ES细胞)是从早期胚胎内细胞团(innercellmassICM)或原始生殖细胞(Primordialgermcells,PGCs)经体外分化抑制培养分离克隆的。ES细胞在动物克隆、转基因动物生产、细胞工程、组织工程、临床克隆治疗和发育生物学等的研究应用中起着重要的作用。本文介绍了胚胎干细胞的生物学特性,国内外研究进展和研究动态。阐明了建立ES细胞系的技术要点以及ES细胞的应用及发展前景。     

CTNNB1对猪卵巢颗粒细胞的调控

【目的】卵巢颗粒细胞的增殖和分化是原始卵泡生长启动的关键因素,卵巢颗粒细胞过度凋亡是卵泡闭锁的主要原因,因此卵巢颗粒细胞的功能对卵泡生长发育、排卵、激素分泌等至关重要。研究通过探究连环蛋白β1（catenin beta 1, CTNNB1）对猪卵泡发育过程中颗粒细胞的增殖、凋亡及类固醇激素分泌等功能的影响,为猪卵泡发育的分子调控机制研究提供参考。 【方法】利用RNA抽提、实时定量PCR（Quantitative real time PCR, qRT-PCR）等方法,构建CTNNB1在母猪卵巢、肌肉、大脑等9个组织的表达谱;检测母猪性成熟过程中卵巢组织和小（≤3 mm）、中（3—6 mm）、大（≥6 mm）卵泡颗粒细胞中CTNNB1的表达情况。构建CTNNB1的真核表达载体及合成siRNA,转染至猪卵巢颗粒细胞,采用EdU、Annexin V- FITC/PI双染、ELISA等方法,检测CTNNB1对颗粒细胞增殖、凋亡、类固醇激素分泌的影响,以及对类固醇激素合成通路重要基因转录表达的影响。【结果】与肌肉、大脑等组织相比,CTNNB1在卵巢中mRNA表达水平最高。性成熟母猪卵巢中CTNNB1转录水平显著高于性成熟前和性成熟后的母猪;卵巢卵泡中CTNNB1转录和蛋白水平随卵泡发育明显上调;且卵巢颗粒细胞中CTNNB1转录和蛋白水平也随卵泡的发育逐渐上调。更重要的是,CTNNB1显著促进颗粒细胞增殖,抑制颗粒细胞凋亡;CTNNB1能够上调CYP1A1和HSD17B7的转录水平,下调CYP11A1、ESR1、ESR2、FSHR、LHR和NR5A1等类固醇激素合成相关基因的转录水平,进而促进颗粒细胞雌激素的分泌,抑制颗粒细胞雄激素和孕激素的分泌。【结论】本研究证实CTNNB1可能通过促进颗粒细胞增殖及雌激素的合成和分泌,抑制颗粒细胞凋亡及雄激素、孕激素的合成和分泌,进而促进卵泡的生长发育。     

IL-15过表达对猪骨骼肌细胞成肌分化的影响

【目的】研究肌肉因子IL-15（interleukin 15）对猪骨骼肌成肌细胞增殖与凋亡的影响,为进一步研究IL-15在动物肌肉品质调控和骨骼肌疾病治疗提供依据。【方法】构建IL-15过表达慢病毒载体GV-492-IL-15,体外无菌分离培养猪骨骼肌卫星细胞,诱导分化,并通过免疫荧光染色进行成肌细胞验证。将成肌细胞转染IL-15过表达重组慢病毒载体,试验分别设置空白对照组（Control）、转染阴性对照病毒组（IL-15-）和转染GV-492-IL-15（IL-15+）慢病毒试验组（n=3）。培养72 h后,收集细胞和培养上清液。分别采用实时定量PCR（qRT-PCR）和Western Blot技术分析目的基因和蛋白的表达情况,采用ELISA试剂盒分析培养液中IL-15含量,采用CCK-8试剂盒分析成肌细胞活力,采用流式细胞术分析细胞周期和细胞凋亡,采用Western Blot技术检测与细胞凋亡密切相关的caspase-3蛋白表达水平的变化。【结果】（1）经鉴定后的质粒转染293T细胞,细胞内可观察到明显的绿色荧光,经Western Blot检测,可以观察到20 kD附近处有特征条带;（2）分离培养的猪骨骼肌卫星细胞呈梭形或纺锤形,诱导后可分化为呈管状的成肌细胞。将分化后的成肌细胞,进行α-SMA单克隆抗体免疫荧光染色,视野中90%的细胞呈阳性反应,胞浆染成红色,表明细胞为骨骼肌成肌细胞。（3）转染GV-492-IL-15慢病毒后,与对照细胞组相比,成肌细胞内IL-15 mRNA和蛋白相对表达量均极显著升高（P<0.001）,但培养液中IL-15蛋白水平变化不大（P>0.05）。CCK-8结果显示,过表达IL-15可增强细胞的增殖能力（P<0.05）。与对照组相比,转染GV-492-IL-15慢病毒的细胞早期凋亡率差异不显著（P>0.05）,但细胞晚期凋亡率显著下降（P<0.05）。与对照组相比,转染慢病毒组细胞中caspase-3蛋白有下降的趋势,但差异不显著（P>0.05）。此外,转染IL-15过表达慢病毒可使G1期细胞比例显著下降,S期和G2/M期细胞比例显著升高（P<0.05）。【结论】在正常生理条件下,IL-15是定位在细胞内并发挥作用的,IL-15过表达对猪骨骼肌成肌细胞早期凋亡没有显著影响,但可以抑制其晚期凋亡,并促进细胞增殖。这一研究将为IL-15正向调控猪骨骼肌肌肉品质和治疗相关肌肉疾病提供技术和理论依据。