山羊EDNRA基因编码区克隆与组织表达规律分析

【目的】旨在探究EDNRA基因在山羊心脏、肝、脾、肺、肾、大脑、网膜脂肪组织中的表达情况。【方法】采用克隆、测序的方法得到山羊EDNRA基因CDS全长的碱基序列,用生物信息学软件进行序列分析、亲水性/疏水性分析、潜在的信号肽位点分析、亚细胞定位分析、蛋白质的二级结构和三级结构预测及系统进化树分析,最后采用实时荧光定量PCR(qPCR)测定EDNRA基因在山羊心脏、肝、脾、肺、肾、大脑、网膜脂肪组织中mRNA的表达量。【结果】成功克隆了EDNRA的CDS序列,得到山羊EDNRA基因包含一个1 284 bp的最长开放阅读框。该序列编码427个氨基酸,含信号肽序列(第1到第20位氨基酸)以及7型跨膜受体同系物结构域。基因编码产物具有疏水性,属分泌蛋白,有35个磷酸化修饰位点。二级结构主要为α-螺旋。系统进化树分析表明,山羊EDNRA基因和绵羊、牛以及野牛的亲缘关系较近。qPCR结果表明,山羊EDNRA基因在心脏中的表达量最高,在肝、脾、肾、大脑、网膜组织中的表达量较低,而在肺中表达最少。【结论】EDNRA可能在心脏行使功能过程中发挥重要作用。     

绵羊UCP1基因碱基突变与其蛋白结构和功能

【目的】检测两个绵羊群体中解偶联蛋白1（uncoupling protein 1,UCP1）基因的单核苷酸多态性 （single nucleotide polymorphism,SNP）,预测和分析碱基改变对蛋白结构和功能的影响。【方法】利用PCR-SSCP结合测序的方法检测UCP1基因编码区的SNPs,用生物信息学方法分析UCP1蛋白的理化性质和结构。【结果】UCP1基因编码区存在4个SNPs,其中c.214G＞A（Val72Met）和c.273C＞T位于外显子2,c.624C＞T和c.757G＞A（Ala253Thr）位于外显子5。进一步分析导致氨基酸改变的c.214G＞A和c.757 G＞A突变发现,此两个突变只对UCP1蛋白的理化性质和转录因子结合位点有细微改变,未引起UCP1蛋白空间构象的变化,对蛋白表达的影响不大。【结论】基于对人类中两个与肥胖相关的外显子突变型蛋白结构的比较说明,UCP1蛋白结构的改变可能影响其功能。     

牦牛和犏牛Dmrt7基因序列分析及其 在睾丸组织中的表达水平

【目的】研究牦牛和犏牛Dmrt7基因编码区序列和编码蛋白的结构,以及在睾丸组织中mRNA及其蛋白表达水平,探讨Dmrt7与犏牛雄性不育的关系,为揭示犏牛雄性不育的分子机理提供依据。【方法】利用分子克隆技术获得牦牛和犏牛Dmrt7基因编码区序列,并采用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白的功能位点和二级结构等方面进行了预测和分析;通过半定量PCR技术检测Dmrt7基因mRNA在牦牛各组织器官中的表达水平;利用实时荧光定量PCR技术检测牦牛和犏牛睾丸组织中Dmrt7基因mRNA表达水平;并通过western blotting检测牦牛和犏牛睾丸组织中Dmrt7蛋白的表达水平。【结果】牦牛和犏牛Dmrt7基因cDNA序列一致,包含一个长度为1 113 bp的开放阅读框,编码370个氨基酸,具有完整的DM功能域,二级结构主要以无规则卷曲、α螺旋和延伸链为主。在牦牛各组织器官中,Dmrt7基因mRNA仅在睾丸组织中特异性表达。牦牛睾丸组织中Dmrt7mRNA和蛋白的表达水平极显著高于犏牛（P＜0.01）。【结论】牦牛睾丸组织中Dmrt7基因mRNA和蛋白表达水平明显高于犏牛,且Dmrt7蛋白表达水平与其mRNA表达水平相一致。     

杜长大猪UCP3基因克隆及白藜芦醇 对其表达的影响

【目的】明确白藜芦醇对杜长大猪UCP3基因表达及脂肪代谢的影响,为揭示猪优良肉质性状形成机制打下基础。【方法】提取2月龄杜长大猪皮下脂肪组织RNA,采用RT-PCR扩增杜长大猪UCP3基因编码区(CDS)序列,运用在线软件对其进行生物信息学分析,并以实时荧光定量PCR检测白藜芦醇(400 mg/kg,饲喂30 d)对杜长大猪脂肪中UCP3基因表达的影响。【结果】从杜长大猪皮下脂肪组织中成功克隆获得UCP3基因CDS序列,全长927 bp,共编码308个氨基酸,其蛋白分子质量33673.09 Da,理论等电点(pI)9.44;与普通猪的UCP3基因序列相比,杜长大猪UCP3基因编码序列共有9处发生碱基突变,其中4处为错义突变,导致UCP3蛋白有4处氨基酸突变,分别为第74位脯氨酸(Pro)→亮氨酸(Leu)、第150位甘氨酸(Gly)→精氨酸(Arg)、第203位Arg→Gly和第259位缬氨酸(Val)→Leu。杜长大猪UCP3基因CDS序列与普通猪UCP3基因CDS序列的同源性为99.0%,其UCP3蛋白二级结构中以α-螺旋占比最高(46.43%)、β-转角占比最低(7.47%),属于亲水性蛋白。饲喂白藜芦醇(400 mg/kg)能极显著上调杜长大猪皮下脂肪UCP3基因表达(P0.01),其相对表达量是对照组(不饲喂白藜芦醇)的2.06倍。【结论】白藜芦醇是通过上调杜长大猪UCP3基因表达而影响其脂肪代谢。     

绵羊BMPR1B基因的生物信息学分析

【目的】利用生物信息学软件对绵羊BMPR1B基因进行分析,并了解其功能和结构,为进一步探讨BMPR1B基因在绵羊生长繁殖以及绵羊卵泡生长和分泌和产羔率等研究奠定遗传信息基础.【方法】利用生物信息学对绵羊骨形态发生蛋白1β(bone morphogenetic protein 1beta,BMPR1B)基因的蛋白理化性质、亚细胞定位、潜在信号肽剪切位点、蛋白跨膜螺旋结构、糖基化和磷酸化位点、蛋白保守结构域、亲疏水性和编码产物进行功能预测分析,及其编码蛋白的二级结构和三级结构等进行分析预测.【结果】绵羊BMPR1B基因CDs编码蛋白质的502个氨基酸残基中,带电荷氨基酸、疏水氨基酸和极性氨基酸含量较高.相对分子量为56 907.4U,理论等电点pI为7.78;亚细胞主要定位于细胞核,不属于分泌蛋白;无信号肽序列;预测含有32个磷酸化位点和2个糖基化位点;存在一段跨膜结构且分别有一个GS和S-TKc的结构域,二级结构以无规卷曲为主.预测该蛋白在翻译和脂肪代谢过程中有着重要意义.【结论】绵羊BMPR1B蛋白包含502个氨基酸,为细胞核合成蛋白,该蛋白翻译后修饰的主要方式是磷酸化,在细胞内主要行翻译和脂肪代谢作用.蛋白二级结以无规卷曲为主,三级结构主要由α螺旋和无规卷曲缠绕折叠形成.     

绵羊YAP1基因全长cDNA克隆及生物信息学分析

【目的】克隆绵羊YAP1基因cDNA并分析其序列及其蛋白的遗传特性及其在不同组织中不同程度的表达情况。【方法】以湖羊为研究对象,利用RT-PCR和RACE技术获得绵羊YAP1序列,并结合生物信息学方法对绵羊YAP1的序列进行深入分析。【结果】从湖羊背最长肌中克隆YAP1基因的全长cDNA序列;利用生物信息学技术,对绵羊YAP1基因与其它物种的同源性,蛋白质序列的跨膜区,亚细胞定位,亲水性,潜在信号肽剪切位点,糖基化位点,磷酸化位点,编码产物进行功能预测分析,及其编码蛋白的二级结构,三级结构等进行分析。【结论】克隆获得绵羊YAP1基因序列全长为1 712 bp,包括1 212 bp的编码区序列,编码403个氨基酸。同源性分析发现,绵羊YAP1核苷酸序列与推测氨基酸序列与灰仓鼠的同源性最高,分别达到78.77%和92.51%,而与人、黑猩猩的一致性差异较小。氨基酸序列分析发现该基因编码蛋白为水溶性蛋白,相对分子量为44079.0Da,理论等电点为4.91,无信号肽序列和跨膜区;亚细胞定位主要在细胞核,不属于分泌蛋白;预测含有33个磷酸化位点,7个糖基化位点,具有两个WW结构域,二级结构以无规则卷曲为主,三级结构显示,YAP1结构域区构成弯曲状螺旋结构。预测YAP1蛋白主要在调节功能过程中有着关键作用。以上研究为进一步探讨YAP1基因在肌肉生长过程中的功能研究奠定了遗传信息基础。     

色瓦绵羊GPIHBP1基因克隆及其组织表达特征分析

【目的】克隆色瓦绵羊乳腺组织糖基化磷脂酰肌醇锚定高密度脂蛋白结合蛋白1基因(GPIHBP1),明确其生物信息学特性及组织表达分布特征,为揭示GPIHBP1基因影响绵羊产奶性状的作用机制提供参考依据。【方法】克隆色瓦绵羊GPIHBP1基因编码区(CDS)序列,通过Prot Para、Prot Scale、SOPMA、SWISS-MODEL、TMHMM-2.0等在线软件进行生物信息学分析,并以实时荧光定量PCR检测该基因在色瓦绵羊乳腺、肌肉、心脏、肾脏、肝脏、小肠、瘤胃和卵巢等8个组织中的表达情况。【结果】色瓦绵羊GPIHBP1基因CDS序列长519 bp,共编码172个氨基酸残基,与山羊GPIHBP1氨基酸序列(XM＿018058666.1)比对,有4处氨基酸发生突变(³²A→P、⁵²V→A、¹³⁰S→N和¹⁷⁰M→V);色瓦绵羊GPIHBP1蛋白分子量为18063.87 Da,理论等电点(p I)为4.29,不存在跨膜螺旋结构,但存在信号肽(位于第20～21位氨基酸处),是一种细胞外的酸性亲水性蛋白...     

绵羊IRS1基因CDS区克隆、序列分析及其组织表达研究

【目的】克隆绵羊IRS1基因CDS区,并研究其序列特征和组织表达。【方法】选择健康、3岁、处于第4胎的泌乳高峰期(产后第3周)小尾寒羊和空怀期小尾寒羊母羊各3只作为研究对象,利用克隆测序技术获得绵羊IRS1基因的CDS序列,用生物信息学分析其编码的氨基酸序列特征,用RT-qPCR检测IRS1基因在肝脏、心脏、背最长肌、脾脏、肺脏、卵巢、肾脏和乳腺组织中的表达模式。【结果】绵羊IRS1基因的CDS全长为3 708 bp,编码1 235个氨基酸,蛋白分子量为130 462.80,等电点为8.99,不稳定指数为73.55,预测该蛋白为不稳定、碱性亲水性蛋白。蛋白互作分析表明,绵羊IRS1可以与胰岛素样生长因子1受体(IGFR1)、磷酸肌醇-3-激酶调节亚基1(PIK3R1)、丝裂原活化蛋白激酶8(MAPK8)、丝裂原活化蛋白激酶10(MAPK10)和生长因子受体结合蛋白2(GRB2)相互作用,KEGG分析发现IRS1主要参与了PI3K/AKT和MAPK 2个信号通路。RT-qPCR分析表明,IRS1基因在小尾寒羊各组织中均表达,并且表现出明显的组织特异性,它在背最长肌中的表达量最高,其次是肝脏和心脏,在肺脏、肾脏、卵巢和乳腺组织中表达量较低,在脾脏中弱表达。同时,绵羊IRS1基因也表现出明显的时序表达性,在泌乳高峰期小尾寒羊中,IRS1基因在乳腺组织中的表达量是空怀期乳腺组织中表达量的2.77倍(P0.05)。但在除乳腺和脾脏外的其他6个组织中,该基因在空怀期中的表达量均显著高于泌乳高峰期中的表达量(P0.05)。【结论】克隆得到绵羊IRS1基因完整的CDS序列,它全长3 708 bp,编码1 235个氨基酸。IRS1在小尾寒羊各组织中广泛表达,并且表达出明显的组织特异性和时序特异性。     

山羊IGFBP-2基因的克隆、序列分析及其组织表达

【目的】克隆获得南江黄羊IGFBP-2（Insulin-like growth factor binding protein -2）基因的CDS区全序列,对其进行生物信息学分析,并分析IGFBP-2的mRNA和蛋白组织表达特征,为深入研究该基因在出生后山羊生长和发育过程中的作用以及表达调控提供基础资料。【方法】下载NCBI的GenBank数据库中公布的绵羊（Ovis aries,NM_001009436）和牛（Bos taurus,NM_174555）的IGFBP-2基因的mRNA序列,经序列比对后采用保守区域序列并利用Primer Premier 6.0软件设计克隆引物,经PCR扩增后采用TA克隆技术获取含有阳性克隆子的菌液,送公司测序得到山羊IGFBP-2基因的完整编码区序列,并利用EditSeq、DNAMAN 6.0、MEGA 6.0和ExPASy在线平台等软件对CDS区序列和其编码的氨基酸序列进行生物信息学分析;获得山羊IGFBP-2基因CDS区序列后,利用该序列设计实时荧光定量PCR（Q-PCR）引物,采用Q-PCR和蛋白质免疫印迹杂交（Western blotting）方法检测了IGFBP-2的mRNA和蛋白在出生后南江黄羊不同组织（心脏、肝脏、肺、背最长肌、半膜肌和臂三头肌）和不同发育阶段（3、30、60、90和120 d）的表达情况。【结果】①克隆得到954bp的南江黄羊IGFBP-2基因的CDS区全序列,碱基组成为GC含量69.39%,AT含量30.61%,共编码317个氨基酸残基,预测的山羊IGFBP-2蛋白分子量大小为33.8808 kD,等电点为7.82,二级结构由无规卷曲（68.14%）、α-螺旋（18.30%）和延伸链（13.56%）三种形式组成;蛋白结构域分析发现,IGFBP-2蛋白序列包含保守的IB（IGFBP homologues）和TY（Thyroglobulin type Ι repeats）结构域,IB结构域位于第37-125位氨基酸处,TY结构域位于第250-302位氨基酸处;②磷酸化位点预测发现,IGFBP-2蛋白中存在Ser（5）和Thr（7）共12个磷酸化位点;糖基化位点预测发现,IGFBP-2蛋白序列中存在10个N-糖基化位点和2个O-糖基化位点;③CDS区序列相似性比较发现,山羊IGFBP-2与绵羊、牛、猪、人和小鼠的相似性分别达到98.99%、97.73%、87.12%、78.33%和76.26%;氨基酸序列相似性比较发现,山羊IGFBP-2与绵羊、牛、猪、人和小鼠的相似性分别达到99.24%、98.10%、87.07%、70.27%和73.00%;④系统进化树分析发现,山羊IGFBP-2与绵羊和牛的亲缘关系最近;⑤组织表达分析表明,IGFBP-2在肝脏中的mRNA和蛋白的相对表达量均最高(P<0.01),背最长肌次之;在不同发育阶段的肝脏组织中,IGFBP-2 mRNA和蛋白相对表达量均呈现一直上升的趋势;在不同发育阶段的背最长肌组织中,IGFBP-2的mRNA表达水平呈现一种“上升-下降-上升”的波动平衡。【结论】获得了山羊IGFBP-2基因完整的编码区序列和组织表达特征,生物信息学分析发现IGFBP-2基因的编码区序列具有物种间的保守性,肝脏是山羊IGFBP-2 的mRNA和蛋白表达的主要组织,同时在山羊不同发育阶段的肝脏和背最长肌组织中,IGFBP-2基因的mRNA和蛋白表达丰度呈现一定的规律性,表明IGFBP-2基因可能在出生后山羊的早期生长发育过程中发挥着重要的作用。     

绵羊血小板糖蛋白4基因(CD36)的克隆及在不同生长时期卵泡中的表达

【目的】血小板糖蛋白4基因(CD36)在模式动物中发挥着各种生物学功能,通过转录组数据分析,可能在绵羊卵泡发育中发挥重要作用。本研究获得了CD36基因及探究其在不同组织中表达情况,从而预测其在绵羊生长过程中可能发挥的生物学功能。【方法】实验采用PCR扩增方法获得阿勒泰羊TSP-1基因的CDS区全长,运用软件分析CD36基因的蛋白质序列及其功能区域,同时利用荧光定量PCR的方法检测5头1周岁阿勒泰羊7个组织及不同直径卵泡中的表达情况。【结果】CD36基因序列全长为1419 bp,共编码472个氨基酸,与预测序列相比完全一致。系统进化树分析表明绵羊与牛的遗传距离较近。CD36蛋白为脂溶性亲水蛋白,具有1个跨膜螺旋结构,在氨基酸1~20位存在以信号肽,存在8个N-糖基化和41个潜在的磷酸化位点,包括19个Ser,15个Thr和7个Tyr。检测不同组织和不同直径卵泡中CD36基因发现:CD36基因在绵羊7个组织中都有表达,心与肺和小卵泡中CD36表达量差异显著(P0.05),在不同直径卵泡中总体表达量较低。【结论】CD36基因可能在绵羊卵泡发育中发挥重要作用。     

隆林山羊CIDEc基因的克隆及组织表达分析

【目的】明确隆林山羊诱导细胞凋亡DFF45样效应因子c基因（CIDEc）的生物学特性及其表达规律,为揭示CIDEc基因对山羊脂肪代谢的调控机制提供理论依据。【方法】提取隆林山羊背最长肌、心脏、肝脏、脾脏、肾脏、腹脂和皮下脂肪及努比亚山羊腹脂和皮下脂肪的总RNA,PCR扩增隆林山羊CIDEc基因编码区（CDS）序列,使用Ex-PASy、TMHMM Server v.2.0、ProtScale、NPS@SOPMA和SWISS-MODEL等在线软件进行生物信息学分析,并利用实时荧光定量PCR检测CIDEc基因在隆林山羊和努比亚山羊不同组织器官中的表达情况。【结果】隆林山羊CIDEc基因CDS序列全长为741 bp,共编码244个氨基酸残基,其编码蛋白分子量26.09 kD,不稳定系数48.44,脂肪指数100.7,理论等电点（pI）5.28,属于酸性蛋白,不存在跨膜结构,亲水性较强。隆林山羊CIDEc基因CDS序列与NCBI已公布的山羊CIDEc基因（XM_018038446.1）CDS序列相对比仅有1处碱基发生突变,即第560位点G突变为T,属于同义突变。隆林山羊与绵羊的CIDEc基因CDS序列相似性最高（99.0%）,与小鼠的相似性较低（79.6%）;基于CIDEc基因CDS序列相似性构建的系统发育进化树也显示隆林山羊与绵羊的亲缘关系最近,与小鼠的亲缘关系较远。在隆林山羊CIDEc蛋白的二级结构中:α-螺旋占32.38%,β-转角占12.70%,延伸链占13.11%,无规则卷曲占41.80%。CIDEc基因在隆林山羊7个组织器官中均有表达,且在腹脂和皮下脂肪中高表达,极显著高于在其他器官组织的相对表达量（P<0.01）;CIDEc基因在努比亚山羊脂肪组织（皮下脂肪和腹脂）中的相对表达量显著高于在隆林山羊脂肪组织中的相对表达量（P<0.05）。【结论】CIDEc基因在隆林山羊各器官组织中均有表达,以在脂肪组织中的表达水平较高,且其在努比亚山羊脂肪组织（皮下脂肪和腹脂）中的表达水平显著高于在隆林山羊中的表达水平。可见,CIDEc蛋白是脂肪代谢的重要调节剂,与动物体内脂质存储密切相关。     

绵羊RARG基因在发情不同阶段卵巢中的mRNA表达

【目的】分离鉴定绵羊视黄酸受体-γ（Retinoic acid receptor gamma,RARG）基因,分析该基因的分子特征,研究其在发情周期不同阶段卵巢中的表达差异。【方法】选取年龄和体况相近、健康的甘肃高山细毛羊周岁母羊8只,通过同期发情处理,根据卵巢生理状态,将其分为两组：黄体期组和卵泡期组,各4只,屠宰后,采集卵巢组织,以周岁母羊卵巢组织RNA为模板,采用RT-PCR技术扩增绵羊RARG基因并克隆到pMD18-T载体中进行测序验证。利用ORF Finder和DNAStar等生物信息学软件分析绵羊RARG基因的理化性质、同源性和预测结构域和功能。利用Q-PCR技术,检测绵羊RARG基因在母羊发情周期不同阶段卵巢组织中的相对表达量,用SPSS19.0软件进行差异显著性分析,探讨RARG基因对绵羊发情周期的调控机制。【结果】获得了绵羊RARG基因包含完整编码区序列在内的1 588 bp的绵羊RARG基因序列,并提交至NCBI,GenBank登录号为KF019682。该序列含有1个1 377 bp的完整开放阅读框（Open reading frame,ORF）,编码458个氨基酸,其蛋白分子质量为50 955.8 D,理论等电点为7.45。绵羊RARG基因与牛、普通狨、家犬、仓鼠、家猫、人、小鼠、虎鲸、狒、家鼠、野猪、海牛、海豚和蟾蜍等14个物种的同源性分析,结果显示RARG基因在上述物种间高度保守,且与牛的亲缘关系较近,序列同源性最高。GO功能分析结果显示,绵羊RARG基因作为结构蛋白参与转录调控的几率最高,分别为0.272和0.223。在绵羊RARG基因编码的氨基酸序列上发现了2个功能结构域,分别是核激素受体c4锌指结构域（c4 zinc finger in nuclear hormone receptors,ZnF_C4）和 激素受体配体结构域（ligand binding domain of hormone receptors,HOLI）。Q-PCR结果显示,绵羊RARG mRNA 在甘肃高山细毛羊卵泡期卵巢中的相对表达量显著高于黄体期（P<0.05）。【结论】绵羊RARG基因在物种间高度保守,含有ZnF_C4和HOLI等2个与转录调控相关的功能结构域,推测该基因可能作为一种重要的转录因子参与母羊发情周期调控。     

二花脸猪Smad4基因的克隆与卵巢组织mRNA的表达水平

[目的]了解二花脸猪Smad4(common-mediator Sma4)基因的序列特征和组织表达特征,分析二花脸猪与商品猪卵巢组织中Smad4基因mRNA表达水平的差异.[方法]采用克隆测序技术获得二花脸猪Smad4基因cDNA序列,利用生物信息学方法分析二花脸猪Smad4基因的序列特征和蛋白的理化性质、高级结构,RT-PCR检测其组织表达特征,并采用real-time PCR技术检测二花脸猪与商品猪卵巢组织中Smad4基因mRNA的表达水平.[结果]二花脸猪Smad4基因编码区序列全长1 659 bp,编码一个含有5 52个氨基酸残基的蛋白质,氨基酸序列与其它哺乳动物的同源性均在98％以上;二花脸猪Smad4也包括3个典型的结构域(MH1、SAD和MH2).二花脸猪Smad4基因在所检测的组织中均有表达,且卵巢组织中mRNA的表达水平极显著高于商品猪(P＜0.01).[结论]二花脸猪Smad4基因可能拥有其它哺乳动物Smad4基因相同的功能及其可能与猪高繁殖力间有一定相关.     

盐碱胁迫对莫桑比克罗非鱼TauT2基因表达的影响

【目的】研究在莫桑比克罗非鱼（Oreochromis mossambicus）中新发现的编码牛磺酸转运蛋白的基因TauT2在盐碱胁迫下对鱼体渗透压调控的作用,为深入阐明鱼类中牛磺酸转运蛋白的功能提供更全面可靠的数据。【方法】通过PCR和直接测序的方法对TauT2基因的编码区序列（CDS）进行分析,用生物信息学分析方法预测其编码蛋白的氨基酸序列及其高级结构,并利用荧光定量PCR检测该基因在肝、肠、肌肉等13个组织中的表达特征,以及在盐碱胁迫（盐25 g/L,碱4 g/L） 96 h内,不同时间点鳃、肾、肠和肝组织中TTauT2基因mRNA的表达水平。【结果】获得的TauT2基因CDS序列全长1881 bp,共编码626个氨基酸,氨基酸序列与斑马拟丽鱼（Maylandia zebra）牛磺酸转运蛋白的一致性最高,为98.72%,与已报道的莫桑比克罗非鱼的tTAUT1蛋白一致性为88.52%,该蛋白具有典型的牛磺酸转运蛋白跨膜结构域。荧光定量PCR结果表明,TauT2基因在肝、肠、肌肉等13个组织均有表达,其中血液中表达量最高,肠中的表达量最低。盐碱胁迫条件下,TauT2基因mRNA表达水平在鳃、肾、肠和肝组织中的表达均呈先升高再下降的变化趋势,鳃和肝达峰值的时间为48 h,肾和肠达峰值的时间分别是24和72 h,达峰值的时间与莫桑比克罗非鱼的tTauT1基因存在明显差异。【结论】莫桑比克罗非鱼在受到盐碱胁迫后,通过提升TauT2基因的表达量来有效调控体内渗透压,为渗透压稳态的维持发挥作用。莫桑比克罗非鱼体内至少有2种不同的牛磺酸转运蛋白,已发现的这2个蛋白氨基酸序列、三级结构及在鱼体不同组织中精细调节体内渗透压的功能存在一定差异。     

猪TAF7基因的克隆、染色体定位和组织表达谱分析

 【目的】通过对猪TAF7基因初步的研究,为猪分子遗传育种提供基础分子生物学信息,为猪的遗传育种提供分子标记。【方法】以五指山猪为研究对象,克隆TAF7基因,分析该基因结构特点,然后利用IMpRH（the INRA-University of Minnesota porcine radiation hybrid,法国农业科学院-明尼苏达大学的辐射杂种克隆板）分析该基因在猪染色体上定位信息,利用半定量RT-PCR方法,分析该基因在成年五指山猪16个不同组织（心脏、背肌、淋巴、脾脏、肝脏、肾脏、肺脏、子宫、睾丸、胃、小肠、大肠、卵巢、胸腺、脑、脂肪）的表达谱信息。【结果】克隆得到长1 701 bp的五指山猪TAF7基因序列,其中包括1 050 bp完整CDS（Coding Sequence,编码序列）区域,分析表明其编码含349个氨基酸的蛋白质。利用IMpRH分析结果表明,猪TAF7基因与分子标记SW1879和IL4（interleukin-4,白细胞介素-4）紧密连锁,LOD（Limit of Detection,检测极限）值分别为6.69和6.15。组织表达谱分析结果显示该基因在大多数组织中均有表达,其中在睾丸表达量较高,而在心脏、背肌中表达很低。【结论】猪TAF7基因5’UTR中有一个短的内含子,而在该基因CDS区域没有内含子。猪TAF7蛋白序列与人TAF7蛋白序列的相似性较高,二者在生物系统发育树中的距离最接近。猪TAF7基因在大多数组织中均表达,在猪睾丸中表达量较高,证实它调节目的基因转录具有广泛性。     

HOPX基因过表达对鸡前脂肪细胞增殖的影响

【目的】构建鸡HOPX基因（homeodomain only protein X）全长编码区（coding region sequence, CDS）的真核表达载体,转染鸡原代前脂肪细胞,探讨HOPX基因过表达对鸡原代前脂肪细胞增殖的影响。【方法】利用Primer Premier 5.0软件设计鸡HOPX基因CDS区上、下游引物,以AA肉鸡腹部脂肪组织的cDNA为模板,采用PCR扩增、克隆鸡HOPX基因全长CDS区,并将其亚克隆至真核表达载体（pCMV-HA vector）,获得HOPX基因的真核表达载体pCMV-HA-HOPX。采用双酶切鉴定、测序及Western blotting方法分析鉴定pCMV-HA-HOPX。采用胶原酶法分离培养12日龄AA商品肉仔鸡腹部脂肪组织原代前脂肪细胞,瞬时转染pCMV-HA-HOPX,转染6 h时后消化细胞,按照每孔50 000个细胞数接种12孔培养板,并在细胞贴壁0、24、48和72 h,分别采用显微镜观察和CCK-8细胞增殖检测试剂盒分析HOPX基因过表达对鸡原代前脂肪细胞增殖的影响;同时,利用TRIzol法提取组织和细胞总RNA,并反转录合成cDNA,采用Real-time RT-PCR方法分析细胞增殖标志基因Cyclin D1和PCNA的mRNA表达。【结果】测序结果显示,鸡HOPX基因的全长CDS区大小为222 bp,与NCBI发布的鸡HOPX基因mRNA序列（NM_204556）一致;利用HA标签抗体的Western blotting分析显示,真核表达载体pCMV-HA-HOPX能够表达出预期大小的蛋白分子（约9.5kD）,表明鸡HOPX基因的真核表达载体pCMV-HA-HOPX构建成功。显微镜观察发现,转染pCMV-HA-HOPX载体的细胞（HOPX过表达组）在细胞贴壁后培养24和48 h的细胞数量低于转染pCMV-HA vector空载体（空载体对照组）的细胞数量;CCK-8检测分析发现,转染pCMV-HA-HOPX载体细胞的吸光度值（OD值）在细胞贴壁后培养24、48和72 h都极显著低于空载体对照组（P＜0.01）。与细胞增殖检测结果相一致,细胞增殖标志基因表达检测分析发现,在细胞贴壁后培养24 h后,HOPX过表达组细胞Cyclin D1基因的mRNA表达量显著低于空载体对照组（P＜0.05）;在细胞贴壁后培养48 h时,HOPX过表达组的PCNA基因的mRNA表达量显著低于空载体对照组（P＜0.05）;在细胞贴壁后培养72 h时,HOPX过表达组的PCNA和Cyclin D1基因的表达量均极显著低于空载体对照组（P＜0.01）。【结论】HOPX基因过表达在体外抑制鸡原代前脂肪细胞的增殖。     

海南黄牛IGF2R基因单核苷酸多态性及其生物信息学分析

【目的】明确海南黄牛胰岛素样生长因子2受体基因（IGF2R）遗传多态性及其在海南黄牛群体中的遗传分布情况，为进一步揭示IGF2R基因对海南黄牛生长性状的调控机理提供理论依据，也为分子标记辅助选择提供新的候选位点。【方法】构建海南黄牛DNA混池，通过PCR扩增和测序技术对海南黄牛IGF2R基因编码区（CDS）进行基因多态性分析，并以Chromas序列比对筛选出错义突变SNP位点；应用PCR-RFLP对202头海南黄牛个体进行基因型鉴定，同时对筛选到的SNP位点进行连锁不平衡及单倍型分析，评估海南黄牛群体中各单倍型的分布情况；通过生物信息学方法分析各单倍型和SNP位点对海南黄牛IGF2R基因CDS区mRNA二级结构、蛋白理化性质及蛋白二级结构的影响。【结果】在海南黄牛IGF2R基因CDS区共检测到4个错义突变SNPs位点，分别为SNP1（g.63977A>G）、SNP2（g.63999T>C）、SNP3（g.69772G>A）和SNP4（g.94987A>C），其中SNP1、SNP2和SNP3位点间呈强连锁不平衡状态。4个SNPs位点在海南黄牛群体中均表现为中度多态性，且处于Hardy-Weinberg平衡状态（P>0.05）。海南黄牛群体中存在4种单倍型（F>0.01），分别是H1（ATG）、H2（GCA）、H3（ACA）和H4（GCG）；各单倍型及SNP4突变型对海南黄牛IGF2R基因CDS区mRNA二级结构及其最小自由能均有影响。海南黄牛IGF2R蛋白为亲水蛋白，存在跨膜结构和信号肽，其二级结构主要由无规则卷曲和延伸链构成，α-螺旋和β-转角的占比较小。【结论】在海南黄牛IGF2R基因CDS区共检测到4个错义突变SNPs位点，在海南黄牛群体中均表现为中度多态性，且处于Hardy-Weinberg平衡状态。海南黄牛IGF2R基因SNP位点突变对其mRNA二级结构及稳定性均会造成影响，致使IGF2R蛋白二级结构肽链构象发生改变，进而对海南黄牛生长性状的调控造成影响。     

鸭腺苷琥珀酸裂解酶基因序列特征及表达与肌肉肌苷酸含量的相关性分析

【目的】克隆鸭腺苷琥珀酸裂解酶（adenylosuccinate lyase,ADSL）基因的完整编码区（coding sequences,CDS）,对其进行核酸和蛋白序列分析,研究该基因在各品种肌肉组织mRNA表达水平;对该基因mRNA表达水平与肌肉组织肌苷酸（inosine monophosphate acid,IMP）含量进行相关性分析。为揭示中国优良地方鸭种的风味基因结构、研究其生物学功能以及与重要风味物质的关系奠定理论基础。【方法】通过PCR扩增和克隆测序获得鸭ADSL基因部分cDNA序列,运用生物信息学方法分析鸭ADSL基因编码区序列、蛋白结构和进化关系,利用real-time-PCR技术检测鸭肌肉组织中ADSL基因mRNA表达水平,利用高效液相色谱法测定肌肉组织IMP含量。【结果】①鸭ADSL基因CDS全长均为1 380 bp,编码459个氨基酸,与鸡的同源性为94.77%。②ADSL蛋白为偏碱性,有较为强烈的信号肽和细胞内跨膜结构,蛋白二级结构主要由α-螺旋构成。③鸭和鸡首先聚为一类,后与人、鼠等哺乳动物聚为一类,而与两栖、鱼类相聚较远。④ADSL基因表达量品种间差异极显著（P＜0.01）;各品种内雌性表达量极显著高于雄性（P＜0.01）;同一性别内胸肌表达量极显著高于腿肌（P＜0.01）（樱桃谷鸭除外,为P＞0.05）。⑤IMP含量在品种间差异极显著（P＜0.01）;各品种内雌性含量显著高于雄性（P＜0.05）;同一性别内胸肌含量显著高于腿肌（P＜0.05）。【结论】鸭ADSL基因CDS序列与鸡的同源性极高,在肌肉组织中该基因的表达量及对应IMP含量表现为不同品种、同一品种不同性别、同一性别不同部位间极显著或显著差异,两者并显现出显著正相关。