猪嵴病毒非结构蛋白2C的生物信息学分析

本研究运用RT-PCR方法从猪嵴病毒感染阳性样品中扩增出其非结构蛋白2C全基因,并将其克隆到T载体后进行序列测定。研究结果表明,猪嵴病毒非结构蛋白2C全长为1005 bp,编码335个氨基酸。所编的非结构蛋白2C大小为36.9297 ku,理论等电点为7.18;不稳定系数为39.41,属于稳定蛋白质类;脂肪族氨基酸指数为87.10,平均亲水性为-0.242。与其核苷酸同源性最高的是CH/HZ/2011株(GenBank登录号:JX827598),同源性为91.6%;同源性最低的是XX株(GenBank登录号:KC204684),同源性为88.8%。遗传进化分析结果显示,猪嵴病毒非结构蛋白2C在遗传进化树呈3个明显的结构分支,猪源嵴病毒匈牙利株和泰国株处于第Ⅲ遗传进化分支,猪嵴病毒中国分离株分处于第Ⅰ和第Ⅱ遗传进化分支,呈一定的区域流行性。     

一株鹅星状病毒变异毒株的基因组特征与致病性分析

旨在研究引起雏鹅痛风的新型鹅星状病毒流行株特征。本试验从安徽省鹅星状病毒阳性雏鹅组织中进行病毒分离,并对分离的毒株进行全基因组测序,随后进行遗传进化分析。结果表明,病毒液接种9~11日龄鹅胚可成功分离到病毒,将其命名为GASTV-ZM株。IFA （indirect immunofluorescence assay）鉴定为阳性。基因组序列分析表明,ZM株鹅星状病毒基因组全长7 175 nt,ORF2基因核苷酸和氨基酸与2014—2020年间分离毒株的同源性分别为96.7%~98.9%和96.9%~99.0%,ORF2基因编码的氨基酸序列结果显示,3个氨基酸突变位点与以往存在显著差异,ZM株与2016年以来在我国流行的新型鹅星状病毒处于同一进化分支,与2020分离株HNSQ-6株和XT1株同源性较高。本研究为进一步研究该病毒的致病性和致病机理奠定基础。     

H9亚型禽流感病毒山西株的分离鉴定及其HA基因的遗传进化分析

从山西省某些鸡场采集疑似病料,接种SPF鸡胚后分离病毒,采用A型流感病毒通用引物进行HA基因的扩增,并连接T载体克隆后进行序列测序和遗传进化分析。结果显示:获得4株H9亚型禽流感病毒完整HA序列,开放阅读框1 683nt,编码560个氨基酸,各自之间核苷酸同源性较高,达95.5%~99.6%,且推导的氨基酸同源性介于92.0%~99.6%之间;遗传进化分析结果显示该4株属4.2.5分支,与国内常用疫苗株4.2.3分支存在一定差异,但仍属于4.2大分支;HA蛋白的裂解位点氨基酸顺序为RSSR↓GLF,为低致病性禽流感病毒,并且含有7个潜在的N-糖基化位点以及8个受体结合位点。结果表明:本试验分离的H9亚型禽流感病毒与近年来流行毒株HA基因同源性及蛋白关键位点相似性较高。     

牛病毒性腹泻病毒新疆分离株E2基因的克隆及序列分析

应用RT-PCR方法从牛病毒性腹泻病毒（BVDV）新疆石河子分离株、玛纳斯不同年份两个分离株扩增获得的3株BVDV的E2基因序列,分别命名Shihezi148、Manasi和MNS2（GenBank登录号：EU159699、EU159703和EU169937）。序列分析结果表明3株E2基因长度分别为1121bp、1122bp和1122bp,分别编码373、374和374个氨基酸残基。核酸序列同源性和系统发生分析表明,3株病毒均属于BVDV基因1型（BVDV-1）,Shihezi 148株与澳大利亚Bega株亲缘关系最近,同处于BVDV-1c基因亚型群,其E2氨基酸同源性为90.11%。Manasi株和MNS2株E2基因核酸序列仅有4个碱基的差别,它们与Changchun 184和匈牙利VEDEVAC株亲缘关系最近,位于BVDV-1b基因亚型群。Manasi和MNS2株与Changchun 184株E2氨基酸同源性分别高达98.66%和98.93%。     

一株Class Ⅰ新城疫病毒中国分离株分子特性的研究

摘要：对从健康家鸭中分离到的一株Class Ⅰ新城疫病毒分离株Duck／China／08—004／2008进行了遗传进化特性研究。利用RT-PCR扩增了该分离株F基因的主要功能区片段。并进行了克隆与序列分析。序列测定结果已经登录到GenBank,登录号为EU589149。该分离株F蛋白裂解位点的组成为112E—Q—Q—E—R—L117,具有典型新城疫弱毒株的分子特征。同源性分析表明其与国内普遍使用的弱毒疫苗株LaSota和V4核苷酸的同源性较低（分别为55．4％和57．7％）。通过构建F基因的遗传进化树,结果表明该分离株在分类地位上属于Class Ⅰ,与我国目前普遍使用的弱毒疫苗株LaSota（Class Ⅱ中的基因Ⅱ型）和V4（ClassⅡ中的基因Ⅰ型）处在不同的进化分支。通过构建57株ClassⅠ新城疫病毒的遗传进化树．表明本分离株与近年来香港活禽市场分离株较为类似．同属于基因3型。     

牛支原体新疆分离株P48基因克隆及分子特征分析

本研究旨在分析牛支原体P48基因的序列特性、蛋白的结构和功能。根据GenBank中PG45菌株P48基因序列（GenBank登录号：CP002188.1）设计特异性引物,运用Overlap-PCR扩增获得P48基因全长,其目的片段连接到pMD19-T载体上并进行测序,利用生物信息学方法分析和预测其核苷酸序列及其编码蛋白的理化性质、结构功能（信号肽、跨膜结构、磷酸化位点、糖基化位点、二级结构和三级结构）。结果显示,分离株P48基因序列为1 407 bp,与Mb PG45国际标准株的同源性为100%,聚类于一支;P48基因编码467个氨基酸残基,组成一个无跨膜、稳定的亲水性蛋白;P48蛋白存在信号肽,有44个潜在的磷酸化位点和1个糖基化位点,其二级结构是混合型,其中α-螺旋所占比例最高（41.76%）,无规则卷曲次之（37.69%）。功能预测显示,在信号转导、胁迫应答、受体等方面该蛋白存在较高概率。本研究成功克隆了分离株P48基因片段,其编码的蛋白是一个稳定可溶、亲水性蛋白,为分析分离株P48基因的特性和功能提供了一定的理论基础和科学依据。     

猪伪狂犬病病毒GZYY2015变异株的分离鉴定

本试验旨在从贵州省贵阳市云岩区某养猪场送检的经检测为猪伪狂犬病（PR）的样品中分离猪伪狂犬病病毒（PRV）。用细胞接毒试验、理化试验和透射电镜观察等方法分离、鉴定病原,测定病原的毒价后进行动物试验和gD、gE基因序列比对分析。结果显示,细胞接毒试验成功分离能致Vero细胞产生典型病变的PRV。理化试验表明,该分离毒株对5-碘脱氧尿核苷（idoxuridine,IUDR）和有机溶剂氯仿敏感,不耐酸和热。在透射电镜下可见近圆形、有囊膜、150~160 nm大小的成熟病毒粒子,在胞核中可见衣壳呈晶格状排列的病毒包涵体,有实心和空心2种形态;动物试验表明,该毒株对兔具有较强的致病性,可导致接种部位奇痒;核酸鉴定结果表明,扩增获得的PRV gD基因开放阅读框（ORF）为1 209 bp,gE基因ORF为1 740 bp。GenBank比对结果显示,gD基因与PRV JS 2012株（登录号：KP257591）、PRV HNB株（登录号：KM189914.3）核苷酸序列相似性均为99.8%,与疫苗株Bartha-K61（登录号：JF797217.1）相似性为98.7%;gE基因与PRV JS2012株（登录号：KP257591）、PRV HNB株（登录号：KM189914.3）和PRV Qihe547（登录号：KU056477）核苷酸序列相似性均为99.9%。基于gD、gE基因推导的氨基酸序列的遗传进化分析发现,gD、gE基因与国内变异株均位于同一进化分支,对gE基因的遗传变异性分析结果表明,该分离毒株符合PRV变异株的变异模式。本试验结果表明,成功分离PRV变异株,可为贵州省PRV的流行病学遗传进化分析及免疫防控等提供参考。     

3株H3N2亚型禽流感病毒的基因组特征与演化分析

旨在了解浙江地区家禽H3N2亚型禽流感病毒（AIV）的流行变异情况,采用RT-PCR技术对2021年浙江923份样品进行检测,对AIV分离株进行分子特征及遗传演化分析。结果表明,AIV样品阳性率为7.69%（71/923）;共分离到2株鸡源和1株鸭源H3N2亚型AIVs,其HA和NA基因相似性分别为93.4%～100%和94.0%～99.9%,分离株内部基因片段来源复杂,与H1N2、H1N4、H10N7等亚型亲缘关系密切;遗传进化分析显示,H3N2亚型AIV主要流行于华东地区,鸭是其主要宿主,3株H3N2亚型分离株 HA和NA基因均属于禽源进化分支;分离株HA蛋白裂解位点均为PEKQTR↓GLF,符合低致病性禽流感病毒特征,HA蛋白与受体结合相关位点为226Q和228G,PB2蛋白与哺乳动物适应性相关的氨基酸位点为627E,均不同于人流感病毒对应蛋白的相关位点（226L、228S和627K）,推测其跨种传播至人的潜力较低;分离株PB1蛋白的66位氨基酸突变为S,提示其对哺乳动物的致病性可能增强。综上所述,本研究分离的H3N2亚型AIV符合低致病性禽流感病毒特征,基因片段来源复杂,跨种传播至人的潜力较低,但是否影响对宿主的致病性仍需进一步探究。     

2株云南H9N2亚型禽流感病毒HA和NA基因序列分析

在2019年1月-2019年6月对云南出现呼吸道疫病的57个鸡场进行H9亚型禽流感检测的基础上,选取石林和楚雄2个H9亚型禽流感阳性样品进行病毒分离。从分离的H9N2亚型禽流感病毒感染鸡胚尿囊液中提取总RNA,采用特异性引物经反转录PCR分别扩增HA和NA基因,PCR产物纯化后进行测序。序列比对及系统发育分析结果表明,云南2株H9N2毒株HA基因核苷酸序列同源性为94.2%,NA基因核苷酸序列同源性为93.6%,系统进化分析表明云南H9N2亚型禽流感病毒HA和NA基因均属于欧亚谱系中的类ADKHKY28097分支（Y280-like）,ACKYN12019和ACKYN72019 HA基因之间的同源性为94.3%,与参考毒株ACKJX2448的同源性最高,为95.6%~98.5%,与中国流行的H9N2代表株和疫苗株同源性较低。HA蛋白333-340位裂解位点为PSRSSR↓GLF,具有低致病性禽流感病毒分子特征,受体结合位点均发生E198T和Q234L的突变,具有人样受体结合特征,在29、141、298、305、313、492位氨基酸有6个糖基化位点。ACKYN12019和ACKYN72019 NA基因同源性为93.6%,与Y280-like代表毒株的同源性分别为97.1%~97.5%和93.7%~94.6%,NA蛋白缺失63、64、65位氨基酸,在44、69、86、146、200、234位氨基酸处存在6个潜在的糖基化位点,NA蛋白红细胞结合（HB）位点分析发现,368-369、399-403、432位氨基酸处存在变异。研究结果显示,H9N2亚型禽流感病毒一直处于不断的变异之中,故应加强其监测与防控。     

猪流感病毒广东株分离鉴定及遗传进化分析

本研究从广东省某猪场采集37份疑似猪流感症状的猪鼻拭子样品,接种于9日龄SPF鸡胚并收集尿囊液,通过血凝试验、血凝抑制试验和RT-PCR鉴定,分离得到一株猪流感病毒,经RT-PCR分别扩增8个基因片段,进行基因测序及序列分析,与GenBank收录的参考毒株比对并构建进化树。结果显示,分离毒株为H1N1亚型猪流感病毒,将其命名为A/swine/Guangdong/2/2018（H1N1）。遗传进化分析显示,分离株8个片段的核酸序列与A/swine/Guangdong/L3/2009（H1N1）对应序列的同源性均达99%以上,与经典型H1N1亚型猪流感病毒处于同一分支。分离毒株HA的裂解位点为PSIQSR↓GL,符合低致病性流感病毒分子特征。HA基因受体位点为190D、225G和226Q,表明本毒株既可以结合SAα-2,6-Gal型人类流感病毒SA受体,也有结合SAα-2,3-Gal型禽类流感病毒SA受体的可能,在28、40、104、304、498、557位氨基酸处有6个潜在糖基化位点;NA蛋白在50、58、63、68、98、146、235位氨基酸处有6个潜在糖基化位点,NA蛋白氨基酸序列活性中心位点为119E、199D、223I、275H、293R、295N,氨基酸分析位点未出现突变,表明本分离株对神经氨酸酶抑制剂类药物的敏感性较高,但在M2蛋白中,31位氨基酸由敏感型的（S）突变为抗药的（N）,提示可能对金刚烷胺类药物产生耐药性。开展猪流感病毒分离鉴定与遗传进化分析将为广东地区的猪流感流行和变异情况提供重要信息。     

猪乙型脑炎病毒E基因的克隆与序列分析

根据GenBank中猪乙型脑炎病毒SA14-14-2基因序列设计2对引物,从分离的猪源乙型脑炎病毒SD-001株的细胞培养物中扩增出包括E基因全长的两段基因,将扩增的目的片段进行克隆与序列分析。结果表明,所克隆的E基因编码结构域（Domain）区段与SA14-14-2、P3、Beijing-1等毒株的核苷酸与氨基酸序列同源性分别达97.2%与96.8%以上,属于Ⅲ型乙型脑炎病毒,与疫苗株SA14-14-2的Domain区相比,共有8个氨基酸位点变异。     

两株猪圆环病毒2型ORF2基因的克隆和序列分析

根据GenBank中猪圆环病毒2型(PCV-2)ORF2基因序列,设计一对引物,从分离的PCV-2 GZ株、HN株的细胞培养物中扩增出ORF2基因(702 bp).将此基因片段克隆入pMD18-T载体,筛选获得重组质粒pMD-ORF2,并对其测序.结果表明,所克隆的ORF2基因与其他PCV-2的ORF2基因核苷酸序列同源性在90.6%～99.6%之间,推导的氨基酸序列同源性在88.9%～98.7%之间.     

致鹅卵黄性腹膜炎E.coli fimFGH基因序列分析

为研究致鹅卵黄性腹膜炎大肠杆菌(E.coli) fimFGH基因的变异情况,本实验根据GenBank中登录的序列设计引物,PCR扩增了3株致鹩卵黄性腹膜炎性E.coli E0238、E0239、E0240 Ⅰ型菌毛的fimFGH基因并测序.序列比对分析结果表明,3株细菌的fimF、fimG和fimH基因及其所编码的蛋白...     

不同动物源性大肠杆菌多重耐药调控基因rob的同源性分析

为研究大肠杆菌多重耐药调控基因rob与不同动物源性及多重耐药水平之间的关系，选取临床分离的不同动物源性大肠杆菌5株及大肠杆菌药敏质控株ATCC25922，在对其进行主要治疗药物耐药性检测的基础上，分别以其染色体DNA为模板，通过PCR反应扩增出大肠杆菌多重耐药调控基因rob，将该基因分别与克隆载体pMD18-T连接，连接产物转化至大肠杆菌JM109感受态细胞中，对经酶切与PCR反应鉴定为阳性的克隆质粒进行了核苷酸序列测定。测序结果表明：不同动物源性大肠杆菌的rob基因与Gen-Bank中该基因的核苷酸序列及所推导的氨基酸序列的同源性较高。不同源性大肠杆菌的rob基因的核苷酸序列与其动物源性有关，该基因的核苷酸序列的个别突变位点可能影响AcrAB外输泵的表达水平，进而影响其多重耐药水平。     

非典型性型猪瘟病毒云南株的分离鉴定及其E0／E2基因序列分析

从云南10个地州13个大型猪场采集到的17份样品中分离得到5株猪瘟病毒。经测序鉴定昆明、玉溪、曲靖地区分离株的核苷酸序列99．99％同源,大理和宝山地区的核苷酸序列99．99％同源,5株分离毒均属于基因二群。5株分离毒在PK-15细胞上的平均毒价约为2×10^6TCID50／mL,应用荧光抗体染色可以检测到CSFV。通过RT-PCR扩增猪瘟病毒约1200bp和700bp的E2和E0蛋白全部抗原编码区序列,并将其分别克隆到pMD18-T载体中。序列分析结果表明,5株分离株的E0和E2基因片段为697bp和1173bp,与猪瘟病毒Shimen株的核苷酸同源性仅为95．4％和96．6％、82．5g和84．3％,与C-株的核苷酸同源性分别为94．1％和95．2％、83．3％和85．4％。动物试验结果表明,分离的2株猪瘟野毒不能引起典型的猪瘟症状,但是能持续带毒。     

2007-2009年华南地区鸭肝炎病毒流行病学调查及分离株的VP1基因变异分析

为了分析华南地区鸭肝炎病毒（Duckhepatitisvirus,DHV）的遗传进化情况,本试验对2007～2009年华南地区各鸭场发病雏鸭进行DHV的病原学检测以及VP1基因扩增、克隆和测序,并运用生物信息学软件对VP1基因进行了序列分析。结果表明：所分离的R、SS1、ZJ株为DHV-A、VP1与DHV-A参考毒株核苷酸序列相似性分别为93．8％～100％、93．7％-99．6％、91．7％-98．9％,氨基酸序列相似性分别为94．5％～100．0％、94．1％-99．2％、95．0％-99．2％。其余15株DHV-C分离病毒株与台湾新型DHV核苷酸和氨基酸序列相似性均在71．4％～72．0％和78．2％-79．0％之间,与韩国新型DHV相似性在94．0％-95．1％和91．6％-93．3％之间,与国内分离的新型DHV相似性均在97．9％～100．0％和97．5％～100．0％之间。VPl氨基酸序列比对分析表明：VP1的高变区主要分布在46-64、95-149、180-223位,尤其是C’末端,存在点突变或连续变异。在第145-146位,15株新型DHV毒株此3株I型DHV多2个氨基酸（G和G）。小RNA病毒科的VPl蛋白中保守的RGD基序,在DHV中分别显示为SGD和QSD。结果表明,危害华南地区鸭场的DHV已经发生变异,且存在两种基因型毒株的流行。     

1株罗曼粉鸡源申氏不动杆菌的分离鉴定及耐药性分析

为了解贵州省某养殖场罗曼粉鸡发病病原的特征及其耐药性,本试验从病死鸡中分离出一株革兰氏阴性菌,命名为GZ2019,并对其进行纯化培养、生化试验、16S rRNA序列分析、药敏试验及动物回归试验。分离菌在普通琼脂培养基上呈圆形凸起、表面光滑、半透明的灰白色小菌落,鲜血营养琼脂培养基上菌落形态与普通琼脂培养基上的一致,但不溶血;革兰氏染色结果镜检显示,分离菌为成双排列的阴性球杆菌,偶见单个存在或链状排列;生化试验结果显示,分离菌枸橼酸盐利用、过氧化氢酶反应为阳性,硝酸还原、氧化酶、葡萄糖发酵等反应为阴性,无运动性;16S rRNA序列分析结果显示,分离株与不动杆菌的核苷酸同源性在72.6%~99.9%之间,与申氏不动杆菌LUH 4760株（GenBank登录号：AJ275041）、SNSK 752株（GenBank登录号：MG584984）、MCDA01株（GenBank登录号：KY385627）及RP1株（GenBank登录号：MG461636）的核苷酸同源性高达99.9%;药敏试验结果显示,分离菌对头孢曲松和痢特灵敏感,对头孢哌酮、头孢呋辛、头孢他啶等5种药物中度敏感,对新霉素、环丙沙星、羧苄西林等17种药物耐药;动物回归试验结果显示,试验组小鼠隔离饲养1周仅死亡1只,死亡率为20%,表明该分离菌致病性较弱。本试验成功分离出1株低致病性申氏不动杆菌GZ2019,可为鸡源申氏不动杆菌病的预防和治疗提供一定的参考依据。     

猪圆环病毒2型GD株ORF2基因的序列分析

根据GenBank中猪圆环病毒2型（PCV2）0RF2基因序列，设计一对引物，应用PCR从本室鉴定分离的PCV2 GD株的细胞培养物中扩增出ORF2基因（702bp）。将此基因片段克隆入pMD18-T载体，筛选获得重组质粒pMD—ORF2并对其测序，结果表明所克隆的ORF2基因与其他PCV2的0RF2基因核苷酸序列同源性在92．1％～99．9％之间，推导的氨基酸序列同源性在90．2％～99．5％之间。     

野鸭源新城疫病毒的分离及其F基因的克隆与序列分析

用RT-PCR方法扩增从野鸭体内分离到的3株新城疫病毒(newcastle disease virus,NDV)(JS-1/06/wd、JS-2/06/wd和JS-3/06/wd)F基因,并对其序列进行了测定和分析。结果表明该分离株的F基因长1 662 bp,编码553个氨基酸;F基因裂解位点的氨基酸序列为112R-R-Q-K/R-R-F117,符合NDV强毒株的特征。这些毒株间核苷酸同源性为99.8%~99.9%,与鹅源NDV QY971株和ZJ1株的核苷酸同源性也高达96.7%~97.5%;氨基酸同源性为96.8%~97.5%;而与我国标准强毒株F48E9及疫苗株LaSota的核苷酸同源性分别为86.9%和84.5%;氨基酸同源性分别为94.5%和87.0%。系统发育树分析结果表明,野鸭源NDV与鹅源NDV的遗传关系较近,同属于基因Ⅶ型。