2007～2009年华南地区鸭肝炎病毒流行病学调查及分离株的VP1基因变异分析

为了分析华南地区鸭肝炎病毒(Duck hepatitis virus,DHV)的遗传进化情况,本试验对2007～2009年华南地区各鸭场发病雏鸭进行DHV的病原学检测以及VP1基因扩增、克隆和测序,并运用生物信息学软件对VP1基因进行了序列分析。结果表明:所分离的R、SS1、ZJ株为DHV-A、VP1 DHV-A参考毒株核苷酸序列相似性分别为93.8%～100%、93.7%～99.6%、91.7%～98.9%,氨基酸序列相似性分别为94.5%～100.0%、94.1%～99.2%、95.0%～99.2%。其余15株DHV-C分离病毒株与台湾新型DHV核苷酸和氨基酸序列相似性均在71.4%～72.0%和78.2%～79.0%之间,与韩国新型DHV相似性在94.0%～95.1%和91.6%～93.3%之间,与国内分离的新型DHV相似性均在97.9%～100.0%和97.5%～100.0%之间。VP1氨基酸序列比对分析表明:VP1的高变区主要分布在46～64、95～149、180～223位,尤其是C′末端,存在点突变或连续变异。在第145～146位,15株新型DHV毒株比3株Ⅰ型DHV多2个氨基酸(G和G)。小RNA病毒科的VP1蛋白中保守的RGD基序,在DHV中分别显示为SGD和QSD。结果表明,危害华南地区鸭场的DHV已经发生变异,且存在两种基因型毒株的流行。     

新型鸭肝炎病毒分离株JFX08全基因组测定与分析

对我国鸭病毒性肝炎病毒(Duck hepatitis virus,DHV)分离株JFX08的全基因组进行了序列测定与分析。结果表明,JFX08毒株的基因组全长为7793nt,包括652nt的5’UTR,6753nt的ORF,366nt的3’UTR以及19nt的poly(A)尾巴。JFX08毒株的ORF编码2251个氨基酸,各基因均与韩国新型毒株的氨基酸序列相似性最高,与1型DHV和台湾新型DHV的序列相似性均较低。其中VP1较1型DHV存在2个氨基酸的插入和较多氨基酸位点的突变,高变区主要集中在180～194位和213～219位。JFX08毒株的非编码区核苷酸序列之间存在大量碱基突变和插入/缺失。多聚蛋白、VP0、VP3、VP1、2C和3D基因进化分析结果均表明,JFX08分离株与韩国新型DHV的遗传距离最近,属基因C型。     

禽脑脊髓炎病毒VR株衣壳蛋白基因的克隆及序列分析

用冻存的禽脑脊髓炎病毒Van Roekel(AEV VR)株通过SPF鸡胚传代复壮，获得了试验用病毒株样本。根据已知禽脑脊髓炎病毒1143(AEV 1143)株的衣壳蛋白VP0、VP3、VPl基因序列，设计了3对引物，分别扩增AEV VR株的VP0、VP3、VP1基因，将RT-PCR产物进行分子克隆和序列分析。结果表明，AEVVR株与AEV1143株VP0、VP3、VP1基因的核苷酸同源性分别为95．1％、93．6％和93．9％；氨基酸的同源性分别为97．57／6、97．5％和99．6％。     

鸭肝炎病毒浙江分离株全基因组测序及其VP1基因的序列分析

利用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术及RACE方法扩增得到鸭肝炎病毒(DHV)浙江分离株Z10的全基因(5',3'末端序列用RACE法扩增)及4株DHV分离株的VP1基因.结果表明,分离株Z10的全基因片段长7689 bp,有1个大的开放读码框(ORF),ORF位于626～7326位核苷酸,编码2249个氨基酸.Z10分离株全基因序列与GenBank登录的6株具有代表性的DHV核苷酸序列比对,同源性94.5%～98.4%;所测得的DHV分离株的VP1基因的序列与目前GenBank上发表的具有代表性的DHv-Ⅰ VP1基因进行比对分析,结果4株Ⅰ型DHV的VP1基因cDNA长度均为714 bp,编码238个氨基酸.4株DHV-Ⅰ之间VP1基因的核苷酸序列同源性为93%～99.7%,氨基酸序列同源性为95.0%～100%;与参考毒株VP1基因的核苷酸序列同源性为92.2%～100%,氨基酸序列同源性为95.0%～100%;表明各分离毒株的亲缘关系较近,属于同一基因群.     

Ⅰ型鸭肝炎病毒R株VP1基因克隆与序列分析

本研究克隆了DHVI-R株VP1基因,分析其与目前GenBank上发表的DHVI VP1基因的遗传变异,发现DHV I-R株与GenBank上发表的其他中国毒株VP1基因的核苷酸序列相似性92.2%～100%,而氨基酸序列相似性为95.0%～100%,变异程度不大.但各毒株的亲缘关系相差较大.     

新型鸭肝炎病毒GD1株VP1结构蛋白的基因分析及B细胞抗原表位预测

对新型鸭肝炎病毒(DHV)GD1株VP1结构蛋白基因进行了扩增、克隆及序列测定。采用DNAStar Protean软件对VP1蛋白的二级结构、可塑性、亲水性、表面可能性及抗原指数等参数进行分析,综合预测其B细胞表位分布。结果表明,VP1基因长720 bp,编码240个氨基酸。与国内和韩国分离的新型毒株的氨基酸序列相似性最高,分别为99.6%,92.9%和92.5%。与台湾新型DHV的序列相似性均较低,分别为80.6%,80.2%,与传统的Ⅰ型DHV毒株的序列相似性最低,相似度仅为25.5%。较1型DHV存在多个氨基酸的插入和较多氨基酸位点的突变,高变区主要集中在180～220位。VP1结构蛋白的二级结构较为复杂,含有较多的β片层结构和转角结构,有多个区域为B细胞优势表位。该方法预测的B细胞表位结果有较高的准确度,为试验确定新型DHV毒株的VP1结构蛋白的B细胞表位和新的多表位疫苗设计提供了理论基础。     

一株广西新型鸭肝炎病毒的分离与初步鉴定

从广西南宁疑似鸭病毒性肝炎（DVH）的发病鸭群中分离到1株鸭肝炎病毒（DHV）,命名为GX—NN201201株,其鸭胚半数致死量（ELD50）为10-4.5／0．2mL。对分离毒株GXNN201201进行了DHVRT—PCR诊断、部分片段基因的克隆、序列测定与动物回归试验,结果表明：分离病毒的核酸能被韩国新型DHV特异性引物扩增,而不能被DHV-1的特异性引物扩增。GXNN201201分离株与韩国新型DHV及其他类韩国新型DHV之间的核苷酸序列同源性高达94．0％～98．9％,而与DHV-1疫苗毒株及台湾新型DHV之间的同源性则较低。遗传进化关系分析结果进一步表明该分离株与韩国新型DHV分布在同一分支上,并且与国内类韩国新型DHVGD株的遗传关系最近,属于基因C型DHV。人工感染的病死鸭可见典型的DVH临床特征,与临床发病表现相似。因此,初步确定GX—NN201201为广西新型DHV。     

番鸭源鸭肝炎病毒CH12株的分离与全基因组序列分析

从浙江省某疑似鸭病毒性肝炎的发病番鸭群分离到1株鸭肝炎病毒（Duck hepatitis virus,DHV）CH12株,分离毒株经动物回归试验、ELD50测定、中和试验等确定为DHV-1（基因A型DHV）。通过RT-PCR方法对DHV CH12株的全基因组序列进行分段扩增并测序。结果表明,CH12株的全基因组长度为7690 bp（不包括PolyA）,包括626 bp的5′UTR,6747 bp的ORF和317 bp的3′UTR。CH12株各基因均与基因A型DHV毒株的序列相似性较高,与基因B型和基因C型DHV毒株的序列相似性较低。全基因组核苷酸、多聚蛋白、VP0、VP3、VP1、2C和3D基因的进化分析均显示,CH12株均与基因A型DHV在同一进化分支上,亲缘关系较近,属于基因A型DHV。     

鸭肝炎病毒Js株VP1基因克隆及序列分析

摘要：通过PCR技术，从自行分离的鸭肝炎病毒Js株基因组中扩增出病毒衣壳蛋白VP1完整基因片段，并对该片段进行序列测定及分析。结果显示Js—VP1与DHV—A的VP1基因序列酸核苷酸同源性在92．7％～99．7％之间，与DHV—B的VP1基因序列酸核苷酸同源性在58．5％～58．7％之间，与DHV—C的VP1基因序列酸核苷酸同源性在61．6％-63．9％之间，分析表明Js株为鸭肝炎病毒基因A型，血清型分型为血清1型。进化树表明Js株与E53、X、R、AV2111株的亲缘关系较进。     

鸭肝炎病毒地方株VP1基因的序列测定及分析

从湖北某发病鸭场分离到一株鸭肝炎病毒DHV/HB98,通过RT-PCR方法扩增该毒株的VPI基因的核苷酸序列.系统发育分析表明,DHV/HB98株的基因组序列与已发表的DHV-1 E53和ZJ的结构基因VP1亲缘关系最近,核苷酸的同源性为98.6％和98.3％,氨基酸序列的同源性为98.3％和98.7％,分析DHV/HB98与发表的变异株90D和04G核苷酸同源性为65.4％和66.7％,氨基酸同源性为69.5％和74.8％.推断该毒株属于DHV-1,与变异株是不同的血清型;DHV/HB98与DHV-1 ZJ具有相近的遗传关系,推断DHV/HB98也为强毒株.     

鸭肝炎病毒的分离与鉴定

1999-2008年从山东、河南、浙江、江苏、广西、山西、江西、广东、福建和辽宁等地有典型鸭病毒性肝炎症状的病死雏鸭中共分离得到22株病毒。用鸭肝炎病毒（DHV）Ⅰ型（DHV-1）抗血清和新型DHV （N-DHV）抗血清对分离的22株病毒进行血清中和试验;对22株病毒的抗原相关VP1基因进行RT-PCR扩增和测序,然后对VP1基因的核苷酸与推导的氨基酸序列进行分析。结果表明,目前我国存在DHV-1和N-DHV两种血清型。其中分离到的12株为DHV-1,10株为N-DHV。依据VP1基因序列同源性进行的血清型分型结果与根据抗原性鉴定进行的血清型分型结果一致。12株DHV-1的氨基酸序列同源性为95%左右,10株N-DHV的氨基酸同源性为98%左右;DHV-1分离株与N-DHV分离株间氨基酸同源性为72%-77%。同血清型病毒株间的VP1基因变异很小,表明DHV的抗原性稳定。     

鸭肝炎病毒分子生物学研究进展

鸭病毒性肝炎(DVH)是由鸭肝炎病毒(DHV)引起雏鸭的一种以肝脏为主要病理变化的急性、高度致死性、接触性传染病。目前,该病在世界范围内流行,给养鸭业带来了巨大的经济损失,许多地区频频出现DHV免疫鸭群暴发鸭肝炎的报道,严重制约了养鸭业的健康发展。论文就鸭肝炎病毒的生物学特性与病毒基因组结构、分子生物学诊断方法、序列分析与基因分型、结构蛋白VP1、VP3等分子生物学研究进行综述,以期为合理制定鸭肝炎病毒的免疫方法与免疫程序提供参考,为鸭病毒性肝炎的综合防控提供依据。     

韩国型鸭肝炎病毒福建株的分离与鉴定

从福建省某养鸭场罹患鸭肝炎的病死鸭中分离到1株大小35～45 nm、十二面体对称的无囊膜病毒(暂命名为FJ01株),其鸭胚半数致死量(ELD50)为10~(-2.69)/0.2 mL,该病毒可被特异性韩国型鸭肝炎病毒免疫血清所中和,可被韩国型鸭肝炎病毒特异引物所扩增,而不能被1型鸭肝炎病毒引物所扩增。遗传进化分析表明鸭肝炎病毒FJ01株与韩国型鸭肝炎病毒关系密切,它们在进化树中共处一群。     

新型鸭肝炎病毒疫苗候选株的筛选

本试验对临床患病鸭分离的一株疑似鸭肝炎病毒进行了血清型鉴定和毒力测定。利用Ⅰ型和新型鸭肝炎病毒鉴别引物对提取的病毒RNA进行RT-PCR扩增;将分离病毒分别与Ⅰ型和新型鸭肝炎病毒阳性血清进行中和试验;根据测定的病毒ELD50,进行雏鸭攻毒和鸭胚肝细胞接毒试验。结果表明:RT-PCR扩增出了与新型鸭肝炎病毒预期片段相符的705bp条带;分离病毒不能被Ⅰ型鸭肝炎病毒阳性血清中和,新型鸭肝炎病毒阳性血清对该病毒的中和效价是1:200,说明该分离株属于新型鸭肝炎病毒。该毒株的ELD50为10-5.7/0.2mL,能引起攻毒鸭与临床病例一致的症状和病变以及显著的肝细胞病变,可作为新型鸭肝炎病毒的疫苗候选株开发应用。     

1型鸭肝炎病毒E53株VP1基因在昆虫细胞中的表达及产物分析

根据1型鸭肝炎病毒E53株基因组序列设计并合成一对特异性引物,RT-PCR扩增VP1基因,将其定向克隆至pFastBacTMHTB载体,转化至DH10BacTM感受态细胞中,蓝白斑筛选获得重组穿梭质粒rBacmid-VP1,重组质粒在脂质体的介导下转染昆虫细胞Sf9,获得重组杆状病毒。结果表明VP1蛋白在昆虫细胞中获得表达,表达产物能够与兔抗1型鸭肝炎病毒VP1蛋白多抗血清和鸭肝炎病毒阳性血清发生特异性反应。在昆虫细胞中表达VP1蛋白为VP1功能的研究及鸭肝炎病毒抗体的检测提供了物质材料。     

新型鸭肝炎病毒的分离鉴定及VP1基因序列分析

为了解新型鸭肝炎病毒(N-DHV)的变异情况,本实验从广西、河南、山东临床发病鸭体内分离到3株病毒.通过RT-PCR检测为N-DHV.将分离株进行鸭胚传代培养,并测定鸭胚毒的ELD50为10-3.29/0.2 mL～10-465/0.2 mL.以1型和N-DHV阳性血清分别与分离株进行血清交叉中和试验,结果表明,Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV-1)阳性血清对分离株无保护性.动物回归试验表明,分离株致死雏鸭的临床症状和病变与DHV-1相同,分离株的致死率为30％～70％.将分离株接种鸡胚,不产生任何病变,在鸡胚成纤维细胞中连续传5代后,细胞产生明显、规律的病变.扩增3株分离株的VP1基因,并进行氨基酸序列比对,结果表明3个分离株与DHV-C的同源性最高,与DHV-A的同源性最低,并存在氨基酸的插入和缺失.本实验表明3个分离株与韩国N-DHV属于同一血清型.     

鸭肝炎病毒VP1蛋白B细胞抗原表位预测及变异分析

以鸭肝炎病毒(DHV)SN株VP1基因序列为基础,运用Garnier-Robson、Chou-Fasman和Karplus-Schulz方法预测VP1蛋白的二级结构,并分别运用Kyte-Doolittle方法、Jameson-Wolf方法和Emini方法预测蛋白的亲水性、抗原指数和表面可及性,最后结合吴玉章的方法综合分析预测其B细胞抗原表位.结果显示,VP1蛋白C端第132～137、177～186、209～219区段有较好的亲水性、表面可及性和较高的抗原指数,并且在二级结构上含有易形成抗原表位的无规则卷曲和β-转角,可能是VP1蛋白的B细胞抗原优势表位;DHV SN株与弱毒疫苗株在推测的VP1 B细胞抗原表位177～186和209～219两个区域氨基酸序列变异较大.     

一株鸭肝炎病毒的分离与鉴定

从山东某养殖场送检的疑似鸭病毒性肝炎病料中分离到一株病毒（暂命名为SD株）,分别用鸭胚、雏鸭进行传代和病毒含量测定,E1-E8代鸭胚适应毒的ELD50在1015^-5.0-10^-6.0／0．1mL之间,E1、E2代鸭肝组织毒的LD50分别为10^-5.5／0．1mL、10^-6.7／0．1mL。动物回归试验结果表明,SD株鸭胚适应毒E2对4日龄雏鸭的致死率为100％;雏鸭毒力测定试验结果表明SD株雏鸭肝组织毒E,代对12日龄内雏鸭具有较高致死率,12日龄后随着日龄的增大,雏鸭的死亡率逐渐降低;理化特性鉴定结果表明,SD株为无囊膜病毒,对脂溶剂（乙醚和氯仿）、胰酶、酸、热均不敏感,且无血凝性。血清交叉中和试验和交叉保护试验结果表明,在血清型上,SD株与DHV-1无关。通过对SD株与韩国N-DHVVP1基因的序列比对和进化树分析,发现二者同源性在99％以上。结果证实,SD株是新型鸭病毒性肝炎病毒,而不是DHV-1。