羊乳清蛋白ACE及DPP-IV抑制肽的分离纯化与鉴定

使用中性蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶、风味蛋白酶和木瓜蛋白酶对羊乳清蛋白进行水解，分别在不同时间取样，体外测定其ACE抑制活性和DPP-IV抑制活性。通过中空纤维膜超滤、凝胶过滤层析和反向高效液相色谱（RP-HPLC）的手段对酶解产物进行逐步分离和纯化，评价各级分离产物的生物活性；通过液质联用（LC-MS/MS）的方法鉴定多肽的氨基酸组成，根据质谱结果合成多肽。结果表明：中性蛋白酶水解物具有一定的生物活性，双重活性多肽Pro-Pro-Ala-Ser-Glu-Val-Val-Lys-Pro对ACE和DPP-IV均有抑制作用，其IC₅₀值分别是573.32±4.63和2 065.35±22.30 μmol/L。Ile-Pro-Ala-Val-Phe-Lys-Ile-Asp具有较好的DPP-IV抑制活性，其IC₅₀值为964.14±4.09 μmol/L。羊乳清蛋白水解物可以作为食源性材料用于管理伴有高血压的Ⅱ型糖尿病患者的饮食。     

脱脂南极磷虾粉中降血糖与抗氧化肽的分离纯化与鉴定

食源性二肽基肽酶Ⅳ（Dipeptidyl peptidase-Ⅳ,DPP-Ⅳ）抑制肽和抗氧化肽分别有助于清除体内自由基和调节机体血糖。为实现脱脂南极磷虾粉的高值化利用,以及为糖尿病治疗寻找新方法,本研究从脱脂南极磷虾粉酶解产物中制备DPP-Ⅳ抑制肽和抗氧化肽段。使用碱性蛋白酶、中性蛋白酶和胰酶水解脱脂南极磷虾粉,探究时间与水解度、活性、产率的关系,并分离纯化多肽,最后通过分子对接确定抑制作用位点。结果表明,酶解液经超滤、Sephadex G15分离纯化和液相-质谱联用技术鉴定后,得到了4条具有DPP-Ⅳ抑制和抗氧化作用的肽,氨基酸序列分别为WPPLSPFRCPR、IPDWFLNRQ、FLWLKKTPLPL和DTVPWFPR。其中IPDWFLNRQ具备较高的DPP-Ⅳ抑制活性,DPP-Ⅳ抑制活性IC50值为（0.616±0.097）mmol/L;WPPLSPFRCPR具有较高的抗氧化活性,DPPH EC50值为（0.098 3±0.011） mmol/L,ABTS EC50值为（0.116±0.073） mmol/L。分子对接结果表明这4个肽主要通过氢键与DPP-Ⅳ活性中心及其以外的位点...     

碱性蛋白酶水解大豆多肽及抑制ACE效果的研究

[目的]为了进行碱性蛋白酶水解大豆多肽及抑制ACE效果的研究。[方法]利用胰蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和碱性蛋白酶分别水解大豆蛋白,制备具有ACE抑制活性的大豆多肽,通过正交优化试验确定碱性蛋白酶的最佳水解条件,考察底物浓度、反应时间、反应温度与大豆蛋白酶解多肽对ACE抑制活性的影响,并将超滤法和聚丙烯酰胺凝胺电泳技术相结合,考察大豆蛋白酶水解物的分子量分布。[结果]结果表明,碱性蛋白酶的最佳水解条件为底物浓度5%,加酶量4%,水解时间2h。[结论]该研究为更好地利用大豆蛋白展示了良好的应用前景。     

羧肽酶A/B水解虾副产物制备ACE抑制肽

为了获得血管紧张素转化酶(ACE)抑制肽,使用α-胰凝乳蛋白酶对虾副产物进行预酶解,再选择羧肽酶A/B进行酶解,通过透析和凝胶层析纯化后,测定分离肽的ACE抑制活性。通过检测水解度,确定α-胰凝乳蛋白酶的最优水解时间为4h,羧肽酶A/B最优水解时间为6h。两步酶解产物的ACE半抑制浓度(IC50)值为6.39mg/mL。通过透析,得到500Da和500~1 000Da 2个抑制活性更高的组分,IC50分别为1.69和2.87mg/mL。进一步通过Sephadex G-15凝胶层析分离,得到4个IC50值小于0.2mg/mL的组分,其中组分F8最低,为0.134mg/mL,显示了较高的ACE抑制活性。该结果验证了羧肽酶A/B酶解可制备出高活性ACE抑制肽。     

鱿鱼肝脏活性肽的制备及生物活性研究

[目的]为鱿鱼肝脏的高值化利用提供基础研究数据。[方法]以鱿鱼肝脏蛋白为原料,通过蛋白酶水解来制备生物活性肽,研究了多种蛋白酶水解鱿鱼肝脏制得水解液的抗凝血活性、抑制血管紧张素Ⅰ转换酶（ACE）活性及抗氧化活性。[结果]当鱿鱼肝脏水解液浓度为5 mg/ml时,中性蛋白酶的水解液对ACE抑制率为68.0%;APTT值为59.8 s,TT值为34.2 s,比空白对照组分别延长26.7和20.6 s,表明鱿鱼肝脏的中性蛋白酶水解液具有抗凝血活性。中性蛋白酶解液对Fe3＋的还原力为0.588,羟自由基清除能力为64.5%,说明鱿鱼肝脏中性蛋白酶水解液具有较好的抗氧化活性;而其余的木瓜蛋白酶、酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶的鱿鱼肝脏水解液的抗凝血活性和ACE抑制活性均低于中性蛋白酶水解液的酶解液活性。[结论]鱿鱼肝脏蛋白质具有较好的综合利用价值。     

鲶鱼骨酶解物的降血压肽活性研究

以鲶鱼骨蛋白为原料制备ACE抑制肽,采用碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶进行酶解,通过体外检测法测定其抑制率,优选出最佳用酶。通过单因素试验和正交试验,确定了碱性蛋白酶酶用量、pH、酶解温度、酶解时间、底物浓度等因素对ACE活性抑制效果的影响。结果表明:利用碱性蛋白酶水解鲶鱼骨,酶用量为500U/g、pH值8.5、温度为60℃、底物浓度为0.33kg/L、时间6h时酶解液对ACE的抑制活性最强,抑制率为88.36%。通过比较,最佳酶解条件下得到的降血压肽的ACE抑制率要高于降血压药尼莫地平和硝苯地平的ACE抑制率。     

昆仑雪菊中血管紧张素转化酶活性抑制成分的分离鉴定

[目的]从昆仑雪菊中分离纯化抑制血管紧张素转化酶(angiotensin-converting enzyme,ACE)活性成分,鉴定其化学结构,并评价其对ACE的抑制活性.[方法]以抑制ACE活性为指标,筛选出最佳的昆仑雪菊萃取溶剂,提取得到粗提物,活性跟踪分离纯化粗提物中的单体化合物,并对单体化合物的活性进行评价.[结果]最佳的提取溶剂为甲醇,利用常压硅胶柱层析和Sephedex LH-20柱层析从粗提物中分离得到5个单体化合物,采用核磁共振(NMR)和电喷雾质谱(ESIMS)鉴定其化学结构:化合物1为咖啡酸甲酯;化合物2为脱镁叶绿素a;化合物3为β-香树脂;化合物4为异奥卡宁-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷;化合物5为对香豆酸甲酯.活性测试结果表明:化合物1、4和5都表现出了较强的抑制ACE活性,其中化合物4对ACE的抑制活性最强,IC50为(167.02±4.32) μmol·L-1,其次为化合物1和5,IC50分别为(237.74±5.82) μmol·L-1和(331.57±4.69) μmol ·L-1,提示这些化合物可能为昆仑雪菊中潜在的降血压物质.[结论]本研究结果为深入研究昆仑雪菊的降血压作用机制提供了物质基础.     

玉米蛋白粉水解多肽对光磷水蜈蚣的生根抑制活性

以木瓜蛋白酶、中性蛋白酶为水解酶,以玉米蛋白粉为底物,制备出不同酶解时间条件下的玉米蛋白水解多肽。用培养皿生物分析法检测不同玉米蛋白水解多肽在不同浓度(0.5 mg/mL、1 mg/mL、2 mg/mL、5 mg/mL)条件下对光磷水蜈蚣(Kyllinga brevitoliavar.leiolepis)种子生根抑制活性。结果表明:①两种蛋白酶不同水解时间制备的玉米蛋白粉水解多肽对光鳞水蜈蚣种子萌发生根均有抑制作用,且随着浓度增高生根抑制活性增强;②木瓜蛋白酶在水解3 h和6 h制得玉米多肽的生根抑制活性明显优于水解9 h和12 h制得的玉米多肽,而中性蛋白酶在不同水解时间水解玉米蛋白粉所得的水解多肽对光磷水蜈蚣的抑制活性无显著性差异;③木瓜蛋白酶制备的玉米多肽比中性蛋白酶制备的玉米多肽生根抑制活性强,并达到极显著性差异水平(P<0.01)。     

鸡油菌转化虾副产品产血管紧张素转换酶抑制剂的条件优化

为探索高附加值回收利用虾加工废弃物的方法,利用鸡油菌(Cantharellus cibarius)转化虾加工废弃物,以PB设计、最陡爬坡试验和响应面设计对转化条件进行优化,以血管紧张素转换酶(ACE)抑制活性为指标考察了转化产物的抗高血压活性。结果表明,鸡油菌转化虾加工废弃物最优液体发酵条件(兼顾菌丝产量和ACE抑制活性)为料液比1∶1.857,冰醋酸加入量1.25%;对该转化条件的验证实验结果与发酵条件数学模型预测值无显著性差异(P0.05),在此条件下菌丝体产量为(27.837±1.011)g/L,较优化前提高21.231%;菌丝体水提物ACE抑制IC50为(0.394±0.071)mg/m L,显著低于优化前(P0.05),脱腥得分为3.611±0.044。以药用价值和经济价值较高的鸡油菌转化虾加工废弃物,其产物具有较高的ACE抑制活性,可从其中分离得到较高活性的ACE抑制剂,而且可使产物脱腥。     

3种蛋白酶制备的鱼粉水解物的生根抑制活性的研究

以碱性蛋白酶、风味蛋白酶、复合蛋白酶为水解酶制备出鱼粉多肽,用培养皿生物分析法检测不同鱼粉水解物在0,0.5~1、1.5~22、.5 mg/ml)浓度下对多年生黑麦草种子种子萌发根系生长抑制活性.所有的数据分析均采用SPSS 13.0 for Windows分析处理.结果表明:3种鱼粉水解物对多年生黑麦草种子萌发根系生长均有抑制活性,且随着水解物浓度增加根系生长的抑制活性增强;碱性蛋白酶和复合蛋白酶制备的鱼粉水解物的根系抑制活性要明显高于风味蛋白酶制备的鱼粉水解物。     

络石内生真菌Myrothecium roridum(IFB-E009)次生代谢产物的研究

该试验从络石(Trachelospermum jasminoides)内生的露湿漆斑菌属真菌Myrothecium roridum(IFB-E009)液体发酵产物中分离并鉴定了8个化合物,其中化合物1～4为单端孢霉烯类化合物,5～6为酰胺类化合物,7为环二肽化合物,8为尿嘧啶。活性测试表明,化合物1、4有细胞毒活性,对SW1116(人结肠癌细胞株)具有抑制作用,IC50分别为25.68和38.93μmol/L,而对照药阿霉素的IC50为5.31μmol/L。该研究可为开发利用药用植物内生菌提供理论和实践依据。     

槲皮素糖苷类化合物的合成及其对α-葡萄糖苷酶的抑制活性

以芦丁为原料合成了6个槲皮素糖苷类化合物,并经MS,~1H NMR及~(13)C NMR确证其结构。以阿卡波糖为阳性对照测试目标产物对α-葡萄糖苷酶的抑制活性,发现当该类化合物中糖基上的羟基被苯甲酰化后能增强其对α-葡萄糖苷酶的抑制活性,其中V-b和V-c的IC50各为19.4μmol/L,21.5μmol/L,而未被苯甲酰化的化合物VI-b和VI-c的抑制活性相对较低。这将为该类化合物在降糖活性方面的深入研究提供参考。     

鲢鱼(Hypophthal michthys molitrix)背肌中组织蛋白酶B2的纯化与酶学性质鉴定

对鲢鱼背部白肌中的组织蛋白酶B2,进行了分离纯化及酶学性质的鉴定。目的酶经粗提后,再通过酸处理、硫酸铵分级沉淀、超滤、DEAE-Sephacel、Sephacryl S-100、SP-Sepharose F.F.、Blue-sepharose 6 F.F.、Con A-Sepha-rose等步骤纯化,纯化倍数达到396.5倍。经SDS-PAGE分析,该酶呈现了分子量约为25和20KDa的2条带。组织蛋白酶B2的最适反应温度和pH分别为30~35℃和pH5.5。巯基还原剂DTT、L-Cys、β-Me均显著地激活了该酶的活性。50μmol/L的E-64能够完全抑制其活性。Cl-浓度为100μmol/L以内时,对组织蛋白酶B2起到激活作用,200μmol/L时则表现为抑制作用。25 mmol/L的P2O74-,即可有效抑制该酶的活性。该纯化酶能够水解Z-Arg-Arg-MCA、Z-Phe-Arg-MCA,但是不能够水解L-Arg-MCA。组织蛋白酶B2水解Z-Arg-Arg-MCA、Z-Phe-Arg-MCA的Km值分别为7.15及226μmol/L,表明Z-Arg-Arg-MCA是该酶的最适底物。     

虾夷扇贝卵巢酶水解产物抗氧化性的研究

利用耐热蛋白酶水解虾夷扇贝Patinopecten yessoensis卵巢,加水分解得到富含多肽的蛋白粉末,测定酶水解产物中残存氧的浓度和对DPPH自由基活性消去的能力。结果表明,酶水解物的产率为17.8%,酶水解物中蛋白质的含量为87.92%;10 g/L虾夷扇贝卵巢酶水解产物能消去DPPH自由基61.68%的活性。试验表明,虾夷扇贝卵巢酶水解物有较好的抗氧化性。     

制备麦胚抗氧化多肽酶解条件优化的研究

为研究优化利用麦胚蛋白的新途径,以提高麦胚蛋白的附加值。采用碱性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶三种酶对麦胚蛋白进行水解,考察不同酶解产物、水解时间、水解温度和水解pH值条件下的水解度、蛋白溶解度和硫代巴比妥酸反应物值（TBARS）,确定制备麦胚抗氧化肽的较佳水解参数。研究结果表明：麦胚蛋白水解物具有抗氧化活性,而且制备...     

新型杂环膦酸酯衍生物的合成与生物活性

为了获得广谱、高效的活性先导物,我们在前期研究工作的基础上,结合药物设计原理,采用简便方法合成了一系列新型杂环膦酸酯衍生物,其结构经IR,(~1H,~(13)C,~(31)P,~(19)F)NMR和HRMS(ESI)等确证与表征.生物活性测试结果表明,部分化合物具有抗大肠杆菌、铜绿假单胞杆菌及金黄色葡萄球菌等活性,尤其是化合物A_4,A_8,A_(22),A_(24),A_(27)和A_(28)抗菌活性好,与对照药剂氨苄西林(Ampicillin)的MIC接近或相当.同时,发现部分化合物具有抑制肿瘤细胞增殖的作用,其中化合物A_(24)和A_(28)分别对人结肠癌细胞HT29和人肺癌细胞A549的IC_(50)为18.0±0.7μmol/L和17.1±1.3μmol/L,接近对照药SAHA(IC_(50)分别为14.3±1.1μmol/L和12.5±1.8μmol/L).在此基础上研究其构效关系,对进一步结构改造与优化具有十分重要的意义.     

戴氏虫草菌丝体抗肿瘤化学成分研究

研究戴氏虫草菌丝体抑制肿瘤细胞增殖活性有效部位的化学成分及其抑制肿瘤细胞活性。采用液体深层发酵制备戴氏虫草菌丝体,MTT法筛选其抑制肿瘤细胞增殖活性的有效部位,反复正相柱层析,Sephadex LH-20等方法分离纯化其有效部位中的化学成分,利用EI、ESI及1D-NMR等技术对其结构进行鉴定;并研究他们对肿瘤细胞增殖的抑制活性。结果显示,戴氏虫草菌丝体石油醚、乙酸乙酯萃取部位为抑制肿瘤细胞增殖活性部位,并从中分离得到6个化合物,分别为反式-16-十八碳烯酸(化合物1)、壬二酸(化合物2)、5α,8α-麦角甾-6,22-二烯-3β-醇(化合物3)、亚油酸甲酯(化合物4)、亚油酸(化合物5)和十七-烷醇(化合物6)。活性检测表明,化合物2对舌癌Tca-8113细胞增殖具有较高的抑制活性,IC50值为31.90μmol/L,化合物3对乳腺癌MDA-MB-435细胞和BT474细胞具有较高的细胞增殖抑制活性,IC50值分别为25.57、26.31μmol/L。从戴氏虫草菌丝体抑制肿瘤细胞增殖的活性部位中分离到6个化合物,化合物1~2、4~6为首次从该菌丝体中分离得到。化合物2、3分别选择性地对Tca-8113细胞和MDA-MB-435细胞、BT474细胞有较强的细胞增殖抑制活性,可能为戴氏虫草菌丝体抑制肿瘤细胞增殖的有效成分。     

昆仑雪菊中2个黄酮类化合物的分离鉴定及其抗氧化活性评价

从昆仑雪菊中分离纯化具有抗氧化活性的单体化合物。以抗氧化活性为指标,采用活性追踪的方法,筛选最佳的昆仑雪菊黄酮类化合物提取溶剂并对粗提物进行分离纯化得到单体化合物,并采用铁离子还原/抗氧化力测定法(FRAP法)、1,1-二苯基-2-硝基苯肼自由基清除法(DPPH法)和2,2-联氮基-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨盐自由基清除法(ABTS法)对化合物进行活性评价。结果表明:最佳的提取溶剂为甲醇,利用常压硅胶柱层析和Sephedex LH-20柱层析从粗提物中分离得到2个单体化合物;采用核磁共振(NMR)和电喷雾质谱(ESIMS)鉴定其化学结构:化合物1为2',3,4,4'-四羟基查尔酮,化合物2为4,2',4'-三羟基查尔酮。抗氧化活性测试结果表明,化合物1和化合物2的FRAP值均小于阳性对照α-生育酚,对DPPH自由基清除率的半数抑制浓度(IC50)分别为(45.32±0.26)μmol·L-1和(64.78±0.79)μmol·L-1,均低于阳性对照α-生育酚,对ABTS自由基清除率的IC50分别为(27.49±0.86)μmol·L-1和(32.13±2.79)μmol·L-1,均低于阳性对照α-生育酚。结论:从昆仑雪菊中分离得到的2个黄酮类化合物均具有很强的抗氧化活性。     

胃-胰蛋白酶水解蜂王浆主蛋白制备血管紧张素转化酶抑制肽工艺的优化

采用胃-胰蛋白酶水解蜂王浆主蛋白(MRJPs),对底物浓度、pH值、酶作用时间和蛋白酶浓度对水解效果的影响进行单因素分析,然后通过正交试验对胃-胰蛋白酶共同作用的酶解工艺进行优化;最后采用超滤分离技术对王浆主蛋白水解产物(H-MRJPs)进行分离,以制备血管紧张素转化酶(ACE)抑制肽。结果表明:优化的酶解工艺为37℃恒温、质量比为1%的胃蛋白酶(pH=2.0)和胰蛋白酶(pH=7.5)各水解2h;在最佳工艺条件下,MRJPs水解度为28.7%,总氮回收率为35.5%;通过SDS-PAGE电泳未检测到MRJPs水解产物(H-MRJPs)含有明显的蛋白条带;采用超滤法对H-MRJPs分离得到分子质量范围为<1、1～5和>5ku的3类血管紧张素转化酶(ACE)抑制肽,其ACE半抑制质量浓度(IC50)分别为0.33、0.61和1.09mg.mL-1,即以分子质量<1ku的产物活性最强。该结果为利用王浆主蛋白开发降压功能食品提供了科学依据。     

中性蛋白酶水解乳清蛋白条件的研究

以A.S1398中性蛋白酶水解乳清蛋白制取乳清蛋白水解液。通过单因素及L9(34)正交实验优化水解工艺条件,在优化的工艺条件下,乳清蛋白的水解度可达20.31%。