中华豆芫菁β-actin基因cDNA的克隆、序列分析及表达量检测

【目的】克隆中华豆芫菁(Epicauta chinensis Laporte)β-actin基因全长cDNA序列,并检测其在相对实时定量研究中作为内参基因的可靠性。【方法】采用RT-PCR和RACE技术扩增中华豆芫菁β-actin基因全长cD-NA序列,利用生物信息学软件对其进行序列分析;并用实时定量PCR方法检测在中华豆芫菁雄性成虫脑、中肠、精巢和脂肪体4种不同组织中及注射刺激和非刺激条件下β-actin基因的表达量。【结果】中华豆芫菁β-actin基因全长1 673bp,其中5′非编码区88bp,3′非编码区455bp,开放阅读框为1 120bp,编码376个氨基酸,推测其编码蛋白分子质量约为93.6ku,理论等电点为5.09,富含6类特定功能位点,其氨基酸序列与其他昆虫的β-actin序列一致性可达97%～99%;实时定量PCR结果显示,该基因在中华豆芫菁不同组织、注射刺激与非刺激情况下表达量无显著差异(P>0.05)。【结论】中华豆芫菁β-actin基因可作为基因表达定量研究中的可靠内参。该基因的cDNA序列已递交GenBank,获得登录号为JQ764814。     

母源因子boule在光棘球海胆性腺中的表达与定位

为鉴定光棘球海胆Mesocentrotus nudus生殖细胞标记基因,通过基因克隆、荧光定量PCR及切片原位杂交等技术分析了光棘球海胆(湿体质量为76.8 g±10.0 g)母源因子(boule)基因的分子特征及动态表达模式。结果表明:光棘球海胆boule cDNA序列全长为1788 bp,其中,3′非编码区为601 bp,5′非编码区为146 bp,开放阅读框(open reading frame,ORF)为1041 bp,共编码346个氨基酸,包含一个保守的RRM结构域;荧光定量PCR结果显示,boule为母源因子,在整个胚胎发育时期均有表达;boule基因在处于生长期(stageⅡ)光棘球海胆的肠、管足、体腔液和性腺中均有表达,其中,boule基因在精巢表达量最高(P<0.05);在卵巢中表达量随卵母细胞的成熟而逐渐升高,在成熟期(stageⅣ)卵巢中达到最高,精巢中表达量仅在生长期(stageⅡ)及成熟前期(stageⅢ)有较高表达;切片原位杂交显示,boule基因在光棘球海胆精巢的生殖细胞中特异表达,卵巢中未检测到阳性细胞信号。研究表明,光棘球海胆boule基因是雄性生殖细胞标记基因,本研究结果可为海胆雄性生殖细胞发育相关研究提供数据资料。     

二色补血草中2个金属硫蛋白基因的克隆及分析

从二色补血草中分离出2个金属硫蛋白基因的cDNA全序列,分别命名为LbMT1和LbMT2。LbMT1全长为569bp,其中5′非编码区23bp,3′非编码区300bp,开放读码框(ORF)长246bp,编码含81个氨基酸的蛋白,相对分子质量为8070,等电点为4.7;LbMT2全长为523bp,其中5′非编码区61bp,3′非编码区216bp,开放读码框长246bp,编码81个氨基酸,编码蛋白的相对分子质量为8000,等电点为5.0。这2个基因编码的氨基酸都含有14个半胱氨酸Cys,分布在蛋白质的N端和C端,呈CC、CXC和CXXC形式排列。疏水性分析表明:这2个蛋白都存在35~48个氨基酸之间较强的疏水区。通过对多种植物的MT蛋白序列比对分析表明,金属硫蛋白家族在氨基酸数目上保守性差,但半胱氨酸残基(Cys)的位置和数目保守性达到100%,揭示了Cys对金属硫蛋白的功能十分重要。这2个基因已经在Genbank上注册,LbMT1基因的登录号为EF103574,LbMT2基因的Genbank登录号为EF103575。     

三角帆蚌KLHL10基因的特征和表达分析

为了探究KLHL10基因在三角帆蚌性别分化中的作用，利用RACE （Rapid-amplification of cDNA ends）克隆了其cDNA全长，使用实时荧光定量分析比较其在6个不同组织（性腺、鳃、肝胰腺、斧足、闭壳肌、外套膜）、早期发育阶段（1~8月龄）性腺及12、24、36月龄雌雄性腺中表达水平的差异，运用RNA干扰（RNAi）对其功能进行初步探究。结果显示KLHL10基因cDNA全长为2 361 bp，其中5''非编码区长93 bp，3''非编码区长447 bp，开放阅读框（ORF区）长1 821 bp，编码606个氨基酸；qRT-PCR结果显示KLHL10基因在精巢中高表达；早期发育阶段在6月龄时表达量最高；12、24、36月龄的表达结果显示，KLHL10基因在精巢中的表达量均高于同时期在卵巢中的表达量（P<0.05）。同时，设计KLHL10基因的3条dsRNA干扰链，结果显示RNA干扰能有效减少KLHL10基因在性腺组织的表达量。根据以上结果推测KLHL10基因在三角帆蚌中是雄性相关基因，其可能参与三角帆蚌的性别分化与精巢发育。     

青海湖裸鲤TOB1和TOB2基因的克隆与表达分析

【目的】对青海湖裸鲤TOB1和TOB2基因进行克隆及表达分析,为揭示其在青海湖裸鲤生长和生理过程中的作用奠定基础。【方法】采用PCR和RACE技术克隆青海湖裸鲤中TOB1和TOB2基因的cDNA全长序列,对其特性进行了生物信息学分析。以β-actin为内参基因,采用实时荧光定量PCR法(qRT-PCR)检测TOB1和TOB2基因在3龄成鱼肾脏、肠、鳃、脑、心脏、肌肉等组织及发育12,72,120,168,216 h胚胎中的表达水平。【结果】青海湖裸鲤TOB1 cDNA全长为1 734 bp,5′非编码区为466 bp,3′非编码区为296 bp,开放阅读框长972 bp,编码323个氨基酸。TOB2 cDNA全长为2 785 bp,5′非编码区为51 bp,3′非编码区为1 582 bp,开放阅读框为1 152 bp,编码383个氨基酸。TOB1和TOB2在N端均具有明显的BTG家族结构域,且系统进化分析显示2个TOB蛋白与鲤科鱼类同源性较高,亲缘较近。qRT-PCR结果表明,TOB1和TOB2在3龄成鱼的肾脏、肠、鳃、脑、心脏、肌肉等组织中均有表达;TOB1在3龄成鱼的心脏组织中表达量最高,其次为脑和肌肉组织,在鳃组织中的表达量最低;TOB2在3龄成鱼的脑组织中表达量最高,其次为肌肉。TOB1及TOB2在不同发育时期胚胎中均有表达,且都在12 h胚胎中表达量最高。【结论】TOB1及TOB2在3龄成鱼各个组织及胚胎中均有表达,但表达量有较大差异,表明2个基因均具有时空表达特异性。     

橘小实蝇蜕皮激素合成通路基因鉴定分析及饥饿对幼虫发育的影响

【目的】蜕皮激素（ecdysone）是昆虫体内一种重要的激素,参与调控昆虫的生长发育,并且能对环境胁迫进行响应。研究旨在明确橘小实蝇（Bactrocera dorsalis Hendel）蜕皮激素合成通路基因（ecdysone synthesis pathway gene）的分布和特定条件下的表达特性,为进一步开展橘小实蝇变态发育与抗逆胁迫机制的研究提供理论支持。【方法】采用RT-PCR和RACE技术克隆蜕皮激素合成通路基因BdCyp302a1、BdCyp315a1和BdCyp314a1,利用实时定量PCR（qPCR）技术检测该合成通路基因BdNvd、BdCyp306a1、BdCyp302a1、BdCyp315a1和BdCyp314a1在幼虫不同发育阶段（幼虫1-8日龄）、不同组织（前胸腺复合体、脂肪体、中肠、马氏管、表皮和气管）和饥饿条件下的表达模式,明确饥饿对幼虫发育的影响。【结果】克隆获得了3个蜕皮激素合成通路基因序列的开放阅读框,分别为BdCyp302a1（GenBank登录号：JQ027284）、BdCyp315a1（GenBank登录号：KC515377）和BdCyp314a1（GenBank登录号：JQ229645）,且上述序列均具备P450典型结构域：Helix-C/I/K、PERF基序、血红蛋白结合位点以及脯氨酸/甘氨酸富集区,其氨基酸序列较为保守。qPCR检测结果显示蜕皮激素合成通路基因BdNvd、BdCyp306a1和BdCyp314a1幼虫末龄阶段表达量显著升高,其最高表达量分别是最低点的7.33、10.89和7.82倍,但在幼虫前4 d表达量差异不显著。而BdCyp302a1和BdCyp315a1在整个幼虫阶段表达量保持相对稳定。对不同组织的研究发现,蜕皮激素合成通路基因在所选的6个组织中均有表达,其中BdNvd、BdCyp306a1和BdCyp315a1在幼虫前胸腺表达量最高,在其他组织中表达量差异不显著;BdCyp302a1在各组织中的表达量由高到低为脂肪体>前胸腺>表皮/马氏管>气管/中肠,该基因在脂肪体的表达量是中肠的30倍;BdCyp314a1在中肠、马氏管和脂肪体内的表达量依次降低,但均极显著高于其他3个组织。橘小实蝇幼虫在饥饿处理12 h后即出现化蛹现象,其化蛹比例随饥饿时间延长而上升。对蛹宽和蛹长的测量中发现,饥饿导致蛹个体显著缩小,但未影响其存活率。同时,饥饿导致蜕皮激素合成通路基因BdNvd、BdCyp302a1和BdCyp314a1表达量在饥饿处理6 h后出现显著上调,并在处理48 h后出现显著下调;但饥饿处理并未影响BdCyp315a1的表达水平。【结论】蜕皮激素合成通路基因在橘小实蝇幼虫组织的表达具有差异性,并参与介导幼虫-蛹的变态过程和对营养胁迫的响应。     

荷那龙罗非鱼ghrelin cDNA的克隆及表达特征

以荷那龙罗非鱼胃组织中提取的总RNA为模板,采用RT-PCR方法克隆出荷那龙罗非鱼ghrelin前体基因的cDNA全序列。所获得的ghrelin cDNA总长为833 bp,包括97 bp的5′非编码区,412 bp的3′非编码区和324 bp的开放阅读框,编码107个氨基酸残基。核苷酸序列同源性分析显示,荷那龙罗非鱼ghrelin与莫桑比克罗非鱼和尼罗罗非鱼ghrelin序列的相似性达99.0%以上。采用半定量RT-PCR方法检测雌、雄荷那龙罗非鱼胃、肌肉和垂体等多个组织中ghrelin基因的表达,结果显示,荷那龙罗非鱼ghrelin基因有广泛的组织分布,ghrelin基因在雌、雄鱼胃中的表达量均最高,在其他组织的表达量存在雌雄个体差异。雌鱼肌肉中ghrelin基因的表达量明显高于雄鱼,是雄鱼的132倍。试验鱼饥饿4周后,采用荧光定量RT-PCR方法检测胃中ghrelin基因表达量变化,结果表明:饥饿组较对照组ghrelin mRNA表达量有增加,饥饿组个体中ghrelin基因表达量最高的个体的表达量比对照组中表达量最低的个体增加了47.3倍。     

草鱼PepT2基因的克隆及其表达分析

采用RT–PCR和cDNA末端快速扩增技术克隆草鱼(Ctenopharyngodon idellus) II型小肽转运载体(PepT2)基因全长cDNA序列,对其进行生物信息学和共线性分析,并采用实时荧光定量PCR技术检测分析健康草鱼PepT2基因在不同组织中的表达情况。结果表明：草鱼PepT2基因的cDNA序列全长为2733 bp,包括开放阅读框2169 bp(编码722个氨基酸残基),5′非编码区82 bp和3′非编码区482 bp;草鱼PepT2基因结构含有20个外显子和19个内含子;预测蛋白相对分子质量为8.032×104,等电点为6.01,该蛋白具有与哺乳动物同源蛋白类似的12个螺旋跨膜结构,并且在跨膜区9和10之间有1个大的外环,跨膜区氨基酸高度保守,含有6个蛋白激酶C磷酸化位点和3个N–糖基化位点;预测的PepT2蛋白三级结构包含有18个α–螺旋和21个β–折叠;氨基酸序列同源性分析结果显示,草鱼PepT2氨基酸序列与斑马鱼(Danio rerio)的同源性最高,为86.65%,与其他所比较的物种的同源性则为52.83%~68.15%;系统进化树分析表明,草鱼与斑马鱼的亲缘关系最近;与斑马鱼相比,草鱼PepT2所在的染色体保留着大多数基因,具有保守的基因块;实时荧光定量表达分析表明,草鱼PepT2在肠道中的表达量最高,在肾脏中的表达量次之。     

梨小食心虫actin基因全长cDNA克隆与序列分析

为梨小食心虫其他基因表达调控研究提供内参基因以及actin基因的研究,运用RT-PCR和RACE技术,克隆获得梨小食心虫actin基因全长cDNA序列,并对其进行生物信息学分析。结果表明,该基因cDNA序列全长为1 451bp,其中包括67bp的5′非编码区、253bp的3′非编码区和1 131bp的开放性阅读框,编码376个氨基酸。该蛋白预测分子质量为41.776 8ku,等电点为5.22,氨基酸序列中有6类功能位点,具有actin家族典型特征,与其他昆虫actin氨基酸序列高度同源,达97%~99%。成功克隆梨小食心虫actin基因全长cDNA,该序列已提交GenBank,登录号为KF022227。     

小麦蛋白激酶TaNPK启动子的克隆及活性分析

 【目的】克隆小麦蛋白激酶基因TaNPK启动子,并分析5′非编码区对盐胁迫的响应,探索TaNPK的调控机制,为解析小麦抗盐机制提供理论依据。【方法】利用染色体步移技术从小麦中分离TaNPK读码框上游序列,构建启动子缺失突变体,在PEG4 000介导下将重组质粒转入拟南芥叶片原生质体进行瞬时表达分析,以gus为报告基因研究不同调控序列的活性及盐诱导性分析。【结果】获得了TaNPK读码框上游2 004 bp的启动子序列,PEG介导的拟南芥原生质体瞬时表达分析表明,5′端缺失片段都在不同程度上驱动了GUS的表达;经过NaCl处理后的原生质体,GUS的表达量比不经处理的对照组明显提高,这与NaCl处理下TaNPK的实时荧光定量分析结果一致。【结论】经克隆获得了受盐胁迫诱导的小麦TaNPK启动子,启动子缺失区段在不同程度上驱动了gus的表达,-1 083—-1 296 bp区段可能含有响应盐胁迫的负调控元件。     

稻曲病菌致病力丧失突变菌株B-1015的T-DNA标记基因的克隆

【目的】研究稻曲病菌（Ustilaginoidea virens）致病力丧失突变菌株B-1015,克隆和分析T-DNA插入位点的侧翼序列,为稻曲病菌的致病机制研究提供参考。【方法】分析稻曲病菌T-DNA插入突变体B-1015菌株的生长速率、产孢量、孢子萌发率以及致病力等生物学表型。用PCR检测T-DNA在B-1015基因组中插入的稳定性,用Southern杂交检测T-DNA插入的拷贝数,用hiTail-PCR扩增T-DNA侧翼序列,用RACE PCR克隆T-DNA标记基因,半定量RT-PCR分析所克隆基因的表达情况。【结果】与野生菌株P1相比,突变菌株B-1015的生长速率和产孢量都有较明显的降低,孢子萌发率无明显差异,致病力丧失。分子检测结果表明T-DNA在B-1015基因组中为稳定的单拷贝插入。hiTail-PCR得到的T-DNA两端侧翼序列在野生型菌株基因组上不相连,RACE PCR在两边的侧翼序列上分别克隆得到Uvt-1015R和Uvt-1015L。预测分析表明Uvt-1015R包含一个长度为948 bp的开放阅读框（open reading frame finder,ORF）,可编码295个氨基酸,5′端非编码区（5′-untranslated regions,5′-UTR）长度为 341 bp,3′端非编码区（3′-untranslated regions,3′-UTR）长度为271 bp。Uvt-1015L包含一个长度为351 bp的ORF,可编码116个氨基酸,5′-UTR为31 bp,3′-UTR长度为174 bp。在已知功能的蛋白中检索,没有发现与Uvt-1015R和Uvt-1015L基因同源的蛋白。序列分析发现T-DNA插入在两个基因序列中间,RT-PCR结果显示,在突变菌株B-1015中,Uvt-1015R表达量下降,Uvt-1015L不表达。【结论】 稻曲病菌突变菌株B-1015致病力等重要生物学表型发生改变,可能是由于T-DNA的插入导致了B-1015基因组重排和Uvt-1015R、Uvt-1015L基因结构的破坏。     

橘小实蝇羧酸酯酶基因BdCAREB1的克隆及其表达模式解析

【目的】在克隆获得橘小实蝇（Bactrocera dorsalis）1条羧酸酯酶基因全长序列的基础上,解析该基因在橘小实蝇不同发育阶段和组织以及经高效氯氰菊酯饲喂后的表达模式。同时结合之前完成的有关橘小实蝇羧酸酯酶生化特性以及增效剂处理研究结果,综合分析橘小实蝇羧酸酯酶对高效氯氰菊酯作用的应激反应,为明确羧酸酯酶对菊酯类杀虫剂的解毒代谢机制奠定基础。【方法】通过同源序列比对的方法,从橘小实蝇转录组数据中筛选出1条羧酸酯酶基因序列片段,利用cDNA末端快速扩增技术（RACE）扩增得到该基因的全长cDNA序列;应用生物信息学分析软件对该基因的开放阅读框、编码的氨基酸序列、分子量等信息进行预测,并基于最大似然法构建该基因与其他昆虫相关基因序列的系统发育树,阐明其分子生物学特征。此外,分别提取橘小实蝇不同发育阶段以及3龄幼虫的中肠、脂肪体、马氏管和气管等组织的RNA,在内参基因稳定性评估筛选的基础上,运用qPCR的方法解析该基因在不同发育阶段和组织间以及药剂处理后的表达模式。【结果】从橘小实蝇转录组数据库中筛选出1条长度为1 028 bp的羧酸酯酶基因片段,通过对5′端和3′端进行RACE扩增分别得到长度为1 073和625 bp的目的片段,经序列拼接和验证后,确定该基因全长为1 872 bp,完整开放阅读框1 710 bp,编码569个氨基酸,推测其蛋白质分子量为63.3 kD,理论等电点6.38。该基因经序列比对命名为BdCAREB1,GenBank登录号为KF539980。基于最大似然法构建的系统发育树显示,该基因编码的蛋白质与双翅目昆虫的羧酸酯酶具有高度的同源性。分析其在不同发育阶段的表达模式发现,BdCAREB1在3龄幼虫期的表达量最高,其次为成虫期,而在卵期的表达量最低。在橘小实蝇3龄幼虫不同组织间的定量分析结果表明,BdCAREB1在脂肪体中表达水平最高,其次在中肠和马氏管的表达水平较低且接近,而在气管的表达量最低。经饲喂0.33 μg?g-1（药剂/饲料）的高效氯氰菊酯后检测BdCAREB1在整虫及组织间的表达情况发现,该基因在幼虫以及脂肪体中的表达量显著上调。【结论】橘小实蝇BdCAREB1的表达具有发育阶段和组织特异性,在幼虫期和脂肪体的表达量最高,并对高效氯氰菊酯处理表现出明显的应激反应,具有可诱导性。结合此前完成的橘小实蝇羧酸酯酶活性测定及增效剂研究结果,分析该基因很可能参与橘小实蝇对高效氯氰菊酯的解毒代谢。     

亚洲玉米螟GOBP2的克隆、原核表达及多克隆抗体制备

 【目的】克隆、序列分析和原核表达亚洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）GOBP2（OfurGOBP2)的cDNA。【方法】以亚洲玉米螟触角为材料,采用RT-PCR结合RACE方法克隆OfurGOBP2的cDNA序列,并在pGEX-4T-2/BL21（DE3）系统中进行原核表达, 进一步利用制备的抗体检测OfurGOBP2蛋白。【结果】从亚洲玉米螟触角中获得了GOBP2的cDNA序列（GenBank登录号为DQ673101）,序列分析表明,OfurGOBP2开放阅读框489 bp,编码162个氨基酸残基,氨基酸序列中有6个保守的半胱氨酸位点,具有气味结合蛋白的典型特征。一致性分析显示,OfurGOBP2与其它鳞翅目昆虫GOBP2编码的氨基酸一致性较高,表明昆虫的GOBP2在分子进化过程中是保守的。进一步将OfurGOBP2与表达载体pGEX-4T-2连接,转入大肠杆菌BL21（DE3）中,经IPTG诱导成功表达了相对分子质量为41 kD的可溶性融合蛋白。SDS-PAGE分析和Western印迹检测结果表明,OfurGOBP2能够高效表达,并与预测的融合蛋白分子量相符。利用制备的多克隆抗体对亚洲玉米螟GOBP2进行Western-blot分析,证明其能够特异识别OfurGOBP2蛋白。【结论】成功克隆了编码并表达亚洲玉米螟气味结合蛋白GOBP2 的cDNA序列,并制备了多克隆抗体,可用于深入研究亚洲玉米螟GOBP2的结构和功能。     

大足黑山羊PHLDA2基因的克隆、组织表达与印记状况分析

【目的】克隆大足黑山羊PHLDA2（pleckstrin homology-like domain, family A, member 2）基因序列,分析其组织表达特征、印记状况以及与胎盘性状的关系,为深入研究该基因在山羊胎盘中的功能积累数据。【方法】根据人、牛和猪PHLDA2的保守区域设计引物以RT-PCR方法扩增大足黑山羊该基因部分cDNA序列,进一步利用5′-和3′-RACE技术获得全长cDNA序列;利用ORF Finder和ProtParam等在线工具分析PHLDA2基因序列特征;采用Real-time PCR方法分析PHLDA2在大足黑山羊心、肝、脾、肺、肾、大脑、肌肉、脂肪、舌和胎盘等10个组织的表达差异;寻找大足黑山羊和波尔山羊PHLDA2基因序列SNP位点,基于表达SNP的方法分析该基因在F₁代组织中的印记状况;采用线性回归的方法分析PHLDA2表达量与胎盘性状的关系。【结果】克隆得到935 bp大足黑山羊PHLDA2的cDNA全长序列,其中5′-UTR、3′-UTR和编码序列分别为62 bp、450 bp和420 bp,其编码140个氨基酸。预测的山羊PHLDA2蛋白分子量大小为15 638.7 Da,等电点为9.18,二级结构由α-螺旋(37.14%)、β-转角(9.29%)、延伸链(23.57%)和无规卷曲(30%)组成, 并且包含保守的PH（pleckstrin homology）结构域。③BLAST分析发现,山羊PHLDA2定位于29号染色体,其与牛、猪、猕猴、马和人同源基因核苷酸序列的相似性分别达到91%,90%,90%,90%和89%,在核苷酸和氨基酸序列上与牛的亲缘关系最近。④荧光定量PCR结果显示PHLDA2在山羊胎盘中表达量最高（P < 0.01),在心、肝、肺、肾、肌肉、脂肪、舌和大脑组织中表达量很低且差异不显著（P > 0.05), 在脾中未检测到表达。⑤印记分析表明,PHLDA2在初生山羊胎盘、心脏和肝脏组织表达母源等位基因,但在肺、大脑和肌肉组织为双等位基因表达。⑥PHLDA2表达水平与山羊胎盘重回归关系显著（n = 15,R²=0.855,P <0.01）。【结论】山羊PHLDA2基因序列和结构特征具有物种间的保守性,但是其印记状况具有组织特异性; PHLDA2为山羊胎盘的生长和功能调控的重要基因。     

小峰熊蜂可溶型海藻糖酶基因的克隆及表达分析

【目的】克隆小峰熊蜂（Bombus hypocrita）可溶型海藻糖酶基因（soluble trehalase,Tre-1）全长cDNA序列,预测该基因及其编码蛋白的理化性质,明确该基因在小峰熊蜂不同组织及不同发育时期的表达特性,为研究该基因在小峰熊蜂生长发育中的生物学功能奠定基础。【方法】根据地熊蜂（B. terrestris）和B. impatiens可溶型海藻糖酶基因Tre-1编码蛋白的保守区序列,利用Primer Premier 5.0设计简并引物扩增得到小峰熊蜂保守区片段;随后根据该片段设计基因特异性引物,用RACE方法获得5'端和3'端片段。在此基础上,根据RACE扩增所得片段和保守序列,预测开放阅读框（ORF）序列,分别在起始密码子近5'端和终止密码子的近3'端设计ORF区特异性引物扩增得到ORF,最后采用BioEdit软件比对、拼接获得小峰熊蜂Tre-1 cDNA全长序列。运用ExPASy、SignalP 4.1、NetOGlyc 1.0 sever、ClustalW和MEGA 5.0等软件对该基因进行生物信息学分析,并利用实时荧光定量PCR技术,采用2^-ΔΔCt方法检测不同组织及不同发育时期可溶型海藻糖酶基因的相对表达量。【结果】克隆所得基因cDNA全长为3 129 bp,命名为BhTre-1（GenBank登录号：KJ025078）,其中包含5'端441 bp非编码区和3'端945 bp非编码区,ORF为1 743 bp,共编码580个氨基酸。其编码的蛋白预测分子质量为67.16 kD,等电点为5.95;有1个信号肽结构（1-21位）,1个甘氨酸富集区（GGGGEY）,2个特色“标签序列”（PGGRFKEFYYWDSY和QWDFPNAWPP）,6个Asn-Xaa-Ser/Thr（N-X-S/T）序列,无跨膜区。序列分析发现BhTre-1氨基酸序列与地熊蜂BtTre-1和B. impatiens BiTre-1的一致性很高,分别为99%和98%,与西方蜜蜂（Apis mellifera）和云南小蜜蜂（A. florea）的Tre-1一致性也达到78%;系统发育分析也表明BhTre-1与BtTre-1、BiTre-1的亲缘关系最近,与AmTre-1、AfTre-1之间的亲缘关系次之。基因定量分析结果显示BhTre-1在成虫被检测的各组织中均有表达,在中肠的表达量最高,其次是马氏管,其他各组织表达量较低。成年工蜂的BhTre-1表达量高于幼虫和蛹,工蜂出房后随着龄期的增加表达量呈现先升高后降低的规律,在第15天表达量最高。【结论】克隆得到了BhTre-1全长cDNA序列,其分子生物学特性与其他昆虫Tre-1相似,该基因在小峰熊蜂中肠表达量最高,此外,幼虫和蛹的表达量低于成年工蜂,工蜂出房后表达量呈现先升高后降低的趋势,为进一步研究该基因在小峰熊蜂体内的生物学功能奠定了基础。     

家蚕感染质型多角体病毒相关基因Arylphorin的克隆与鉴定

【目的】克隆家蚕Arylphorin的cDNA全长序列,利用生物信息学对该序列进行分析,检测该基因在家蚕感染质型多角体病毒（Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus, BmCPV）后的表达量变化模式,为进一步研究其生物学功能奠定基础。【方法】以家蚕中肠总RNA为模板反转录合成cDNA,利用cDNA末端快速扩增（RACE）技术克隆家蚕Arylphorin的全长cDNA;通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析其组织表达模式和在家蚕感染BmCPV后的表达差异。【结果】克隆得到了家蚕Arylphorin的全长cDNA（命名为BmAryl）,在GenBank登录号为JN581664。该基因的cDNA全长为2 260 bp,包含1个26 bp 5′非翻译区和1个143 bp的3′非翻译区,3′非翻译区包含有终止密码子、多聚腺嘌呤信号AATAAA和poly(A)尾。其最大开放阅读框（ORF）为2 091 bp,编码的蛋白由696个氨基酸组成,预测蛋白分子量为82.8 kD,等电点为6.07。多序列比对和系统进化分析发现,家蚕BmAryl蛋白与家蚕的性别专一贮藏蛋白2相似性最高,为66%。BmAryl主要在家蚕的脂肪体和血淋巴中表达,精巢和卵巢中的表达量无明显差别;而在家蚕感染BmCPV后该基因在中肠的表达量明显下调。【结论】成功克隆获得BmAryl的全长cDNA,其编码的蛋白质属于芳香蛋白家族, BmAryl主要在家蚕的脂肪体和血淋巴中表达,不存在性别专一性,且家蚕感染BmCPV后BmAryl在中肠的表达明显下调。     

中华稻蝗几丁质酶基因10（OcCht10）的分子特性及功能

【目的】获得中华稻蝗（Oxya chinensis）几丁质酶基因10（OcCht10）的cDNA序列,预测其功能域,并做聚类分析明确该基因的系统发育关系。绘制OcCht10在5龄若虫不同组织部位和发育时间的表达图谱,研究其在中华稻蝗蜕皮过程中的生物学功能,为害虫防治提供高效安全的候选基因。【方法】从中华稻蝗转录组数据库搜索OcCht10 cDNA片段,经过blast分析、比对、拼接后,翻译为氨基酸序列,预测其功能域,并与其他昆虫几丁质酶家族基因进行聚类分析,进一步确认该基因的系统发育关系并进行准确命名;选取中华稻蝗5龄第6天不同组织部位及5龄若虫不同天数表皮样本,总RNA提取后反转录为cDNA模板,采用Real-time quantitative PCR（qPCR）方法获得OcCht10在5龄稻蝗若虫不同组织部位和不同发育阶段的表达谱;设计OcCht10 dsRNA引物,用试剂盒体外合成dsOcCht10,采用注射法进行RNA干扰;取注射24 h稻蝗表皮样本,用qPCR方法检测OcCht10基因沉默效率;并仔细观察dsRNA注射后稻蝗表型,统计其死亡率。【结果】经对中华稻蝗转录组数据库的搜索,获得OcCht10 cDNA片段长度为9 318 bp,开放阅读框为8 613 bp,编码2 870个氨基酸;其3′非编码区为705 bp,推测OcCht10 5'端有500多碱基尚未获得;预测其氨基酸序列具有多个结构域,包含有5个几丁质酶催化域和6个几丁质结合域;与其他昆虫几丁质酶基因聚类分析结果显示OcCht10属于昆虫几丁质酶家族基因Ⅱ组,该组基因与昆虫蜕皮相关;5龄若虫组织特异性分析表明该基因主要在表皮、前肠和后肠等外胚层发育而成的组织器官中表达,提示OcCht10可能参与表皮几丁质代谢;发育时间表达图谱表明该基因在5龄第6-7天,即蜕皮前的表皮中高表达,表明OcCht10可能负责蜕皮时表皮几丁质降解;5龄若虫第2天注射该基因的dsRNA,24 h后取表皮检测其干扰效率,结果显示该基因被沉默70%;与注射dsGFP的对照组相比,注射dsOcCht10 5龄若虫表现为龄期延长,旧表皮无法开裂,蜕皮受阻,昆虫无法正常活动导致死亡,死亡率达到100%。【结论】获得OcCht10的部分cDNA序列,该基因在昆虫蜕皮前表皮中高表达;OcCht10参与中华稻蝗的蜕皮发育,注射dsOcCht10可有效沉默靶基因,并导致试虫无法完成正常蜕皮而死亡。     

微红新月蕨的杀虫活性和活性组分的分离及鉴定

【目的】研究微红新月蕨（Pronephrium megacuspe）的杀虫成分并对其进行分离、鉴定。【方法】通过生物活性测定确定微红新月蕨提取物对几种害虫的杀虫活性及其作用方式,并在活性跟踪的基础上,通过萃取、柱层析、薄层层析制备、重结晶、核磁共振和质谱等方法对活性组分进行分离和鉴定。【结果】微红新月蕨甲醇提取物对家蝇成虫（Musca domestica）、白纹伊蚊4龄幼虫（Aedes albopictus）、桃蚜（Myzus persicae）具有较好的毒杀活性,对小菜蛾（Plutella xylostella）、亚洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）和菜粉蝶（Pieris rapae）3龄幼虫具有拒食活性。从微红新月蕨甲醇提取物中分离和鉴定了4种化合物,即7-羟基-5-甲氧基-6,8-二甲基黄烷酮、2',4'-二羟基-3'-甲基-6'-甲氧基查尔酮、5,7-二羟基-6,8-二甲基黄烷酮和5-羟基-6,7-二甲氧基黄酮。上述4种化合物在50 mg•L-1的浓度下,对亚洲玉米螟3龄幼虫都具有拒食活性;5,7-二羟基-6,8-二甲基黄烷酮对小菜蛾3龄幼虫具有较弱的拒食活性,24 h的平均拒食率为40.51%,另外3种化合物对小菜蛾3龄幼虫没有拒食活性;2 ?g/头的剂量下,这4种化合物对亚洲玉米螟3龄幼虫没有触杀活性,24和48 h的平均死亡率为0;1 ?g/头的剂量下,5,7-二羟基-6,8-二甲基黄烷酮对小菜蛾3龄幼虫48 h的平均死亡率为33.76%,另外3种化合物对小菜蛾3龄幼虫也基本没有触杀活性。【结论】微红新月蕨甲醇提取物对多种害虫具有较高的活性,从该植物中已分离鉴定出的4种化合物母体结构一致,但取代基不同或取代的位置不同,其活性也有明显的差异。因此,微红新月蕨中其它化学成分及其构效关系值得深入的研究。     

库尔勒香梨PsiERF基因的克隆和表达分析

【目的】筛选克隆库尔勒香梨萼片脱落与宿存的相关基因,研究其在脱萼样品与宿萼样品中表达。【方法】 以库尔勒香梨脱萼和宿萼花器官转录组测序数据为基础,从Unigenes中选出一条转录组和数字表达谱测序结果共有的与萼片脱落宿存相关的具有AP2/ERF结构域的差异基因,命名为PsiERF,对其进行生物信息学分析,通过实时荧光定量PCR分析其在花期不同阶段不同器官中的表达量。【结果】PsiERF cDNA序列的长度是1 195 bp,包含一个编码264个氨基酸长度为795 bp的开放阅读框(ORF),一个123 bp的5'端非编码区和一个277 bp的3'端非编码区。库尔勒香梨的PsiERF的核酸与氨基酸序列与其他植物的ERF109基因具有高度的同源性。实时荧光定量结果显示,其在全花样本中,宿萼组全花样品表达量在所有时期均高于脱萼组全花样品,而在宿萼组样品末花期萼片表达量极显著高于子房。【结论】筛选、克隆并鉴定一个新的库尔勒香梨PsiERF基因,该基因属于AP2/ERF家族中的ERF亚家族,与库尔勒香梨的萼片宿存脱落存在密切关系。     

越橘VcANS基因的克隆及表达分析

【目的】从越橘果实中克隆花色素合成酶（ANS）基因cDNA,为研究越橘花色素苷合成的分子机制奠定基础。【方法】以越橘（Vaccinium spp.）品种“北陆”（V.corymbosum L.）为试材,并以Illumina测序文库（NCBI登录号：SRA046311）中差异表达的Unigene 38125片段为基础,利用cDNA末端快速扩增（RACE）技术获得花色素合成酶基因全长cDNA,利用DNAMAN和MEGA软件进行多序列比对和系统进化分析,探讨ANS基因在不同组织和器官中的相对表达量及其与对应花色素苷含量的关系。【结果】成功克隆了越橘花色素合成酶基因序列,命名为VcANS,GenBank登录号为JN654701。序列分析结果表明,VcANS全长1 424 bp,包含93 bp的5′非编码区、248 bp的3′非编码区和1个长度为1 083 bp编码360个氨基酸的开放阅读框,该基因编码的蛋白具有ANS家族普遍存在的2酮戊二酸和Fe²⁺依赖的氧化酶超家族的保守结构域。序列比对和系统进化分析表明,VcANS与杜鹃花科植物亲缘关系最近。在越橘果实发育的不同阶段,VcANS相对表达量的变化与花色素苷含量的变化趋势具有一致性。【结论】获得了越橘花色素合成酶基因全长,推测其对越橘花色素苷的形成起调控作用。