基于高通量测序的技术检测梨树病毒

【目的】 研究运用基于高通量测序的技术检测梨树病毒,为梨树病毒的检测提供新方法。【方法】 于2014年、2017年、2018年4月中旬采集库尔勒香梨花朵若干,分别进行转录组测序,将得到的序列经过转录本拼接、层次聚类和基因功能注释,筛选出注释为植物病毒的序列作为候选病毒序列。利用RT-PCR方法检测随机采集的香梨枝条样品,验证高通量测序结果的可靠性。【结果】 根据3组转录组测序数据的生物信息学分析结果,分别对注释为来源于植物病毒的66、202和921条基因序列进行分析。3种梨树中已报道的病毒,分别是苹果茎痘病毒、苹果茎沟病毒和苹果褪绿叶斑病毒,以及梨树中未报道的芸薹黄化病毒。采用设计的特异性引物,通过RT-PCR技术对筛选出的4种病毒进行扩增验证,结果扩增出苹果茎痘病毒和苹果茎沟病毒的目的片段。【结论】 高通量测序技术可作为检测梨树病毒的一种快速、有效手段。     

‘库尔勒香梨’miR159家族成员进化特性及表达分析

【目的】了解‘库尔勒香梨’miR159家族成员的进化特征及其在萼片脱落与宿存中的作用。【方法】以‘库尔勒香梨’Small RNA高通量测序中获得的miR159家族前体序列和成熟体序列为基础进行系统发育树构建、前体和成熟体的序列比对、前体二级结构预测、WebLogo保守性分析、靶基因预测和表达量分析。【结果】‘库尔勒香梨’miR159家族存在2个前体成员(psi-MIR159a、psi-MIR159c)和2个成熟体成员(psi-miR159a、psi-miR159c)。2个前体成员的序列均能形成典型稳定的茎环结构,且序列完全一致,它们的最小折叠自由能(dG)都为-93.95 kal·mol~(-1)。系统发育进化树显示,‘库尔勒香梨’和苹果MIR159家族亲缘关系很近。WebLogo分析表明,miR159家族成熟体的保守性很高,其保守序列为5'-UUUGGAUUGAAGGGAGCUCUAUU-3',但‘库尔勒香梨’的碱基保守性较低。靶基因预测显示,‘库尔勒香梨’miR159基因家族靶基因为转录因子bHLH91、BES1/BZR1同源蛋白4、热激70 ku蛋白质、Trihelix转录因子GT-1、G型凝集素S-受体类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶RLK1等。实时荧光定量PCR(qPCR)显示,‘库尔勒香梨’miR159家族的2个成员在初花期、盛花期和末花期3个时期萼片脱落组和宿存组的表达量有显著差异。【结论】‘库尔勒香梨’miR159家族在进化过程中既有保守性又有多样性,可能在萼片脱落过程中起作用。     

库尔勒香梨9个新miRNA克隆鉴定

利用在小RNA高通量测序试验中筛选出的脱萼组与宿萼组差异表达新miRNA基因,采用 Stem-loop法对总体表达量居前20位、在脱萼组和宿萼组中具有显著性差异表达、在子房和萼片组织中具有显著性差异表达的新miRNA进行成熟体的克隆鉴定、前体序列二级结构分析、qRT-PCR试验以及靶基因预测。结果显示,在不同的样本中有9个新miRNA（novel_miRNA）的成熟体序列以及4个novel_miRNA的表达量与高通量测序结果完全一致,并且预测得到大量具有生物学功能的靶基因。新发现的miRNA可能与‘库尔勒香梨’萼片脱落和宿存有密切关系。     

库尔勒香梨PsiERF基因的克隆和表达分析

【目的】筛选克隆库尔勒香梨萼片脱落与宿存的相关基因,研究其在脱萼样品与宿萼样品中表达。【方法】 以库尔勒香梨脱萼和宿萼花器官转录组测序数据为基础,从Unigenes中选出一条转录组和数字表达谱测序结果共有的与萼片脱落宿存相关的具有AP2/ERF结构域的差异基因,命名为PsiERF,对其进行生物信息学分析,通过实时荧光定量PCR分析其在花期不同阶段不同器官中的表达量。【结果】PsiERF cDNA序列的长度是1 195 bp,包含一个编码264个氨基酸长度为795 bp的开放阅读框(ORF),一个123 bp的5'端非编码区和一个277 bp的3'端非编码区。库尔勒香梨的PsiERF的核酸与氨基酸序列与其他植物的ERF109基因具有高度的同源性。实时荧光定量结果显示,其在全花样本中,宿萼组全花样品表达量在所有时期均高于脱萼组全花样品,而在宿萼组样品末花期萼片表达量极显著高于子房。【结论】筛选、克隆并鉴定一个新的库尔勒香梨PsiERF基因,该基因属于AP2/ERF家族中的ERF亚家族,与库尔勒香梨的萼片宿存脱落存在密切关系。     

核桃ARF基因家族的鉴定及生物信息学分析

生长素响应因子(auxin response factor, ARF)是一类在植物生长发育过程中起着关键作用的转录调控因子。基于核桃(Juglans reiga)基因组数据库，本研究利用生物信息学方法，在全基因组水平上利用HMMER 3.0和BLAST软件对核桃ARF基因家族成员进行鉴定，共鉴定到了30个核桃ARF基因，其编码蛋白的长度在596～1 124 aa之间，蛋白分子量介于65 447.51～125 471.08 Da之间，等电点在5.27～8.31之间，均定位于细胞核。系统进化树分析，将其分为4个亚组(ClassⅠ～ClassⅣ)，同一亚组成员通常表现出相似的基因结构和保守结构域。保守结构域分析显示，30个JrARF蛋白均具有保守的B3、Aux＿resp结构域，大部分蛋白含有Aux/IAA结构域。这些基因不均匀地分布于核桃的15个染色体上。启动子顺式作用元件表明，该家族成员与众多光响应元件及逆境响应、激素应答等响应元件相关。利用转录组数据分析了ARF家族成员在核桃雌雄花芽分化过程中的表达模式，结果表明JrARF1、JrARF5、JrARF17等在雌花芽形态分化始期(FB-2)...