桃蚜电压门控钠离子通道基因cDNA克隆及其生物信息学分析

克隆获得桃蚜电压门控钠离子通道基因cDNA序列，明确钠离子通道的典型特征，为研究桃蚜抗性分子机理奠定基础。采用实验技术主要有RT-PCR和PCR，克隆桃蚜钠离子通道基因cDNA序列，利用相关软件对其序列进行生物信息学分析。克隆得到两段cDNA序列MpNa_v-1（NCBI登录号：MN124170）和MpNa_v-2（NCBI登录号：MN176136）。MpNa_v-1长度为2945 bp，包括2877 bp的完整开放阅读框，共编码958个氨基酸；MpNa_v-2长度为3546 bp，包括3486 bp的完整开放阅读框，共编码1161个氨基酸。MpNa_v-1和MpNa_v-2共同组成桃蚜的钠离子通道α亚基，MpNa_v-1包含同源结构域Ⅰ和同源结构域Ⅱ，MpNa_v-2包含同源结构域Ⅲ和同源结构域Ⅳ。同源比对发现，桃蚜与豌豆蚜和高粱蚜钠离子通道基因相似度分别高达97.67%和97.65%，所克隆序列包含昆虫钠离子通道α亚基典型特征，具有MFM模块，并含有蚜虫类钠通道特有模块DENS。成功地克隆桃蚜钠离子通道基因，为阐明其对拟除虫菊酯类药剂产生靶标抗性的分子机制奠定基础。     

麦长管蚜电压门控钠离子通道基因克隆及序列分析

克隆获得麦长管蚜电压门控钠离子通道基因cDNA序列，明确其典型特征，为研究麦长管蚜抗性分子机理奠定基础。采用RT-PCR技术，克隆麦长管蚜钠离子通道基因cDNA序列，利用DNASTAR Lasergene 7.10软件对其序列进行分析。克隆得到两条cDNA序列SaNa_v1和SaNa_v2（GenBank登录号分别为MN176137和MN161584），SaNa_v1序列长3423 bp，共编码1141个氨基酸；SaNa_v2序列长2874 bp，共编码958个氨基酸。同源比对发现，SaNav1与禾谷缢管蚜和桃蚜的第一部分钠离子通道基因相似度分别高达97.81%和97.91%；SaNav2与禾谷缢管蚜和桃蚜的第二部分钠离子通道基因相似性高达97.90%和96.43%。所克隆序列包含4个同源结构域，每个结构域6个跨膜片段（S1～S6），存在钠通道选择性关键残基“DENS”。本文成功克隆了麦长管蚜中钠离子通道基因，为麦长管蚜钠离子通道抗性机制的研究提供依据。     

苹果蠹蛾瞬时感受器离子通道基因的克隆及温度胁迫表达分析

瞬时感受器离子通道(transient receptor potential,TRP)是影响昆虫温度感知系统的关键组成。为探讨苹果蠹蛾温度感知和温度适应的机理,本研究以苹果蠹蛾Cydia pomonella为研究对象,通过分子克隆获得TRPA家族中的CpPainless和CpWater_witch基因,进行生物信息学分析,并利用实时荧光定量PCR技术分析靶基因在高低温胁迫后的表达。结果表明,CpPainless基因编码938个氨基酸,N端有8个锚蛋白重复序列。CpWater_witch基因编码980个氨基酸,N端有10个锚蛋白重复序列,二者编码产物均有6个跨膜结构,具瞬时感受器离子通道家族成员结构典型特征。表达分析结果显示,和对照26℃相比,高低温胁迫1 h后,CpPainless在5龄幼虫雌虫体内的表达量显著下调,而5龄幼虫雄虫经低温胁迫1 h后CpPainless表达量显著上调,但高温胁迫1 h后表达差异不显著;CpWater_witch在雌雄虫体内均没有显著变化。研究结果为研究瞬时感受器离子通道在苹果蠹蛾温度感知中的作用奠定基础。     

小麦丙氨酸氨基转移酶基因TaAlaAT1的克隆及表达特征分析

 在已构建的受条锈菌(Puccinia striiformis f.sp.tritici)诱导的小麦非亲和抑制差减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)文库中,筛选到1个与水稻丙氨酸氨基转移酶基因高度相似的表达序列标签(expressed sequence tag,EST),利用电子克隆与RT-PCR相结合的方法,从小麦中获得1个1563bp的cDNA序列,命名为TaAlaAT1。序列分析表明,TaAlaAT1包含1个完整的开放阅读框,长1440bp,推测编码479个氨基酸。该氨基酸序列具有氨基转移酶的保守特征,与水稻、葡萄、大豆、拟南芥、苜蓿等多种植物的丙氨酸氨基转移酶高度相似,其中与水稻的亲缘关系最近。半定量RT-PCR与实时定量PCR结果显示,TaAlaAT1在小麦与条锈菌互作的非亲和组合中总体呈上调表达,在亲和组合中呈下调表达,且在2个组合中的表达差异显著。推测TaAlaAT1参与了小麦对条锈菌的防御反应。     

粘虫过氧化物酶MsPOD基因的克隆及不同温度胁迫的诱导效应

过氧化物酶（POD）是昆虫体内一种很关键的抗氧化酶，在维持昆虫体内氧化还原的动态平衡及保护昆虫免受氧化损伤方面起到重要的作用。本试验通过转录组测序方法获得一条粘虫过氧化物酶基因的cDNA序列，该序列命名为MsPOD（GenBank登录号：MH606240）。该序列全长2433 bp，开放阅读框长度为2061 bp，编码686个氨基酸组成的多肽，分子量约76.1 ku，等电点5.68，具有1个标志性的动物亚铁血红素过氧化物酶细胞粘附蛋白结构域。氨基酸序列比对表明，MsPOD的氨基酸序列与鳞翅目夜蛾科其他昆虫亲缘关系较近，其中与棉铃虫POD氨基酸序列同源性最高，达92%。基因表达水平研究发现，MsPOD基因在不同发育阶段和不同组织中差异表达，在蛹期和唾腺中表达量最高。温度梯度诱导后，MsPOD基因在不同时间点的表达量具有显著差异，经35℃下12 h处理后表达量最高。研究结果为进一步研究过氧化物酶在昆虫体内的保护性作用以及利用该基因进行分子设计来防治粘虫奠定理论基础。     

拟果蝇钠离子通道基因克隆及其生物信息学分析

本文采用RT-PCR技术克隆获得了拟果蝇Drosophila simulans电压门控钠离子通道基因序列,明确其典型特征,分析了进化关系,为拟果蝇抗性分子机理研究奠定基础。克隆得到拟果蝇钠离子通道开放阅读框（GenBank登录号为MT113357）,长为6270 bp,编码2090个氨基酸。通过生物信息学分析,发现拟果蝇与黑腹果蝇Drosophila melanogaster钠离子通道基因相似度高达96.86%,与家蝇Musca domestica钠离子通道基因相似度达88.75%,在进化起源上与双翅目果蝇属昆虫有极高的相似度。所克隆出的序列符合昆虫钠离子通道的基本特征,具有DEKA模块和疏水性失活闸门MFM。获得三个选择性剪接（i、a、b）和17个RNA编辑。本文成功克隆拟果蝇钠离子通道基因,对拟果蝇钠离子通道基因进行分析,为研究其抗性机理奠定基础,为农业生产新型药剂的开发提供了新思路。     

小菜蛾鱼尼丁受体基因克隆及序列分析

利用RT-PCR和RACE技术克隆了小菜蛾(Plutella xylostella)鱼尼丁受体(Px-RyR)基因,其核苷酸序列全长15 748bp,5′非编码区267bp,3′端非编码区109bp,开放阅读区全长为15 372bp(GenBank登录号:JF927788),编码5 123个氨基酸残基。估测其蛋白分子量为579.39ku,等电点为5.45。该基因编码氨基酸序列和其他鳞翅目昆虫RyR氨基酸序列比对相似性较高(92%),与哺乳动物3种亚型RyRs的相似性为45%～47%。此外,二级结构预测,其C-末端存在6个跨膜区域;且Px-RyR中存在一个出现4次重复,长度为89～95个氨基酸的RyR结构域,平均相似性为33%。     

小菜蛾GluCl受体α亚基cDNA基因克隆和序列分析

利用RT-PCR和RACE技术对小菜蛾[Plutella xylostella(L.)]4龄幼虫谷氨酸门控的氯离子通道(GluCl)受体cDNA全长进行了克隆和序列分析。通过设计简并性上、下游引物扩增出小菜蛾GluCl受体α亚基基因192bp的cDNA片段,根据得到的片段序列设计3′和5′特异性引物采用RACE技术进行3′和5′末端的克隆,获得了小菜蛾GluCl受体的cDNA的完整序列,GenBank登录号为GQ221939。该基因全长2144bp,其开放阅读框(ORF)1344bp,编码447个氨基酸。相似性分析表明:它与果蝇和赤拟谷盗的相似性均为73%,与埃及伊蚊的相似性为75%,与东亚飞蝗的相似性为79%;氨基酸分析后显示它具有GluClα亚基的典型特征,表明克隆的cDNA序列是小菜蛾GluClα亚基基因的序列。     

棉铃虫表皮蛋白基因的克隆、序列及表达分析

昆虫表皮蛋白能帮助昆虫抵御外界不良环境,在昆虫的生长发育中起重要作用。基于棉铃虫Helicoverpa armigera（Hübner）转录组数据信息克隆获得表皮蛋白基因的cDNA序列,通过Real-time PCR探讨棉铃虫各龄期和组织表皮蛋白的相对表达量。在棉铃虫体内得到HACPFL67 cDNA开放阅读框（KP072002）612 bp,命名为HACPFL67,编码204个氨基酸,分子量约为20.892 kDa,等电点7.275,序列包含有表皮蛋白的保守序列,与鳞翅目夜蛾科昆虫烟芽夜蛾Heliothis virescens和斜纹夜蛾Spodoptera litura等亲缘关系较近,与烟芽夜蛾氨基酸序列相似性高达83%。棉铃虫HACPFL67在不同发育阶段和组织中表达存在很大差异,其中4龄幼虫在各个发育阶段表达最高。综上所述,棉铃虫HACPFL67相对表达量在不同组织和发育时期存在一定差异。     

双委夜蛾非典型嗅觉受体Orco的克隆、分子特征及表达

为了解新发现的农业害虫双委夜蛾Athetis dissimilis(Hampson)非典型嗅觉受体Orco的分子特征与表达,通过分析转录组数据并利用RT-PCR技术克隆了双委夜蛾Orco基因,并采用实时定量PCR技术研究了该基因的组织表达谱。结果显示,双委夜蛾非典型嗅觉受体Orco基因开放阅读框全长1 422 bp,编码473个氨基酸,经氨基酸结构预测具有7个跨膜区,N端在膜内,C端在膜外;该基因编码的氨基酸序列与其它昆虫Orco序列相似性极高,因此将该基因命名为Adis Orco(Gen Bank登录号:KR632987),此氨基酸序列C末端第6跨膜区和第7跨膜区之间以及第7跨膜区的序列保守性最高;PCR结果显示,Adis Orco主要在成虫触角中表达,且在雄蛾触角中的表达量是雌蛾触角中的4.2倍,在足、翅、下唇须和喙等组织中也有少量表达。     

黄绿绿僵菌与反式茴香脑的相容性及其对菜青虫的联合毒力

为了明确植物次生代谢产物反式茴香脑与高毒力昆虫病原真菌黄绿绿僵菌Mf82菌株的相容性以及其对菜青虫的联合毒力，本文在室内评价了半致死浓度（LC₅₀）反式茴香脑与黄绿绿僵菌Mf82不同浓度孢子悬浮液以不同体积比混合后对菌株生长的影响，并测定了菌药联合使用对2龄菜青虫的毒杀效果。结果表明，黄绿绿僵菌与反式茴香脑对菜青虫均有良好的毒杀活性；反式茴香脑LC₅₀剂量与黄绿绿僵菌Mf82混合对菌株的菌落生长有一定促进作用，两者以体积比5:5、4:6和3:7处理后明显促进菌丝生长，且随着反式茴香脑在混剂中所占比例增大促进作用增强，孢子萌发率也比两者以2:8和1:9混合后的孢子萌发率高；混剂对菜青虫的致死率随二者混合比例的不同而变化，其中反式茴香脑LC₅₀分别与孢子悬浮液（1.5×10⁴～1.5×10⁸孢子/mL）以体积比5:5、4:6和3:7混合处理试虫的死亡率高于两者以2:8和1:9混合处理的死亡率，共毒系数分别为287、108和83，表明具增效与相加作用；以体积比5:5、4:6和3:7混合处理的致死中时（LT₅₀）也比单用黄绿绿僵菌的短。因此，在防治菜青虫时应选择相容性好、共毒系数高的混合比例，即5:5、4:6或3:7。黄绿绿僵菌和反式茴香脑联合应用对菜青虫的高毒力表明其具有开发成生物制剂用于对害虫进行高效安全绿色防控的潜力。     

长蒴母草黄脉病毒——一个双生病毒的新种

 从采集于海南儋州地区表现黄脉症状的长蒴母草(Lindernia anagallis)上分离到病毒分离物L2, DNA-A全序列分析结果表明, 全长2739个核苷酸(nt)(GenBank登录号:AY795900), 共编码6个ORF, 其中病毒链编码AV1(CP)、AV2, 互补链编码AC1、AC2、AC3、AC4。利用BLAST程序对DNA-A进行分析表明, 与L2 DNA-A有同源关系的病毒均为双生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色黄花叶病毒属(Begomovirus)成员。进一步比较发现, L2 DNA-A与我国广东报道的广东番茄曲叶病毒(Tomato leaf curl Guangdong virus, ToLCGuV)(AY602165)全基因组核苷酸序列的同源性最近, 仅为77.0%, 说明L2为Begomovirus中的一个新种, 命名为长蒴母草黄脉病毒(Lindernia anagallis yellow vein virus, LAYVV)。与L2的IR区及各基因编码的氨基酸序列有最高同源性的病毒均来源于亚洲。利用DNA-B特异引物和DNA-β的特异引物, 均未检测到DNA-B和卫星DNA-β的存在。     

甘蔗黄叶病毒复制酶基因的克隆及序列分析

 The gene of RNA-dependent RNA polymerase (RdRP) was cloned by RT-PCR from Sugarcane yellow leaf virus-Fuzhou isolate (CHN-FJ1) and then cloned into pMD18-T vector. The sequence showed that the fragment comprised 1 212 nucleotides including part gene of ORF1 and ORF2. The ORF2 was involved the RdRP gene consisted of 995 nucleotides and encoded putative protein of 331 amino acids. Compared the nucleo-tide sequence and encoded putative protein of CHN-FJ1 with the other isolates from different countries, they shared the homology above 92.0%. Phylogenetic tree suggested that the sixteen isolates were classified into four types according to the amino acid sequence of the RdRP. One of the groups contained CHN-FJ1 and the other isolates from China, American, Brazil, Australia and Colombia;however, there was the closest relation between CHN-FJ1 and BRA-YL1 isolate from Brazil.     

滞育七星瓢虫酰基辅酶AΔ11去饱和酶基因的克隆及表达分析

去饱和酶（Fatty acid desaturase,FAD）是生物体不饱和脂肪酸合成中的关键酶,酰基辅酶AΔ11去饱和酶基因是其中重要的一种。本试验基于七星瓢虫Coccinella septempunctata L.转录组数据,利用RT-PCR和RACE技术从滞育七星瓢虫中克隆得到酰基辅酶AΔ11去饱和酶基因全长,并命名为CsFadΔ11（GenBank登录号：MF458996）,该基因全长1447 bp,开放阅读框（ORF）1095 bp,编码364个氨基酸,预测蛋白质分子量为42.99 kD,等电点（pI）为8.87,无信号肽。氨基酸序列分析结果表明,CsFadΔ11有3个组氨酸富集区和6个跨膜结构域,与膜翅目的内华达古白蚁Zootermopsis nevadensis同源性较高。利用实时荧光定量PCR技术研究其时间表达模式,发现CsFadΔ11基因在七星瓢虫初羽化、滞育诱导10 d、滞育诱导20 d、滞育初期、滞育后期、滞育解除期以及正常发育状态下均有所表达,且在滞育早期表达量最高,其次是在滞育解除个体中。其整体表达趋势与相应时期脂积累变化情况基本相符,推测CsFadΔ11基因参与七星瓢虫脂积累调控,并进一步影响七星瓢虫滞育。     

重楼花叶坏死病毒侵染滇黄精的首次报道

<正>滇黄精(Polygonatum kingianum Coll. et Hemsl)为百合科(Liliaceae)黄精属(Polygonatum)多年生草本植物,属于药食两用资源^[1]。用于补气养阴、健脾、润肺、益肾,现代药理研究发现具有抗氧化、抗病毒、抗肿瘤等作用^[2-3]。近年滇黄精人工种植发展迅速,病虫害问题凸显。2019—2020年在云南曲靖、昆明滇黄精种植基地调查发现滇黄精表现花叶、褪绿、叶片皱缩、植株矮小等症状(图1-A),该病害田间发病较为普遍,不同地块发生率在5%～15%,一些地块出现集中发病现象。为明确病原种类,本研究利用透射电子显微镜观察、转录组测序、序列分析,对侵染滇黄精的病毒进行鉴定。     

大豆疫霉MAPK基因的鉴定与转录分析

 疫霉菌包括大豆疫霉等重要植物病原物,属于茸鞭生物界卵菌门,在进化上与真菌相差甚远;由于分离培养与遗传转化等相对困难,目前对其生长发育和致病机理的研究相对滞后。本研究综合运用基因组学和转录组学方法,首先对植物病原卵菌与真菌的蛋白激酶特别是MAPK进行了鉴定和比较,然后对大豆疫霉MAPK的基因结构、蛋白功能域以及转录模式等进行深入分析。结果表明,植物病原卵菌比真菌含有更多的蛋白激酶(包括MAPK),且卵菌及其近缘物种硅藻的MAPK与真菌在进化上相对独立;大豆疫霉的14个MAPK中,4个具有非典型的磷酸化唇序列,7个含有PH、C2、WW、PAS等与细胞信号转导相关的其它功能域;转录分析表明,大部分MAPK可能在大豆疫霉生长发育与致病的整个过程或特定过程中发挥重要作用。本文通过对蛋白激酶特别是MAPK的分析揭示了植物病原卵菌(与真菌相比)在细胞信号转导网络与机制上的独特性与复杂性,可为进一步研究疫霉菌MAPK的生物学功能及其信号调控机制提供参考。     

大麦条纹花叶病毒中国株三基因盒(TGB)序列对比分析

 The tripe gene block (TGB)genes of Barley stripe mosaic virus China strain (BSMV-CH)were amplified from cDNA of BSMV-CH RNAβ (GenBank accession No:AY789694)by PCR with special primer pairs, and cloned into pMD18-T vector for sequencing. Analysis of the sequences showed that the full length of BSMV-CH TGB1, TGB2 and TGB3 were 1 539, 396 and 468 bp, with deduced 512, 131 and 155 amino acids, respectively. BSMV-CH TGB1 shared 94.1%-95.4% nucleotide identities and 91.0%-94.5% amino acid identities with that of other BSMV strains, BSMV-CH TGB2 shared 96.5%-97.2% nucleotide identities and 98.5%-99.2% amino acid identities with that of other BSMV strains, and BSMV-CH TGB3 shared 95.7%-96.6% nucleotide identities and 94.2%-96.8% amino acid identities with that of other BSMV strains. Phylogenetic tree based on the amino acid of Hordeiviruses TGB genes showed that BSMV-CH was relatively closed to CV17 in genetic relationship. Therefore, BSMV-CH was deduced to be a recombined strain of CV17 and CV42.     

太子参蚕豆萎蔫病毒2号CP基因的遗传多样性及分子进化分析

为了解太子参蚕豆萎蔫病毒2(Broad bean wilt virus 2,BBWV2)的遗传多样性及分子进化关系,本研究对5个不同地理来源的6份太子参病叶样品进行了BBWV2外壳蛋白(coat protein,CP)基因的RT-PCR扩增和克隆。序列分析结果表明,所得13条太子参BBWV2 CP基因序列均为1 345 bp,其核苷酸序列同一性在81.0%~99.0%之间,氨基酸序列同一性在93.5%~99.3%之间;核苷酸多样性为0.084 00;存在280个核苷酸多态性位点,其中232个为地域特异性位点;总变异数为278个,其中同义突变29个,异义突变249个。不同地理来源的太子参BBWV2分离物之间遗传分化程度较高,基因交流不频繁,遗传漂变可能导致分离物间明显的遗传分化。在系统进化树中,太子参分离物的聚类呈现出明显的地域特异性,江苏、贵州、湖南、福建分离物均聚类在I-a亚组,而山东分离物聚类在II-c亚组,遗传距离较远。研究表明,太子参BBW V2存在很高的遗传变异,基因突变是其产生遗传多样性的主要驱动力,而地理因素与其具有较高的核苷酸多样性密切相关。