麦长管蚜电压门控钠离子通道基因克隆及序列分析

克隆获得麦长管蚜电压门控钠离子通道基因cDNA序列，明确其典型特征，为研究麦长管蚜抗性分子机理奠定基础。采用RT-PCR技术，克隆麦长管蚜钠离子通道基因cDNA序列，利用DNASTAR Lasergene 7.10软件对其序列进行分析。克隆得到两条cDNA序列SaNa_v1和SaNa_v2（GenBank登录号分别为MN176137和MN161584），SaNa_v1序列长3423 bp，共编码1141个氨基酸；SaNa_v2序列长2874 bp，共编码958个氨基酸。同源比对发现，SaNav1与禾谷缢管蚜和桃蚜的第一部分钠离子通道基因相似度分别高达97.81%和97.91%；SaNav2与禾谷缢管蚜和桃蚜的第二部分钠离子通道基因相似性高达97.90%和96.43%。所克隆序列包含4个同源结构域，每个结构域6个跨膜片段（S1～S6），存在钠通道选择性关键残基“DENS”。本文成功克隆了麦长管蚜中钠离子通道基因，为麦长管蚜钠离子通道抗性机制的研究提供依据。     

拟果蝇钠离子通道基因克隆及其生物信息学分析

本文采用RT-PCR技术克隆获得了拟果蝇Drosophila simulans电压门控钠离子通道基因序列,明确其典型特征,分析了进化关系,为拟果蝇抗性分子机理研究奠定基础。克隆得到拟果蝇钠离子通道开放阅读框（GenBank登录号为MT113357）,长为6270 bp,编码2090个氨基酸。通过生物信息学分析,发现拟果蝇与黑腹果蝇Drosophila melanogaster钠离子通道基因相似度高达96.86%,与家蝇Musca domestica钠离子通道基因相似度达88.75%,在进化起源上与双翅目果蝇属昆虫有极高的相似度。所克隆出的序列符合昆虫钠离子通道的基本特征,具有DEKA模块和疏水性失活闸门MFM。获得三个选择性剪接（i、a、b）和17个RNA编辑。本文成功克隆拟果蝇钠离子通道基因,对拟果蝇钠离子通道基因进行分析,为研究其抗性机理奠定基础,为农业生产新型药剂的开发提供了新思路。     

小菜蛾GluCl受体α亚基cDNA基因克隆和序列分析

利用RT-PCR和RACE技术对小菜蛾[Plutella xylostella(L.)]4龄幼虫谷氨酸门控的氯离子通道(GluCl)受体cDNA全长进行了克隆和序列分析。通过设计简并性上、下游引物扩增出小菜蛾GluCl受体α亚基基因192bp的cDNA片段,根据得到的片段序列设计3′和5′特异性引物采用RACE技术进行3′和5′末端的克隆,获得了小菜蛾GluCl受体的cDNA的完整序列,GenBank登录号为GQ221939。该基因全长2144bp,其开放阅读框(ORF)1344bp,编码447个氨基酸。相似性分析表明:它与果蝇和赤拟谷盗的相似性均为73%,与埃及伊蚊的相似性为75%,与东亚飞蝗的相似性为79%;氨基酸分析后显示它具有GluClα亚基的典型特征,表明克隆的cDNA序列是小菜蛾GluClα亚基基因的序列。     

不同温度对大豆蚜海藻糖合成酶基因表达及沉默效率研究

海藻糖是昆虫血淋巴中最重要的糖类物质，海藻糖合成酶（trehalose-6-phosphate synthase，TPS）是昆虫体内海藻糖合成途径的关键酶。本试验通过转录组测序获得一条大豆蚜Aphis glycines（Matsumura）海藻糖合成酶的cDNA序列，命名为AgTPS（GenBank登录号：MN068811）。cDNA序列全长4174 bp，包含一个长度为2559 bp的开放阅读框，编码852个氨基酸，等电点为5.98，分子质量为95.8 kDa，具有一个典型的TPS结构域。不同温度下AgTPS基因干扰结果显示：5℃时基因沉默持续时间最长，30℃处理6 h时该基因沉默效果最好，抑制率可达79.48%，且30℃干扰后对大豆蚜生存和繁殖影响最大。试验表明该基因参与大豆蚜抗逆过程，试验结果为利用RNA干扰技术防治大豆蚜提供理论依据。     

紫外线、高压静电和大麦黄矮病毒胁迫下荻草谷网蚜SOD基因表达

为探索环境胁迫影响昆虫适合度的内在机制，通过cDNA末端快速扩增（rapid amplification of c DNA end,RACE）技术克隆得到荻草谷网蚜Sitobion miscanthi体内超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）基因MnSOD和CuZnSOD的cDNA序列全长，对该序列进行分析，检测紫外线、高压静电和大麦黄矮病毒（barley yellow dwarf virus,BYDV）胁迫下荻草谷网蚜体内MnSOD和CuZnSOD基因表达量的变化。结果显示，荻草谷网蚜体内MnSOD和CuZnSOD基因的cDNA序列全长分别为1 517 bp和954 bp(GenBank登录号分别为MT533627和MT533626)，开放阅读框分别为669 bp和459 bp，分别编码222个和152个氨基酸，预测蛋白质相对分子量分别为24.99 kD和15.84 kD。荻草谷网蚜体内MnSOD和CuZnSOD蛋白均与半翅目蚜科昆虫同源蛋白氨基酸序列相似性高，亲缘关系最近。0.50 m W/cm2（低强度）和0.70 m W/cm2（高强度）紫外线胁迫下...     

菜粉蝶Pain离子通道基因的克隆和功能研究

通过克隆十字花科蔬菜重要害虫菜青虫Pieris rapae瞬时感受器电位通道中的Painless（Pain）基因，实现它的体外功能性表达，为进一步研究其在鳞翅目昆虫中的生理功能提供重要依据。根据菜青虫的转录组数据，采用RT-PCR克隆菜青虫Pain基因得到完整开放阅读框；利用哺乳动物表达系统在体外表达菜青虫Pain离子通道。鉴定出菜青虫Pain基因是GenBank登录号为NW_019093434.1的序列。其完成开放阅读框由2850个核苷酸组成，编码949个氨基酸。预测蛋白分子量为108.3 kDa，理论等电点pI为5.37。预测该基因所编码蛋白序列有2个结构域，分别是包含8个锚蛋白重复序列的锚蛋白结构域和6个跨膜区的跨膜结构域。氨基酸序列比对结果显示菜青虫Pain和家蚕、帝王蝶、小菜蛾以及烟草天蛾Pain的序列相似度都高达70%以上，但与黑腹果蝇Pain的序列相似度仅有31%。进化分析结果显示菜青虫Pain离子通道和小菜蛾以及帝王蝶的Pain离子通道的亲缘关系最近。体外钙流检测结果表明，菜青虫Pain离子通道可被43℃缓冲液激活，这说明菜青虫Pain离子通道可以感受高温。     

异色瓢虫乳酸脱氢酶基因的克隆与序列分析

乳酸脱氢酶（1acticdehydrogenase,LDH）是糖酵解途径的终止酶,在整个昆虫的发育阶段长期存在。本试验采用同源克隆和锚定PCR技术,从异色瓢虫Harmoniaaxyridis中克隆到HaxLDH基因的cDNA全序列（GenBank登录号HM362898）,全长1336bp,包含214bp的3’非编码区域和123bp的5,非编码区域,可读框长999bp,编码332个氨基酸。通过软件分析,预测该基因编码蛋白的分子量为36．2kD,理论等电点为8．62;包含1个糖基化位点,无信号肽序列和跨膜结构。同源比对不同昆虫的LDH基因cDNA序列,发现HaxLDH拥有8个非常保守的结构域：DLQHG、TAGV／ARQK／RE／DGES／TRL、LVQRN、GSGTNLD、SCHGW／YI／VI／VGEHGD、VWSG／AVNV／IAGV、AYEV／IIK／RLKGYTS／NWAI／VGLS和LSLP。HaxLDH与赤拟谷盗Triboliumcastaneum的LDH同源性最高,达67％;系统发育分析也表明二者亲缘关系较近。本研究为探讨LDH在昆虫发育和逆境中的作用奠定了基础。     

鲫鱼γ-氨基丁酸受体β_3亚基基因克隆及其分析

γ-氨基丁酸受体(GABAR)主要存在于脊椎动物和非脊椎动物的中枢神经系统(CNS),是氟虫腈、阿维菌素、硫丹和林丹等杀虫剂的作用靶标。为了阐明GABAR拮抗剂类农药影响鱼类安全性的分子作用机理,并研究其与农药分子的亲和作用,运用生物信息学方法,在NCBI基因组数据库中找到已经公布的同源的GABAARβ3亚基基因序列,通过多序列同源比对寻找高度保守区,再根据高度保守区设计特异性引物,通过RT PCR和RACE PCR技术,成功地克隆了鲫鱼GABAR A型β3亚基基因的全长cDNA序列(GenBank登录号:KC964110),该基因长2 767 bp,开放阅读框(ORF)为1 506 bp,编码502个氨基酸,与已知的其他物种β3亚基具有高度的保守性。应用qRT-PCR扩增,检测到该基因在鲫鱼不同组织器官的差异性表达。     

1个小麦NBS类抗病基因同源cDNA序列的克隆与鉴定

 利用cDNA末端快速扩增技术对小麦抗叶锈病近等基因系TcLr35中所获得的抗病基因同源片段S2A2 5'端和3'末端序列进行扩增,并根据拼接序列设计特异性引物,进行全长基因的扩增,获得了1个通读的NBS类抗病同源基因S2A2 cDNA序列,该序列全长为3476 bp,编码866个氨基酸序列。经BLASTp比较,该片段含有NB-ARC保守结构域和多个LRR结构域,与已知植物抗病基因I2C-1、L6、RPS2等相应区域相一致。半定量RT-PCR分析表明,该基因在小麦叶片中为低丰度组成型表达。本研究在TcLr35小麦中成功获得了抗病同源基因,这为最终克隆小麦抗叶锈病基因Lr35奠定了基础。     

西花蓟马FoccOBP3的分子克隆、序列分析及表达特征

鉴定昆虫嗅觉相关蛋白基因并对其序列和时空表达进行研究,可为阐明昆虫与寄主间的化学通讯机制提供依据。本文新克隆并鉴定获得一个西花蓟马OBP基因FoccOBP3（GenBank登录号：MT682352）,cDNA序列全长1226 bp,读码框全长432 bp,编码143个氨基酸残基。氨基酸序列中六个保守的半胱氨酸位点排列方式为C₁—X₂₆—C₂—X₃—C₃—X₃₇—C₄—X₁₀—C₅—X₈—C₆,完全符合典型气味结合蛋白所具有的六个保守的半胱氨酸位点结构模型。氨基酸序列中有5个亲脂性区域,其中第62～75位的氨基酸残基形成明显的亲脂性口袋。预测该蛋白分子量为15.50 kD,等电点为5.24,N—末端包含21个氨基酸组成的信号肽序列。FoccOBP3与横缝茧蜂Diachasma alloeum的DallGOBP（GenBank登录号为XP_015125081.1）、赤拟谷盗Tribolium castaneum 的TcasPBP（GenBank登录号为XP_015835846.1）和TcasOBP07（GenBank登录号为EFA04593.1）的氨基酸序列一致性较高。FoccOBP3与埋葬甲虫Nicrophorus vespilloides的NvesGOBP（GenBank登录号为XP_017781594.1）聚在最小的一个分支,表明与该基因亲缘关系最近。FoccOBP3蛋白含有组成α—螺旋的氨基酸残基127个,形成β—折叠的氨基酸残基58个,形成β—转角的氨基酸残基15个。FoccOBP3蛋白骨架是由 6 个α—螺旋和连接这些螺旋的回折构成,其中5个α—螺旋形成一个结合口袋。FoccOBP3在西花蓟马1龄若虫中高表达,其次是羽化5 d的雌虫,其余发育阶段的表达量均较低;且在雌、雄性成虫中的表达量亦有差异,除了羽化10 d的,羽化1、5、15 d雌虫的表达量均比同发育阶段雄虫的高。该基因在西花蓟马成虫触角中高表达,其次是头部,在腹、足中的表达较低,在胸部微表达。本研究克隆获得西花蓟马气味结合蛋白基因FoccOBP3,明确了其核苷酸、氨基酸序列特征,预测了该蛋白的二级、三维结构,测定了FoccOBP3在西花蓟马中的时空表达,推测该基因可能在西花蓟马气味识别、寄主定位等方面发挥重要作用。     

国槐凝集素基因的克隆及其功能

植物凝集素是一类能高度特异可逆结合到单糖或寡糖上的蛋白，含有至少一个非催化结构域，近年来在农作物抗虫工程中得到了广泛关注。本文从豆科植物国槐中克隆得到了一个新的凝集素基因SjLectin并初步研究了其对小菜蛾的抗性功能。从国槐幼叶中提取总RNA，采用RT-PCR法分离克隆出SjLectin基因的cDNA片段，该基因在GenBank中登录号为KC140286.1。SjLectin基因全长837 bp，编码279个氨基酸组成的蛋白。该蛋白与其他豆科凝集素的同源性均高达66%以上，属于豆科凝集素家族中的一员。在35S启动子控制下，利用根癌农杆菌介导法转化烟草品种W38，获得了该基因的抗卡那霉素植株。通过PCR和RT-PCR法筛选阳性转基因植株，证明SjLectin基因已经转化到烟草基因组中并在转录水平上得到了有效表达。接虫试验证明，阳性植株对小菜蛾的抑制率平均达62.2%。     

玉米衰老相关蛋白基因ZmSAP的克隆与表达分析

利用立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)诱导胁迫下玉米高耐纹枯病自交系幼苗叶片所构建的cDNA文库中获得的EST序列,通过电子克隆和RT-PCR方法,结合cDNA末端快速扩增技术,从玉米叶片中分离克隆到衰老相关蛋白基因的全长cDNA序列,命名为ZmSAP(GenBank登录号:GU253311)。序列分析表明,ZmSAP全长1156bp,包含一个完整的603bp的开放阅读框(ORF),具有连续的Poly A尾和典型的加尾信号AATTAA。ProtParam程序预测表明该基因编码200个氨基酸,相对分子量为21.92kD,等电点为10.38。该氨基酸序列与豌豆、挪威云杉、寄生藻等有不同程度的同源性且在不同物种间具有一个保守结构域,染色体定位发现该基因位于玉米第1条染色体上。荧光定量PCR分析表明,在高耐纹枯病自交系R15和高感纹枯病材料478中ZmSAP基因在病菌胁迫初期呈诱导表达,可能参与了病原菌诱导的细胞程序性死亡过程,说明该基因与纹枯病菌胁迫响应机制密切相关。     

滞育七星瓢虫酰基辅酶AΔ11去饱和酶基因的克隆及表达分析

去饱和酶（Fatty acid desaturase,FAD）是生物体不饱和脂肪酸合成中的关键酶,酰基辅酶AΔ11去饱和酶基因是其中重要的一种。本试验基于七星瓢虫Coccinella septempunctata L.转录组数据,利用RT-PCR和RACE技术从滞育七星瓢虫中克隆得到酰基辅酶AΔ11去饱和酶基因全长,并命名为CsFadΔ11（GenBank登录号：MF458996）,该基因全长1447 bp,开放阅读框（ORF）1095 bp,编码364个氨基酸,预测蛋白质分子量为42.99 kD,等电点（pI）为8.87,无信号肽。氨基酸序列分析结果表明,CsFadΔ11有3个组氨酸富集区和6个跨膜结构域,与膜翅目的内华达古白蚁Zootermopsis nevadensis同源性较高。利用实时荧光定量PCR技术研究其时间表达模式,发现CsFadΔ11基因在七星瓢虫初羽化、滞育诱导10 d、滞育诱导20 d、滞育初期、滞育后期、滞育解除期以及正常发育状态下均有所表达,且在滞育早期表达量最高,其次是在滞育解除个体中。其整体表达趋势与相应时期脂积累变化情况基本相符,推测CsFadΔ11基因参与七星瓢虫脂积累调控,并进一步影响七星瓢虫滞育。     

木贼镰刀菌的鉴定及其对桃蚜的致病性测定

从罹病桃蚜虫尸上分离到了一株昆虫病原真菌，命名为JMF-01，本文旨在确定该菌株分类地位并探索其生防潜能。对罹病的桃蚜虫尸进行分离纯化，基于形态学观察和rDNA-ITS、RPB2、IGS序列分析，构建系统发育树对该菌株进行鉴定。采用浸叶浸虫法研究该菌株不同浓度条件下对桃蚜的致病力并进行温室防效测定。结果表明菌株JMF-01在PDA培养基上5 d后菌落直径58～60 mm，分生孢子镰刀形，3～7隔。菌株JMF-01对桃蚜具有较强致病力，处理桃蚜在7 d后累计校正死亡率和LC₅₀达到85%和9.87×10⁵ cfu/mL；孢子悬浮液最高浓度的温室防效在14 d时高于70%。该菌株的rDNA-ITS序列（MW404610）与木贼镰刀菌Fusarium equiseti（GenBank登录号：JF773657）相似度达100%，位于系统发育树的同一分支；RPB2、IGS序列分别与木贼镰刀菌（GenBank登录号：MK077112，KX583611）的相似度也达到99%以上，聚在系统发育树的同一分支。菌株JMF-01经鉴定为桃蚜的病原真菌木贼镰刀菌，具有生防潜力。     

粘虫过氧化物酶MsPOD基因的克隆及不同温度胁迫的诱导效应

过氧化物酶（POD）是昆虫体内一种很关键的抗氧化酶，在维持昆虫体内氧化还原的动态平衡及保护昆虫免受氧化损伤方面起到重要的作用。本试验通过转录组测序方法获得一条粘虫过氧化物酶基因的cDNA序列，该序列命名为MsPOD（GenBank登录号：MH606240）。该序列全长2433 bp，开放阅读框长度为2061 bp，编码686个氨基酸组成的多肽，分子量约76.1 ku，等电点5.68，具有1个标志性的动物亚铁血红素过氧化物酶细胞粘附蛋白结构域。氨基酸序列比对表明，MsPOD的氨基酸序列与鳞翅目夜蛾科其他昆虫亲缘关系较近，其中与棉铃虫POD氨基酸序列同源性最高，达92%。基因表达水平研究发现，MsPOD基因在不同发育阶段和不同组织中差异表达，在蛹期和唾腺中表达量最高。温度梯度诱导后，MsPOD基因在不同时间点的表达量具有显著差异，经35℃下12 h处理后表达量最高。研究结果为进一步研究过氧化物酶在昆虫体内的保护性作用以及利用该基因进行分子设计来防治粘虫奠定理论基础。     

爪哇根结线虫Mj-1-1基因的克隆、鉴定及RNAi表型分析

根据爪哇根结线虫食道腺内表达的EST序列,结合反式剪接序列SL1,从爪哇根结线虫中克隆了一个假定寄生基因Mj-1-1(KU358725),该基因的c DNA全长为573 bp,包含450 bp的开放阅读框(ORF),编码149个氨基酸。DNA全长为740 bp,包含2个内含子,长度分别为20 bp和111 bp。NCBI BLASTn比对表明,Mj-1-1与南方根结线虫的M.incognita zk1236.5(JQ284068)基因相似性最高,为97%。原位杂交表明Mj-1-1基因在爪哇根结线虫的背食道腺中表达,qRT-PCR结果表明Mj-1-1基因在爪哇根结线虫寄生性3龄幼虫阶段表达量最高。对爪哇根结线虫侵染前2龄幼虫的Mj-1-1基因进行沉默,调查发现,沉默Mj-1-1后,爪哇根结线虫对番茄的侵染力显著下降,表明Mj-1-1对爪哇根结线虫侵染和寄生具有重要的调控作用。