桃蚜电压门控钠离子通道基因cDNA克隆及其生物信息学分析

克隆获得桃蚜电压门控钠离子通道基因cDNA序列，明确钠离子通道的典型特征，为研究桃蚜抗性分子机理奠定基础。采用实验技术主要有RT-PCR和PCR，克隆桃蚜钠离子通道基因cDNA序列，利用相关软件对其序列进行生物信息学分析。克隆得到两段cDNA序列MpNa_v-1（NCBI登录号：MN124170）和MpNa_v-2（NCBI登录号：MN176136）。MpNa_v-1长度为2945 bp，包括2877 bp的完整开放阅读框，共编码958个氨基酸；MpNa_v-2长度为3546 bp，包括3486 bp的完整开放阅读框，共编码1161个氨基酸。MpNa_v-1和MpNa_v-2共同组成桃蚜的钠离子通道α亚基，MpNa_v-1包含同源结构域Ⅰ和同源结构域Ⅱ，MpNa_v-2包含同源结构域Ⅲ和同源结构域Ⅳ。同源比对发现，桃蚜与豌豆蚜和高粱蚜钠离子通道基因相似度分别高达97.67%和97.65%，所克隆序列包含昆虫钠离子通道α亚基典型特征，具有MFM模块，并含有蚜虫类钠通道特有模块DENS。成功地克隆桃蚜钠离子通道基因，为阐明其对拟除虫菊酯类药剂产生靶标抗性的分子机制奠定基础。     

禾谷缢管蚜RpGST1基因的克隆、序列分析及原核表达

为揭示禾谷缢管蚜耐药性的分子机理,采用RT-PCR方法克隆了禾谷缢管蚜谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione S-transferases,GSTs)的cDNA序列,命名为RpGST1(GenBank登录号KP192850),并构建原核表达载体pET32-RpGST1,对RpGST1基因进行原核表达、SDS-PAGE和Western blotting检测。结果显示,禾谷缢管蚜RpGST1基因的编码区长651 bp,编码216个氨基酸,分子量约为24.06 kD,理论等电点为6.20;RpGST1基因在大肠杆菌中成功表达出一个分子量约为45 kD的融合蛋白,与预测的融合蛋白分子量大小一致。通过克隆RpGST1基因的cDNA序列并进行序列比对分析,表明构建了GST基因的原核表达载体并成功表达。     

模拟气候变暖对不同纬度带麦长管蚜和禾谷缢管蚜种群动态的影响

为明确气候变暖对不同纬度带麦田麦长管蚜Sitobion avenae和禾谷缢管蚜Rhopalosiphum padi种群动态的影响,在高纬度的河北省廊坊市(39°30′N,116°36′E)和相对低纬度的河南省原阳县(34°55′N,114°15′E)开展红外线辐射增温试验,调查廊坊市(+2.00℃)和原阳县(+1.18℃)2个试验点的增温处理小区和对照小区麦长管蚜和禾谷缢管蚜的种群动态,并计算其盛期发生比值。结果表明,增温使廊坊市试验点的麦长管蚜始见期、峰期分别提前21、7 d,使原阳县试验点的麦长管蚜始见期、峰期分别提前14、14 d;而禾谷缢管蚜的始见期和峰期仅在原阳县试验点提前31 d和7 d。增温使廊坊市试验点的麦长管蚜盛期蚜量、峰期蚜量分别显著增加了139.21%和77.83%,禾谷缢管蚜盛期蚜量和峰期蚜量分别显著增加了157.31%和130.16%;增温使原阳县试验点的麦长管蚜盛期蚜量、峰期蚜量分别显著增加了149.62%和176.52%,禾谷缢管蚜/麦长管蚜的盛期蚜量比值显著降低了43.21%。表明增温有利于高纬度地区(廊坊市)麦长管蚜和禾谷缢管蚜种群增长,而在低纬度地区(原阳县)仅有利于麦长管蚜种群增长。     

1个小麦NBS类抗病基因同源cDNA序列的克隆与鉴定

 利用cDNA末端快速扩增技术对小麦抗叶锈病近等基因系TcLr35中所获得的抗病基因同源片段S2A2 5'端和3'末端序列进行扩增,并根据拼接序列设计特异性引物,进行全长基因的扩增,获得了1个通读的NBS类抗病同源基因S2A2 cDNA序列,该序列全长为3476 bp,编码866个氨基酸序列。经BLASTp比较,该片段含有NB-ARC保守结构域和多个LRR结构域,与已知植物抗病基因I2C-1、L6、RPS2等相应区域相一致。半定量RT-PCR分析表明,该基因在小麦叶片中为低丰度组成型表达。本研究在TcLr35小麦中成功获得了抗病同源基因,这为最终克隆小麦抗叶锈病基因Lr35奠定了基础。     

拟果蝇钠离子通道基因克隆及其生物信息学分析

本文采用RT-PCR技术克隆获得了拟果蝇Drosophila simulans电压门控钠离子通道基因序列,明确其典型特征,分析了进化关系,为拟果蝇抗性分子机理研究奠定基础。克隆得到拟果蝇钠离子通道开放阅读框（GenBank登录号为MT113357）,长为6270 bp,编码2090个氨基酸。通过生物信息学分析,发现拟果蝇与黑腹果蝇Drosophila melanogaster钠离子通道基因相似度高达96.86%,与家蝇Musca domestica钠离子通道基因相似度达88.75%,在进化起源上与双翅目果蝇属昆虫有极高的相似度。所克隆出的序列符合昆虫钠离子通道的基本特征,具有DEKA模块和疏水性失活闸门MFM。获得三个选择性剪接（i、a、b）和17个RNA编辑。本文成功克隆拟果蝇钠离子通道基因,对拟果蝇钠离子通道基因进行分析,为研究其抗性机理奠定基础,为农业生产新型药剂的开发提供了新思路。     

博落回提取物对3种麦蚜的生物活性

采用浸渍法测定了博落回提取物（MCE）对不同龄期麦长管蚜、禾谷缢管蚜、麦二叉蚜的生物活性。结果显示,博落回提取物对不同龄期3种麦蚜均有一定杀虫活性,对麦长管蚜、禾谷缢管蚜、麦二叉蚜4龄有翅若蚜48 h致死中浓度LC50?分别为8.185 1、5.313 5、2.682 4 g/L,有翅成蚜48 h LC50?分别为8.575 0、6.614 7、0.590 4 g/L,毒力大小均为：麦二叉蚜＞禾谷缢管蚜＞麦长管蚜,麦二叉蚜对博落回提取物最敏感。研究结果为进一步开展博落回对麦蚜活性组分的分离纯化奠定了基础。     

大麦黄矮病毒PAV中国分离物外壳蛋白基因的克隆及同源性分析

 大麦黄矮病毒PAV株系由麦长管蚜和禾谷缢管蚜传毒。本研究通过RT-PCR、克隆和序列测定后,确认所得到的我国小麦PAV分离物的外壳蛋白基因片段由600个核苷酸组成,编码199个氨基酸。序列同源性比较结果显示,与BYDV的其它株系典型分离物的外壳蛋白基因同源性最高为74.5%,而与国外发表的PAV 8个分离物的CP基因核苷酸同源性为81%左右,且同源性比较的分值也较其它株系高。氨基酸序列的比较中,仅在46到60位氨基酸差别较大。     

禾谷缢管蚜水通道蛋白基因RpAQP1的克隆、分子特性和表达分析

为探究禾谷缢管蚜Rhopalosiphum padi (Linnaeus)水通道蛋白基因RpAQP1的序列特征及其在不同龄期的表达,利用RT-PCR和RACE技术克隆了RpAQP1基因的cDNA全序列,采用生物信息学软件分析了RpAQP1编码蛋白的特性,利用qRT-PCR分析了RpAQP1在不同龄期的表达量。结果显示:禾谷缢管蚜水通道蛋白基因RpAQP1的cDNA全长为1 216 bp,其750 bp的开放阅读框编码250个氨基酸,蛋白分子量为27.36 kD。RpAQP1属于水通道蛋白亚家族DRIP(果蝇内嵌蛋白Drosophila integral protein)的一员,具有6个跨膜区,2个保守的NPA结构单元和1个压缩区域Ar/R;qRT-PCR结果显示,RpAQP1在整个发育历期均有表达,其在2龄若蚜中表达水平最高,是成蚜表达量的1.432倍;在4龄若蚜中表达量最低,为成蚜表达量的0.444倍,显著低于其它龄期,而其余各龄期RpAQP1表达量无显著差异。     

吡虫啉悬浮种衣剂对麦无网长管蚜实验种群的影响

利用吡虫啉种子包衣技术防治麦蚜是我国小麦主产区一项重要的防控措施,目前对麦蚜的防控效果评价主要集中在自然混合种群上,对室内种群尤其是麦无网长管蚜的研究报道较少。为了明确吡虫啉种衣剂对单一蚜虫种类的影响,本文利用吡虫啉悬浮种衣剂处理的小麦苗接种4种蚜虫,分别于3、6和9 d后检查死亡率。并采用生命表方法评价种衣剂处理对麦无网长管生长发育、繁殖和种群生命参数的影响。结果表明:种衣剂处理小麦苗接种的4种蚜虫,3 d后死亡率大小依次为禾谷缢管蚜麦长管蚜麦二叉蚜麦无网长管蚜,6 d后禾谷缢管蚜和麦长管蚜全部死亡;9 d后麦二叉蚜全部死亡,但麦无网长管蚜死亡率仅为10.3%。生命表结果表明:麦无网长管蚜大部分个体在种衣剂处理麦苗上可以完成整个世代周期,但其生长发育延缓,存活率、寿命和繁殖力显著下降,内禀增长率(r_m)、周限增长率(λ)、净生殖率(R_0)显著降低,平均世代周期(T)显著延长。研究结果进一步证实吡虫啉包衣处理对麦长管蚜、禾谷缢管蚜、麦二叉蚜具有很好的防治效果,但对麦无网长管蚜防效较差。     

麦蚜混合种群对小麦穗期的危害和动态防治指标初步研究

小麦穗期,利用田间自然虫源加以人工控制培养,使形成虫量梯度以研究麦蚜混合种群对小麦产量的影响。分析表明4种蚜虫中麦长管蚜和禾谷缢管蚜对产量有明显影响。两者对产量无明显交互作用。得到了复合蚜量动态防治指标的二元一次式1.75(0.43639x₁+0.04939x₂)=3。37661;并由此推算出扬花初期麦长管蚜单独存在时的防治指标为4.4头/茎,禾谷缢管蚜单独存在时的防治指标为38.9头/茎。     

六种蚜虫对多异瓢虫生长发育和繁殖的影响

多异瓢虫是新疆地区的优势捕食性天敌,可取食蚜虫、粉蚧、木虱等多种害虫。开展多异瓢虫的大规模扩繁对于推进害虫的绿色防控具有重要意义,选择适合多异瓢虫生长发育和繁殖的食物,是保证其人工扩繁的重要基础。本研究通过室内比较饲喂6种蚜虫（麦长管蚜、棉黑蚜、棉蚜、玉米蚜、豌豆蚜、桃蚜）后多异瓢虫的生命参数,筛选适合用于其人工扩繁的活体饲料。结果表明：多异瓢虫取食6种蚜虫显著影响幼虫的发育历期、存活率、成虫寿命、繁殖力以及世代历期。其中,多异瓢虫幼虫取食麦长管蚜（7.70d）和玉米蚜（7.67d）的发育历期明显短于取食其他4种蚜虫的;取食麦长管蚜发育成的雌、雄成虫均较重（雌11.02mg、雄8.54mg）;取食棉黑蚜时蛹期（3.80d）和卵期（2.52d）均较短;多异瓢虫取食麦长管蚜（20.02d）、棉黑蚜（21.14d）、棉蚜（20.07d）和玉米蚜（20.37d）的世代历期均较短;多异瓢虫幼虫取食麦长管蚜（96.33%）、棉黑蚜（96.50%）和棉蚜（90.67%）的存活率均明显高于取食其他3种蚜虫的。同时,多异瓢虫雌、雄成虫分别在取食棉黑蚜（44.67d）和麦长管蚜（59.13d）时寿命最长。在繁殖力方面,多异瓢虫成虫取食麦长管蚜（3.53d）和棉蚜（3.68d）时产卵前期均较短;取食棉黑蚜（1044.02粒）和棉蚜（1084.45粒）时单雌产卵量较高。综合来看,在6种蚜虫中,麦长管蚜、棉黑蚜和棉蚜均相对适合多异瓢虫的生长发育和繁殖,是饲养与人工扩繁多异瓢虫较为理想的活体饲料。     

几种蚜虫对MDMV传毒效率及其口针中病毒附着位点(VAS)的免疫荧光标记

 本研究在测定了5种蚜虫对玉米矮花叶病毒(MDMV)传播效率的基础上,采用免疫荧光(FITC)标记方法,观察到蚜虫口针中MDMV附着位点(VAS)的存在。结果发现不同蚜虫之间的传毒效率及VAS有一定的差异。其中,以麦二叉蚜(Schizaphis graminum)的传毒效率最高,达66.8%。并且其VAS也最明显,位于口针末端约50μm处。通过试验发现,尽管在VAS存在的情况下,用提纯的不含HC的MDMV进行蚜虫传毒试验,其传毒率为零。只有当HC与MDMV共同存在的情况下才可有效传播。至于蚜虫是如何释放病毒的还不清楚。根据试验结果初步认为,蚜虫对MDMV的传播是一个"识别-吸附-释放"的过程。     

几种蚜虫对MDMV传毒效率及其口针中病毒附着位点(VAS)的免疫荧光标记

 本研究在测定了5种蚜虫对玉米矮花叶病毒(MDMV)传播效率的基础上,采用免疫荧光(FITC)标记方法,观察到蚜虫口针中MDMV附着位点(VAS)的存在。结果发现不同蚜虫之间的传毒效率及VAS有一定的差异。其中,以麦二叉蚜(Schizaphis graminum)的传毒效率最高,达66.8%。并且其VAS也最明显,位于口针末端约50μm处。通过试验发现,尽管在VAS存在的情况下,用提纯的不含HC的MDMV进行蚜虫传毒试验,其传毒率为零。只有当HC与MDMV共同存在的情况下才可有效传播。至于蚜虫是如何释放病毒的还不清楚。根据试验结果初步认为,蚜虫对MDMV的传播是一个"识别-吸附-释放"的过程。     

木贼镰刀菌的鉴定及其对桃蚜的致病性测定

从罹病桃蚜虫尸上分离到了一株昆虫病原真菌，命名为JMF-01，本文旨在确定该菌株分类地位并探索其生防潜能。对罹病的桃蚜虫尸进行分离纯化，基于形态学观察和rDNA-ITS、RPB2、IGS序列分析，构建系统发育树对该菌株进行鉴定。采用浸叶浸虫法研究该菌株不同浓度条件下对桃蚜的致病力并进行温室防效测定。结果表明菌株JMF-01在PDA培养基上5 d后菌落直径58～60 mm，分生孢子镰刀形，3～7隔。菌株JMF-01对桃蚜具有较强致病力，处理桃蚜在7 d后累计校正死亡率和LC₅₀达到85%和9.87×10⁵ cfu/mL；孢子悬浮液最高浓度的温室防效在14 d时高于70%。该菌株的rDNA-ITS序列（MW404610）与木贼镰刀菌Fusarium equiseti（GenBank登录号：JF773657）相似度达100%，位于系统发育树的同一分支；RPB2、IGS序列分别与木贼镰刀菌（GenBank登录号：MK077112，KX583611）的相似度也达到99%以上，聚在系统发育树的同一分支。菌株JMF-01经鉴定为桃蚜的病原真菌木贼镰刀菌，具有生防潜力。     

大蒜根系分泌物对烟蚜的生物活性

为了探索大蒜根系分泌物粗提物及其四种成份对烟蚜的影响，分析大蒜在烟田套种生态系统中对烟蚜的控制作用，在室内利用固体琼脂培养法培养、分离了大蒜根系分泌物粗提物，并测定了该分泌物粗提物及其四种成份（邻苯二甲酸二丁酯、2，6-二异丙基苯酚、二烯丙基二硫和2，6-二叔丁基对甲酚）对烟蚜的忌避、触杀等生物活性。大蒜根系分泌物粗提物对烟蚜有显著的忌避、触杀活性。大蒜根系分泌物粗提物为4 g/mL时，对烟蚜的忌避活性较好，忌避率在75.93%～80.56%，且对烟蚜的触杀活性也较好，其死亡率在92.22%～96.67%。大蒜根系分泌物4种成份对烟蚜也有显著的忌避、触杀活性。2，6-二异丙基苯酚对烟蚜的忌避活性较好，其忌避率在93.65%～100.00%；邻苯二甲酸二丁酯和2，6-二异丙基苯酚对烟蚜触杀活性较好，其死亡率在83.33%～92.22%。4种成份对烟蚜的忌避活性由强至弱顺序为2，6-二异丙基苯酚，二烯丙基二硫，邻苯二甲酸二丁酯，2，6-二叔丁基对甲酚；而触杀活性由强至弱顺序为2，6-二异丙基苯酚，邻苯二甲酸二丁酯，2，6-二叔丁基对甲酚，二烯丙基二硫。以上结果表明，大蒜根系分泌物粗提物及其4种成份对烟蚜均具显著的忌避、触杀作用，这为研制含大蒜根系分泌物或其4种成份的植物保护剂和间作套种大蒜等绿色防控措施防控烟蚜提供科学参考。     

山东花生花叶病毒的研究

 从表现生长抑制和花叶病状的花生叶分离到一种花生花叶病毒(PMV),可通过汁液和桃蚜(Myzus Persicae)传播,它的寄主范围包括豆科和非豆科植物,和花生斑驳病毒不同。病毒的体外存活力4-5天,致死温度40°-50℃,稀释终点10^-3-14^-4;用氯仿澄清,聚乙二醇沉淀和差速离心可部分提纯。病毒颗粒长约725毫微米,沉降系数173S。在感病的心叶烟(Nicotiana glutinosa)叶细胞质中可见典型的风轮状内含体,表明PMV是马铃薯Y病毒组的一个成员。     

烟蚜茧蜂的种群退化规律

烟蚜茧蜂是防治烟蚜的优良天敌昆虫。近20年，我国烟蚜茧蜂大规模扩繁技术日臻成熟，以其防控农作物蚜虫的生产应用也取得显著成效。然而在扩繁实践中发现连续饲养多代后，烟蚜茧蜂出现了种群退化现象，成为连续大规模扩繁烟蚜茧蜂生产瓶颈。为探索烟蚜茧蜂的种群衰退程度与饲养代数间的关系，分析归纳种群退化的特征规律，在室内续代饲养的条件下，测定了烟蚜茧蜂不同代数的单雌僵蚜量、羽化率、性比、成虫寿命、成虫胫节长度等特征。试验结果表明：从F₁代到F₁₂代，烟蚜茧蜂单雌僵蚜量下降了67.22%，羽化率下降了31.91%，雌性比上升了33.32%，成蜂寿命下降了53.85%，雌蜂后足胫节长下降了17.67%，雄蜂后足胫节长下降了28.74%，在F₇～F₉代各项特征衰退显著。试验证实在室内扩繁烟蚜茧蜂到第7代种群出现明显的衰退，生产上需适时采取复壮措施。     

马铃薯疮痂病菌致病相关基因的克隆及表达

 A pathogenic-related gene nec1 was cloned in Streptomyces scabies CPS-1, potato scab strain. Analysis results showed that the length of open reading frame(ORF) for nec1 gene was 666 bp, and the GC content was 54.2%. Sequence alignment indicated that a 650 bp up-stream sequence shared 91% similarity with IS 256 family transposase nucleotide sequences by BLASTn searches against GenBank. The segments obtained by PCR amplification were digested by enzymes SphⅠand SacⅠ, and linked to the expression vector pIJ702. The recombinants were transformed into nonpathogenicity strain Streptomyces lividans 66 TK24. Bioas-say results suggested that the transformants possessed the same symptoms as pathogenic strain on potato tuber slices and radish seedlings, which implied that nec1 gene was associated with the pathogenicity of S. scabies CPS-1.     

爪哇根结线虫Mj-1-1基因的克隆、鉴定及RNAi表型分析

根据爪哇根结线虫食道腺内表达的EST序列,结合反式剪接序列SL1,从爪哇根结线虫中克隆了一个假定寄生基因Mj-1-1(KU358725),该基因的c DNA全长为573 bp,包含450 bp的开放阅读框(ORF),编码149个氨基酸。DNA全长为740 bp,包含2个内含子,长度分别为20 bp和111 bp。NCBI BLASTn比对表明,Mj-1-1与南方根结线虫的M.incognita zk1236.5(JQ284068)基因相似性最高,为97%。原位杂交表明Mj-1-1基因在爪哇根结线虫的背食道腺中表达,qRT-PCR结果表明Mj-1-1基因在爪哇根结线虫寄生性3龄幼虫阶段表达量最高。对爪哇根结线虫侵染前2龄幼虫的Mj-1-1基因进行沉默,调查发现,沉默Mj-1-1后,爪哇根结线虫对番茄的侵染力显著下降,表明Mj-1-1对爪哇根结线虫侵染和寄生具有重要的调控作用。