胶体金免疫层析法检测猪PRV gE抗体方法的建立及应用

利用PCR技术从猪伪狂犬病毒基因组中克隆gE抗原表位基因，并将其插入到载体pET-22b（＋）中，构建成原核表达质粒pET-22b（＋）-gE，使其在E．cobBL21（DE3）中诱导表达，经瘫点杂交证实表达产物具有抗原性。表达产物纯化后作为抗原，结合胶体佥标记技术，运用双抗原夹心法于国内首先建立了猪PRV gE抗体检测的免疫层析试纸务。该方法操作简单灵敏度高、特异性好，适合猪伪狂犬病的临床诊断。     

伪狂犬病病毒Kaplan株糖蛋白gG基因的克隆与表达

本试验利用PCR技术扩增了伪狂犬病病毒（PRV）Kaplan株的糖蛋白G（gG）基因,结果显示,扩增的片段长约为1 314 bp。将gG基因克隆到原核表达载体pET-30a中,转入大肠杆菌中并经IPTG诱导表达,通过SDSPAGE蛋白电泳和Western-Blot免疫印迹分析,证实表达了分子量大小约为54 ku的特异性gG蛋白,并能被特异性抗体所识别。本研究为深入阐明PRV gG基因结构与功能及诊断试剂的研发奠定了基础。     

伪狂犬病病毒Bartha株gC膜外区部分基因的原核表达及纯化

构建伪狂犬病病毒(PRV)gC膜外区部分基因的重组质粒,原核表达并纯化目的蛋白.根据GenBank已发表的伪狂犬病病毒Bartha(PRV Ba)株gC基因的序列(NC EU719641),设计并合成了1对引物,以PRV Ba株为模板,PCR扩增出PRV gC膜外区部分基因片段;将该基因片段克隆到原核表达载体pET-28a上,转化大肠埃希菌BL21(DE3),经IPTG诱导,获得大小为35 ku的重组蛋白,命名为pET-gCN813.按照His-Bind纯化试剂盒说明书纯化表达产物,获得融合蛋白的纯化产物.     

表达绿色荧光蛋白为伪狂犬病病毒转移载体的构建及转移特性

对含伪狂犬病病毒（PRV）鄂A株gG全基因，PK，gD基因部分编码序列的质粒pUSK进行改造，肖除其中的EcoRI位点，将通过PCR扩增的增强绿色 荧光蛋白基因（EGFP）融合到gG启动子下游，构建了由gG启动子控制EGFP表达的PRV转移载体pgG^-1/EGFP^ ，该转移载体单独转染或同PVR基因组DNA共转梁IBRS－2细胞，结果单独转染时EGFP不能表达，共转梁时，6h就可在荧光显微镜下观测到明显的荧光。     

伪狂犬病毒截短VP5蛋白原核表达与鉴定

以全长PRV基因组DNA为模板,PCR法扩增截短的伪狂犬病毒VP5基因,将其克隆至p ET-28a载体中,构建重组原核表达质粒p ET-28a-VP5,转化至大肠杆菌BL21中,并诱导表达;表达产物经SDS-PAGE及Western blot鉴定后,进行纯化。结果表明,重组表达蛋白可以与PRV阳性血清及标签HIS单克隆抗体发生特异性反应。通过成功构建了PRV截短VP5基因重组原核表达质粒p ET-28a-VP5,原核表达并纯化了重组蛋白,为伪狂犬病毒特异性诊断抗原的开发、疫苗的研制及细胞生物学研究奠定了基础。     

狂犬病病毒糖蛋白膜外区基因在大肠埃希氏菌中的高效表达

为获得狂犬病病毒（RV）糖蛋白抗原，采用RT-PCR方法从狂犬病病毒ERA株中扩增了编码RV糖蛋白的全长基因，将其克隆于pMD18-T载体，再经PCR扩增出糖蛋白全长基因和膜外区基因，将其分别亚克隆至原核表达载体pET-28a（＋）、pET-32a（＋）和pGEX-4T-1中，经PCR和双酶切鉴定以及序列分析，表明已成功构建了重组质粒。将重组质粒转化到大肠埃希氏菌BL21（DE3）中进行表达，结果显示，克隆到pET-32a（＋）的糖蛋白膜外区基因表达量最高，目的蛋白表达量占菌体总蛋白的45．4％。经Western-blotting检测，不同载体表达的糖蛋白膜外区产物均可与兔抗RV多抗发生特异性反应，表明，重组蛋白具有良好的反应原性。     

大约克猪SLA-1原核表达载体的构建及表达

为构建大约克猪SLA-1胞外区的原核表达载体及表达目的蛋白,试验设计1对引物,经PCR扩增获得大约克猪SLA-1胞外区基因（命名为SLA-1-DYKe）,将此片段克隆至pMD^®19-T Simple Vector,转化大肠杆菌TOP10感受态细胞,经Nde Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切筛选阳性克隆菌并测序,将目的基因插入到原核表达载体pET-28a（+）中,转化至宿主菌BL21（DE3）进行诱导表达,用SDS-PAGE检测目的蛋白的表达情况,大量诱导提取包涵体并检测。结果显示,PCR成功扩增SLA-1-DYKe的胞外区,得到大小为837 bp的目的基因,目的基因成功克隆至pMD^®19-T Simple Vector,并获得序列正确的重组质粒。以得到的重组质粒成功构建了SLA-1-DYKe/pET-28a（+）表达载体,目的蛋白大小约为34 ku。本研究成功构建了大约克猪SLA-1原核表达载体,获得了表达蛋白,为今后研究大约克猪SLA-1的空间结构和基因功能奠定了基础。     

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣ毒素基因的克隆与表达

以猪传染性胸膜肺炎放线杆菌（APP）血清2型标准菌株基因组DNA为模板,用PCR方法扩增ApxⅣ毒素基因特异片段1.5 kb左右,将PCR产物纯化后与pMD18-T连接并测序,结果该片段的碱基序列与GenBank中标准株序列的同源性为98%。随后将该片段亚克隆到原核表达载体pET-28a（＋）的多克隆位点,经鉴定后得到重组质粒pET-ApxⅣ,将此重组质粒转化到受体菌BL21-DL3中,并用诱导剂乳糖进行诱导表达,5 h后表达达到高峰。经12%SDS-PAGE电泳检测,表达得到的融合蛋白约为61 000。经Western blotting分析,表达蛋白能与APP阳性血清发生特异性反应,而与阴性血清不反应。     

猪SLA—DRB基因的克隆及在大肠杆菌的表达

试验旨在通过基因工程方法获得重组猪SLA-DRB蛋白。根据基因库猪SLA-DRB基因序列设计合成特异性引物,引物两端分别加上BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点及保护碱基;提取长白猪肠系淋巴结RNA,用RT-PCR的方法扩增猪SLA-DRB基因cDNA,并将其克隆到pMD18-T载体上,测序后经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后克隆到pET-32a( )中,构建原核表达载体pET-32a-DRB;将重组表达质粒转化至宿主菌Rosseta中,诱导表达。结果表明,成功扩增出猪SLA-DRB基因cD-NA,经DNA序列测定,所得基因与国外报道的序列99.9%相同;成功构建原核表达载体pET-32a-DRB;经IPTG诱导,表达出了6×His-DRB融合蛋白,对表达的蛋白用SDS-PAGE电泳分析,得到了约50kDa左右蛋白,与预期大小相符,表明猪SLA-DRB基因在大肠杆菌中成功的进行了表达。     

伪狂犬病gG-ELISA鉴别诊断方法的建立及其应用

利用gG基因表达产物建立了gG-酶联免疫吸附试验(ELISA)鉴别诊断方法，以该方法检测100份猪血清，结果表明该方法可显著区分gG基因缺失疫苗免疫猪和野毒感染猪，且特异性强、敏感性高。临床应用表明，该方法结果与其它临床诊断结果符合率高。以该方法在部分使用gG基因缺失疫苗的猪场做流行病学调查，共检测842份血清，检出242份阳性，阳性率为28.74％。     

抗伪狂犬病病毒gG蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

以大肠杆菌表达的猪伪狂犬病病毒 (PRV) g G蛋白作为抗原 ,免疫 BAL B/c小鼠 ,经细胞融合、克隆后 ,获得了1F6、2 B92株稳定分泌抗伪狂犬病病毒 g G蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞。 1F6、2 B9培养上清及小鼠腹水效价(EL ISA)分别为 1∶ 2 1 1 、1∶ 2 1 1 及 1∶ 10 0× 2 1 1 、1∶ 10 0× 2 1 2 。 1F6、2 B9的染色体众数分别为 87(80～ 94 )、84 (81～ 87)。经间接 EL ISA鉴定 ,1F6、2 B9单抗分别属于 Ig G2 a、Ig G3亚类。1F6、2 B9与猪伪狂犬病病毒 Ea株感染细胞的间接免疫荧光试验结果表明 ,1F6、2 B9确实为伪狂犬病病毒 g G蛋白的单抗。所得单抗与牛传染性鼻气管炎病毒 (IBRV)、猪细小病毒 (PPV)、猪繁殖与呼吸道综合征病毒 (PRRSV)之间无交叉反应     

奶牛传染性鼻气管炎病毒gG基因PCR检测方法的建立

本试验旨在建立一种PCR技术,既能快速检测牛传染性鼻气管炎病毒,又能区分同属病毒牛疱疹病毒5型和伪狂犬病病毒。根据基因库中牛传染性鼻气管炎病毒gG基因的特异性引物,建立PCR方法,对牛传染性鼻气管炎病毒参考毒株和阳性样本进行扩增,结果均能扩增出一条463 bp的特异性条带;对同属的牛疱疹病毒5型进行扩增,获得651 bp和431 bp两条带;对同属伪狂犬病病毒进行扩增,获得493 bp的条带;而非相关病毒(如猪呼吸与繁殖综合征病毒等),不能扩增出条带。对牛传染性鼻气管炎病毒的检测灵敏度为2×10^-3 PFU/mL。鉴于该方法具有良好的灵敏度和特异性,将在牛疱疹病毒感染诊断和标记疫苗免疫后的鉴别诊断方面具有良好的应用前景。     

伪狂犬病病毒FJSW的分离鉴定及gG基因序列分析

从福建省某规模化猪场的患猪中分离到一株疑似猪伪狂犬病病毒,命名为FJSW株,对其进行PCR鉴定、gG基因测序等鉴定,并与GenBank上发表的国内外毒株进行序列分析和遗传进化分析。结果显示,病毒经Vero细胞培养可产生典型细胞病变。该毒株gG基因核苷酸序列与国内分离毒株的同源性为99.7%~100.0%,与国外分离毒株核苷酸同源性为98.9%~99.1%。遗传进化分析表明,FJSW株与国内2012年以来新分离的流行毒株属于同一分支,与国外分离的毒株亲缘关系较远。鉴定结果表明,分离株FJSW是一株伪狂犬病变异毒株。     

牛传染性鼻气管炎病毒内蒙古分离株gG基因的PCR扩增

参考牛传染性鼻气管炎病毒全基因序列(GenBank)设计1对特异性引物,以牛传染性鼻气管炎病毒内蒙古分离株提取的总DNA为模板,运用PCR方法成功地扩增出牛传染性鼻气管炎病毒内蒙古分离株gG基因,并用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。     

伪狂犬病病毒PK基因的克隆与PK、gG双缺失转移载体的构建

地高辛标记伪狂犬病病毒（PRV）Ea株短区段蛋白激酶（PK）基因3′端0．4kb片段，Southern杂交确定短区段PK基因定位在基因组DNA BamH Ⅰ 4．0kb片段中。将该片段克隆获得重组质粒pSB304，对pSB304亚克隆，构建了仅含完整PK基因约1．3kb片段的重组质粒pSB305，并进行了序列测定。结果表明，PK基因存在2种可能的同框编码方式，分别编码388或334个氨基酸残基，并具有真核细胞蛋白激酶催化结构域序列。同国外PRV NIA-3、Ka株相比，氨基酸同源性分别为98．8％和97．3％，有意义的是Ea株、Ka株均较NIA-3株在同一位置缺失2个氨基酸（Asp，Gly）。进一步对pSB305和含gG全基因以及部分gD基因的质粒pUSK进行酶切拼接，将PK基因大部分编码区、gG基因5′端部分编码区进行缺失，构建成两端同源侧翼分别为3．1kb和1．6kb的PK、gG双缺失转移载体pLR001。上述结果为深入研究PK基因功能及研制更安全的TK^-／PK^-／gG^-三缺失基因工程疫苗奠定了基础。     

伪狂犬病病毒鄂A株gG－／LacZ＋突变株的构建

以从湖北某猪场分离鉴定的鄂A株为亲本，提取其基因组DNA，克隆含gG基因的SphⅠ／KpnⅠ片段，然后将LacZ基因融合到gG启动子下游，得到重组质粒pUSKZ，将重组质粒与鄂A株基因组共转染PK-15细胞，待细胞完全病变后，在X-gal存在下，作蓝斑筛选纯化。经斑点杂交和PCR扩增证实得到的是基因型为gG     

乙型脑炎病毒NS1基因重组伪狂犬病毒的构建

设计1对引物从含有乙型脑炎病毒NS1基因的质粒pNS1上亚克隆NS1基因,将NS1基因插入到中间转移载体pUSK中，获得重组中间转移质粒pUSK—NS1。将pUSK—NS1与伪狂犬病毒Ea株TK／gG／LacZ^ 突变株基因组共转染真核细胞IBRS-2，通过空斑纯化得到了乙型脑炎病毒NS1基因重组伪狂犬病毒株TK／gG^-／NS^ 1。经检测,重组病毒能表达具有生物活性的NS1蛋白。该重组病毒可作为猪乙型脑炎和伪狂犬病双价基因工程疫苗用毒株。     

鸡视顶盖后背侧部的纤维联系——HRP法研究

选用健康成年来航鸡9只,以20～30％HRP溶液作标记物,观察了视顶盖后背侧部的神经纤维联系。结果:在光镜下明视野视察,标记细胞出现在古纹状体后腹部、外侧螺旋核、视上交叉腹侧核、顶盖前核、峡核大细胞部和深中脑外侧核,在内侧螺旋核和视顶盖中央灰层偶见标记细胞;在腹外侧膝状体核、圆核、顶盖前顶盖下间置核、背外侧膝状体核、前顶盖下核、丘脑背外侧核、视顶盖室周纤维层以及中脑和延髓的网状结构等部位观察到标记终枝;同时观察到顶盖丘脑束中有标记纤维的横断像以及视上腹侧交叉和顶盖连合中有标记纤维。结果表明,视顶盖的纤维比较广泛,与端脑、间脑、中脑以及延髓都有联系,视上腹交叉是两眼间视觉信息交流的形态学基础。     

陕北白绒山羊繁育中心羊场绒山羊日粮的评价

试验选择陕北白绒山羊繁育中心羊场的成年健康母羊（怀孕前期）16只,育成母羊13只,育成公羊13只,空腹称重。测定每只羊1d的采食量,计算其摄入的营养成分含量,并与原苏联绒用山羊饲养标准比较,进行饲养水平评价。结果显示,与饲养标准比较,陕北白绒山羊繁育中心羊场的育成母羊代谢能高2．68MJ,粗蛋白低59．29g,钙低3．00g,磷低1．52g;育成公羊代谢能高3．47MJ,粗蛋白低81．92g,钙低4．42g,磷低2．62g;成年母羊代谢能高2．51MJ,粗蛋白低91．33g,钙低3．09g,磷低1．93g。结合羊的体况综合评价饲养水平基本合理,但尚需要按饲养标准增加粗蛋白、钙、磷等营养物质的供给量。