布鲁氏菌BPE159基因缺失株的构建及BPE159蛋白对细胞自噬因子表达的影响

【目的】构建布鲁氏菌BPE159基因缺失株,研究缺失株体外生长变化特征及其在宿主细胞中的存活能力,探究布鲁氏菌感染期间分泌蛋白BPE159对自噬因子表达的影响。【方法】同源重组方法构建布鲁氏菌BPE159基因重组质粒,电转化布鲁氏菌S2308感受态细胞构建BPE159基因缺失株S2308ΔBPE159。PCR扩增BPE159基因,连接转化构建pBBR1MCS-4-BPE159载体,提取质粒进行电转化,构建BPE159基因回补株S2308ΔBPE159-C。琼脂糖凝胶电泳检测缺失株和回补株遗传稳定性。构建布鲁氏菌感染小鼠巨噬细胞RAW264.7模型,实时荧光定量PCR检测布鲁氏菌侵染后自噬细胞因子ATG5、Beclin1、LC3a和LC3b基因表达水平。以S2308、S2308ΔBPE159和S2308ΔBPE159-C株侵染小鼠巨噬细胞,收集细胞总RNA,实时荧光定量PCR检测BPE159基因缺失对布鲁氏菌侵染后自噬细胞因子表达水平的影响。在相同起始浓度下培养S2308、S2308ΔBPE159及S2308ΔBPE159-C株,观察细菌生长变化趋势;评价S2308ΔBPE159株在不同...     

禽流感病毒AM2蛋白相互作用宿主蛋白的筛选及初步验证

采用酵母双杂交系统筛选与禽流感病毒AM2相互作用的宿主蛋白,可为研究AM2蛋白的生物学新功能提供依据。将检测无毒性与自激活作用的诱饵质粒pGBKT7-AM2与淋巴文库质粒进行融合杂交,然后对经选择性培养基筛选到的阳性克隆进行酶切鉴定和测序分析,阳性克隆进行酵母回转试验验证。经酵母双杂交筛选与验证最终获得2个与AM2相互作用的蛋白。选择线粒体细胞色素C氧化酶亚单位Ⅱ(COXⅡ)蛋白进行进一步研究,构建真核表达载体pcDNA3.0-HA-COXⅡ,并进行GST-pull down和免疫荧光试验验证。结果表明,COXⅡ与AM2存在相互作用,且在细胞质中存在共定位现象,为进一步研究禽流感病毒的致病机理和病毒-宿主相互作用机制提供了理论基础。     

弓形虫酵母双杂交cDNA文库构建及与Rop38相互作用蛋白的筛选

为筛选与弓形虫棒状体蛋白38基因(Rop38)相互作用的宿主细胞蛋白,本研究利用MatchmakerTM Gold酵母双杂交系统,构建了人成纤维细胞(HFF)和人T细胞(CEM.NKR)的c DNA文库,以构建的p GBKT7-Rop38作为诱饵质粒,采用PEG/Li Ac法转化酵母菌株Y2H,利用表型筛选法检测Rop38的自激活作用并进行酵母双杂交筛选。结果表明,诱饵蛋白在酵母双杂交系统中无毒性和自激活作用,而且通过酵母双杂交筛选共获得29个与Rop38蛋白相互作用的宿主蛋白,其中HFF文库筛选到20个蛋白,CEM.NKR文库筛选到11个蛋白。本实验为进一步研究Rop38调节宿主细胞基因表达的信号通路奠定了基础。     

酵母双杂交筛选人白细胞文库中与A型流感病毒PB1-F2相互作用的蛋白

利用酵母双杂交技术筛选白细胞文库中与A型流感病毒PB1-F2相互作用的宿主蛋白,为研究PB1-F2蛋白的功能提供依据。构建pGBKT7-PB1-F2诱饵重组载体,在证实诱饵蛋白不具有自激活作用的前提下,以酵母双杂交系统筛选人白细胞文库中与PB1-F2相互作用的细胞蛋白。对阳性克隆进行测序和生物信息学分析,并在酵母细胞内验证蛋白的相互作用。Western blot结果表明,酵母表达载体pGBKT7-PB1-F2在酵母中成功表达PB1-F2融合蛋白。酵母双杂交筛选并验证,获得了8个与流感病毒PB1-F2蛋白相互作用的宿主蛋白。本研究有助于在分子水平上探索PB1-F2蛋白的新功能,为揭示流感病毒的致病机理奠定基础。     

应用酵母双杂交系统筛选与流感病毒NS2蛋白相互作用的宿主蛋白

流感病毒的NS2蛋白能够介导病毒核糖核蛋白复合体(v RNP)的核输出过程,而且可以调控病毒聚合酶的活性,参与禽流感病毒在哺乳动物宿主体内的适应过程。为鉴定与NS2相互作用的宿主蛋白,本研究利用流感病毒NS2蛋白作为"诱饵"蛋白,通过经典酵母双杂交系统筛选与其相互作用的宿主蛋白,并利用免疫共沉淀(Co-IP)和GST pull-down方法进一步验证其相互作用关系。结果表明,通过酵母双杂交系统筛选含有Calu-3、A549、THP-1和U251 4种细胞的c DNA文库,共筛选到7种蛋白,分别为HGS、EXOSC4、ZWINT、PRDX3、IRF3、NDUFB9和RMND5B,根据Gene Ontology分析结果表明,这些蛋白分别参与细胞生长发育、细胞代谢和细胞定位等过程。其中对过氧化物氧还酶3(PRDX3)进行了Co-IP和GST pull-down试验证实重组表达的NS2蛋白和PRDX3蛋白在293T细胞中存在特异性的相互作用。本研究为进一步研究两者之间相互作用如何影响NS2蛋白功能以及病毒的复制周期奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp9与宿主CALM2基因编码钙调蛋白的相互作用研究

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)非结构蛋白Nsp9为该病毒RNA依赖的RNA聚合酶(Rd Rp),在病毒的转录复制过程中发挥关键性作用。为筛选与Nsp9相互作用的宿主蛋白,本研究采用酵母双杂交方法,以PRRSV Nsp9为诱饵蛋白,从猪肺泡巨噬细胞(PAM)酵母表达c DNA文库中筛选到CALM2(Calmodulin 2)基因。酵母回返验证试验和免疫共沉淀(Co-IP)试验证明CALM2基因编码的钙调蛋白(Ca M)与Nsp9特异地相互作用。激光共聚焦试验表明Ca M与Nsp9共定位于HEK293细胞胞浆内。本研究筛选到一个与Nsp9相互作用的新宿主蛋白Ca M,但该蛋白是否直接参与PRRSV的复制过程还有待进一步研究。     

利用酵母双杂交技术筛选和鉴定非洲猪瘟病毒E120R蛋白的互作宿主蛋白

【目的】 探讨非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）衣壳蛋白E120R在病毒感染中的作用，确定与E120R蛋白互作的宿主蛋白。【方法】 将ASFV分离株CADC_HN09株E120R基因合成并克隆于pGBKT7表达载体，获得pGBKT7-E120R诱饵质粒，同时构建E120R基因截短表达质粒pGBKT7-E120R-1（1－61位氨基酸）和pGBKT7-E120R-2（62－122位氨基酸）。经毒性和自激活性检测后，通过酵母双杂交技术对骨髓巨噬细胞（BMDMs） cDNA均一化酵母文库进行初步筛选，以获得与ASFV E120R蛋白互作的蛋白。通过NCBI数据库进行序列比对并经免疫共沉淀试验验证，确定互作的宿主蛋白。筛选的宿主蛋白经webgenstal在线分析网站初步进行GO功能和KEGG通路富集分析，以确定所筛选的宿主蛋白参与的生物过程与信号通路。【结果】 诱饵质粒pGBKT7-E120R-2无毒性和自激活性，可用于文库筛选。通过酵母双杂交系统从BMDMs cDNA均一化酵母文库中初步筛选到46个阳性克隆并进行回转验证，经NCBI数据库序列比对分析共获得29个宿主蛋白。免疫共沉淀试验结果显示，多聚胞嘧啶结合蛋白2（PCBP2）和干扰素刺激基因15（ISG15）均与E120R蛋白存在互作。GO功能富集分析表明，所筛选的宿主蛋白可参与代谢过程、生物调节、应激反应等生物过程；KEGG通路富集分析表明，这些宿主蛋白可参与抗原呈递、铁死亡和坏死性凋亡等多条信号通路。【结论】 ASFV E120R蛋白可与宿主免疫应答、细胞死亡等信号通路相关的多种宿主蛋白互作，为进一步研究ASFV E120R蛋白在病毒感染过程中的作用提供了重要理论依据。     

羊口疮病毒129蛋白互作宿主蛋白的筛选与C1QBP基因的克隆分析

【目的】以羊口疮病毒129（ORFV129）蛋白为研究对象,在构建山羊鼻甲骨原代细胞cDNA文库的基础上,通过酵母双杂交筛选与其相互作用的蛋白。【方法】采用Smart^TM技术构建山羊鼻甲骨原代细胞cDNA文库。构建诱饵质粒pGBKT7-129,并将其转化至Y2HGold酵母感受态细胞,验证质粒pGBKT7-129是否具有自激活性。对转化了质粒pGBKT7-129的菌液进行生长曲线测定,验证该质粒是否对酵母细胞有毒性作用。以ORFV129为诱饵蛋白,利用酵母双杂交系统筛选出与ORFV129相互作用的宿主胞内蛋白并对阳性菌落进行PCR和测序鉴定。利用DAVID 6.7的GO数据库对胞内宿主蛋白进行功能分类和通路分析,并依据Cytoscape v 3.8.0软件绘制ORFV129与胞内蛋白相互作用的网络图。以山羊脾脏为组织样本,采用RT-PCR技术克隆山羊补体C1q结合蛋白（complement C1q binding protein,C1QBP）基因CDS区序列,并采用在线软件进行生物信息学分析。将C1QBP基因CDS区序列连接至pcDNA3.1（+）构建真核表达载体pcDNA3.1（+）-C1QBP,并将其转染至山羊鼻甲骨原代细胞进行亚细胞定位分析。【结果】试验成功构建山羊鼻甲骨原代细胞cDNA文库,文库容量约为6.0×10⁶ CFU/mL。成功构建诱饵质粒pGBKT7-129,重组质粒pGBKT7-129无自激活能力且对酵母细胞无毒性。利用酵母双杂交筛选出14个与ORFV129进行互作的胞内蛋白并对阳性克隆进行PCR、测序验证。试验成功克隆山羊C1QBP基因CDS区,长度为837 bp,编码279个氨基酸。系统进化树显示,山羊和绵羊亲缘关系最近。C1QBP蛋白为不稳定的亲水性蛋白,无信号肽结构和跨膜结构域,主要包括3种磷酸化位点,分别是18个丝氨酸、4个苏氨酸和3个酪氨酸位点。C1QBP蛋白二级结构由α-螺旋（33.81%）、无规则卷曲（46.40%）、延伸链（16.91%）和β-转角（2.88%）组成,三级结构与二级结构一致。间接免疫荧光试验表明,C1QBP蛋白散在分布于细胞质中。【结论】筛选出了与ORFV129蛋白相互作用且在天然免疫应答中发挥作用的宿主胞内蛋白C1QBP,通过间接免疫荧光试验验证C1QBP定位于细胞质中,推测ORFV129与能C1QBP相互作用诱导炎症,为进一步验证ORFV129蛋白介导ORFV抑制机体免疫应答的过程奠定基础。     

酵母双杂交系统筛选猪流行性腹泻病毒N蛋白互作的宿主蛋白

为了获得猪流行性腹泻病毒(PEDV)N蛋白与宿主细胞中的互作蛋白,本研究构建PEDV N蛋白基因的重组载体p GBKT7-N,以其作为诱饵质粒,采用酵母双杂交方法,从猪肺泡巨噬细胞(PAM)cDNA文库中筛选出与N蛋白相互作用的蛋白。结果表明,诱饵蛋白在酵母双杂交系统中不存在毒性和自激活作用,而且筛选出6种与N蛋白互作的蛋白,分别为FTH1、LGALS3、CORO1C、SNRPG、KRTAP5-3和ZNF598。其中半乳糖凝集素3(LGALS3)和小核糖蛋白G(SNRPG)通过回返试验和免疫共沉淀试验证实其与PEDV的N蛋白存在特异性相互作用。本研究为进一步研究PEDVN蛋白的功能及病毒的致病机制奠定了基础。     

口蹄疫病毒IRES RNA元件与宿主蛋白eEF1a相互作用抑制病毒复制的研究

口蹄疫病毒(FMDV)内部核糖体进入位点(IRES)是该病毒复制的一种重要RNA元件,介导病毒蛋白的翻译起始,其过程需要多种宿主细胞因子的参与。为筛选与IRES相互作用的宿主蛋白,本研究以生物素标记的FMDV IRES RNA为"诱饵",通过RNA pulldown试验结合质谱分析筛选得到4种有可能与IRES存在相互作用的宿主蛋白,包括eEF1a、RPS3、DDX5和DDX3X。对筛选获得的宿主蛋白评分分析后,针对丰度高的宿主蛋白eEF1a进行IRES RNA pulldown分析以及western blot检测,结果显示eEF1a蛋白与FMDV IRES存在相互作用。激光共聚焦显微镜观察显示,FMDV感染宿主细胞后eEF1a蛋白从细胞核转移至细胞质中,并与FMDV基因组RNA在细胞质中共定位。此外,western blot检测显示,瞬时过表达eEF1a蛋白显著抑制FMDV在BHK-21细胞中的复制。本研究首次证实了宿主蛋白eEF1a能够与FMDV IRES RNA元件特异性结合,并抑制FMDV的复制,为深入了解IRES介导的翻译起始机制以及FMDV在宿主体内复制的分子调控机制奠定了基础。     

布鲁氏菌分泌蛋白BspI生物信息学分析及多克隆抗体制备

【目的】试验旨在对布鲁氏菌分泌蛋白BspI进行生物信息学分析,构建原核表达载体,获得BspI蛋白并制备其多克隆抗体,为后续研究该蛋白的生物学功能提供材料。【方法】使用在线软件对BspI蛋白的氨基酸序列进行生物信息学分析,参照布鲁氏菌16M株BspI基因序列(GenBank登录号:DK63_1233)设计引物,PCR扩增目的基因后连接至pMD19-T克隆载体并筛选阳性克隆,将目的基因连接到pET-28a表达载体上,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,加入IPTG诱导蛋白表达,并进行SDS-PAGE分析,用镍柱亲和层析方法纯化蛋白,纯化后的蛋白与弗氏佐剂混合免疫试验兔,采血分离血清,通过Western blotting、间接ELISA法进行多克隆抗体特异性及抗体效价分析。【结果】BspI蛋白为不稳定亲水性蛋白,存在跨膜结构,无信号肽区域,有13个磷酸化位点和7个抗原决定簇,二级结构主要由α-螺旋、延伸链和无规则卷曲组成。PCR成功扩增出675 bp的BspI基因,成功构建了pET-28a-BspI表达载体。SDS-PAGE和Western blotting分析结果表明,成功表达出25.3 ku的蛋白,纯化后无明显杂带,制备的多克隆抗体能够特异性地与BspI蛋白结合。间接ELISA结果显示,BspI蛋白多克隆抗体效价为1∶409 600。【结论】制备的兔源BspI蛋白多克隆抗体可以特异性识别BspI蛋白,该蛋白具有较好的反应原性。试验结果为进一步研究BspI蛋白在布鲁氏菌的胞内寄生中发挥的作用提供了参考。     

布鲁氏菌分泌蛋白BMCO基因缺失株的构建及生物学特性研究

【目的】 试验旨在构建牛种布鲁氏菌S2308的多铜氧化酶(BMCO)基因缺失株,探究缺失株的生长特性及在宿主细胞中的存活能力,并分析BMCO蛋白的结构。【方法】 利用PCR扩增BMCO基因上、下游同源臂和Kan基因,通过融合PCR技术将3段基因进行融合。融合片段与pMD19-T载体连接,制作牛布鲁氏菌S2308感受态细胞,1 800 V电压、400 Ω电阻电转化至牛种布鲁氏菌S2308感受态细胞中,涂布于Kan抗性的布鲁氏菌固体培养基中,筛选挑取阳性菌落,连续培养10代,检测第10代阳性菌落的遗传稳定性和生长变化趋势,将pBBR1MCS-4-BMCO融合质粒电转至能够稳定遗传BMCO基因缺失的牛种布鲁氏菌中,培养筛选阳性菌落。以感染复数(MOI)100分别用亲本株、缺失株、回补株侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7,通过平板计数法分别检测3种菌株在细胞内的生存能力。【结果】 试验成功获得片段大小为522、539、1 054 bp的BMCO基因上、下游同源臂和Kan基因;成功构建pMD19-T-BMCO-Kan融合片段重组载体;获得稳定遗传的BMCO基因缺失株,命名为S2308ΔBMCO;成功构建BMCO基因回补株,命名为ΔBMCO::BMCOS2308;缺失株和亲本株表现的生长曲线相同,均在12 h达到对数生长期,30 h进入平台期;侵染小鼠巨噬细胞RWA264.7后,与亲本株S2308相比,S2308ΔBMCO株在胞内的生存能力极显著降低(P<0.01)。生物信息学分析结果表明,BMCO属于疏水蛋白,定位于胞质且含有大量的无规则卷曲、α-螺旋和延伸链,预示该蛋白具有多个结合位点。【结论】 本研究成功构建了布鲁氏菌BMCO基因的缺失株和回补株,BMCO基因的缺失不影响其生长性能,但其在宿主细胞内的存活能力显著性降低,初步分析了BMCO蛋白的结构,为后续布鲁氏菌分泌蛋白的功能研究奠定基础。     

日本结缕草ZjHY5的克隆、亚细胞定位及转录自激活检测

转录因子LONG HYPOCOTYL 5(HY5)在光诱导基因表达中起中心调控因子的作用.为了探究日本结缕草(Zoysia japonica)中ZjHY5基因的亚细胞定位及自激活特性,本研究从日本结缕草(Zoysia japonica)中克隆得到ZjHY5基因.该基因开放阅读框为711 bp,编码236个氨基酸残基.Z...     

禽呼肠孤病毒σA基因酵母双杂交诱饵载体的构建与鉴定

为了筛选与禽呼孤病毒σA基因相互作用的宿主蛋白,本试验应用酵母双杂交技术构建禽呼孤病毒σA基因的诱饵载体pGBKT7-σA。从禽呼肠孤病毒S1133标准毒株抽提RNA,采用RT-PCR方法扩增得到σA基因片段,将其连接到诱饵载体pGBKT7上,把通过测序的重组诱饵载体命名为pGBKT7-σA。将重组诱饵载体转化酿酒酵母Y2HGold后,把不同浓度的诱饵载体转化液涂布在营养缺陷型培养基上,观察该重组诱饵载体在酵母细胞中有无毒性作用和自激活现象。结果显示,酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-σA构建成功,且对酿酒酵母无毒性和自激活现象。本研究为进一步利用酵母双杂交技术筛选与σA蛋白互作的宿主蛋白奠定了基础。     

miR-145a-3p通过靶向ATG14调控布鲁氏菌诱导的RAW264.7自噬

【目的】 探究miR-145a-3p对布鲁氏菌诱导的巨噬细胞（RAW264.7）自噬及其对布鲁氏菌胞内生存的影响。【方法】 首先合成自噬相关miRNA miR-145a-3p的模拟物（miR-145a-3p mimics）和抑制剂（miR-145a-3p inhibitor）及对照模拟物（NC mimics）,转染至GFP-RFP-RAW264.7细胞中,然后用布鲁氏菌侵染该细胞24 h,通过激光共聚焦显微镜观察miR-145a-3p对自噬的影响;运用TargetScan、miRBase等生物信息学软件预测miR-145a-3p的靶蛋白;通过构建PmirGLO-ATG14-3'UTR和PmirGLO-ATG14-3'UTR-mutation重组质粒,用SacⅠ和KpnⅠ进行双酶切鉴定,并利用双荧光素酶报告系统验证miR-145a-3p与自噬相关基因（autophagy-related gene 14,ATG14）的靶向关系;将RAW264.7细胞培养至60%汇合时,分别转染miR-145a-3p mimics、miR-145a-3p inhibitor和NC mimics,转染7 h后用布鲁氏菌侵染,添加PBS作为未感染对照,培养24 h收集细胞,利用实时荧光定量PCR、Western blotting检测miR-145a-3p对ATG14 mRNA和蛋白表达的调控作用;最后通过布鲁氏菌侵染已转染miR-145a-3p的巨噬细胞,进行菌落计数,验证miR-145a-3p对布鲁氏菌胞内生存的影响。【结果】 miR-145a-3p mimics促进布鲁氏菌诱导的细胞自噬,miR-145a-3p inhibitor抑制布鲁氏菌诱导的细胞自噬;软件预测结果表明,miR-145a-3p靶基因为自噬相关蛋白ATG14-3'UTR;双酶切结果显示,重组质粒PmirGLO-ATG14-3'UTR和PmirGLO-ATG14-3'UTR-mutation构建成功;双荧光素酶报告基因系统验证miR-145a-3p mimics与ATG14-3'UTR互相作用时,与NC mimics组相比,miR-145a-3p mimics组荧光值极显著降低（P<0.01）。与NC mimics组相比,未感染布鲁氏菌时,miR-145a-3p mimics组ATG14 mRNA水平极显著降低（P<0.01）、ATG14蛋白的表达水平显著降低（P<0.05）,miR-145a-3p inhibitor组ATG14 mRNA水平极显著上调（P<0.01）;布鲁氏菌感染后,miR-145a-3p mimics+Bru组ATG14 mRNA水平极显著提高（P<0.01）,且miR-145a-3p mimics+Bru组ATG14 mRNA的水平显著高于NC mimics+Bru组（P<0.05）。miR-145a-3p mimics促进ATG14蛋白的表达水平。miR-145a-3p的过表达导致布鲁氏菌的胞内生存数量显著降低（P<0.05）。【结论】 miR-145a-3p在布鲁氏菌感染细胞后高表达,miR-145a-3p通过靶向ATG14促进自噬,抑制布鲁氏菌复制。