堆型艾美耳球虫体外培养细胞的筛选及其发育研究

【目的】为了选择适宜堆型艾美耳球虫(Eimeria acervulina)培养的细胞。【方法】利用纯化的E.acervulina子孢子与不同细胞(非洲绿猴肾细胞、牛肾传代细胞、兔肾传代细胞-15、鸡胚成纤维细胞及鸡肾细胞)共培养,比较E.acervulina在原代细胞和传代细胞中的入侵及发育情况。【结果】37℃比41℃适宜进行E.acervulina的体外培养;5种细胞中,牛肾传代细胞入侵率最高;继续培养,牛肾传代细胞中E.acervulina可以形成第二代裂殖体,而非洲绿猴肾细胞、兔肾传代细胞-15只能发育到第一代裂殖体阶段,鸡胚成纤维原代细胞和鸡肾原代细胞中E.acervulina有第一代裂殖子的释放,但未再次入侵,并且鸡胚成纤维原代细胞和鸡肾原代细胞不易传代,5种细胞中,牛肾传代细胞最适宜E.acervulina培养;与牛肾传代细胞共培养1 h子孢子附着于细胞表面,2 h子孢子入侵,子孢子入侵后24 h形成第一代滋养体,52 h后形成第一代成熟裂殖体,60 h第一代裂殖子释放出细胞,72 h后形成第二代裂殖体。【结论】在非洲绿猴肾传代细胞、牛肾传代细胞、兔肾传代细胞-15、鸡胚成纤维原代细胞及鸡原代细胞这5种细胞中,牛肾传代细胞是培养E.acervulina的最适宜细胞,在其中可以发育到第二代成熟裂殖体。     

山羊痘病毒培养及其细胞病变观察研究

[目的]研究不同处理的细胞对病毒生长的影响。[方法]制备原代绵羊睾丸细胞,并用原代、传代和冻存3种处理的睾丸细胞对我国山羊痘病毒疫苗株分别进行培养,并用倒置显微镜和电子显微镜观察。[结果]病毒在3种处理的细胞上生长出现细胞病变的时间略有差异,并且细胞病变也不尽相同。[结论]不同处理的细胞出现的细胞病变不同。     

犊牛腹泻轮状病毒在3个传代细胞上培养特性的研究

对犊牛腹泻轮状病毒（ＮＣＤＶ）在３种传代细胞系上进行了培养，并将其培养特性进行了比较研究。结果表明：犊牛腹泻轮状病毒在ＭＡ－１０４细胞上生长，其病毒抗原的生长部位在细胞浆，培养后可出现细胞病变；犊牛腹泻轮状病毒在ＬＬｃ－ｍｋ２细胞上也生长，且随着培养代次的增加，病毒抗原的滴度相应增加，增长到一定滴定后即较稳定。     

牛轮状病毒的分离及其RT-PCR鉴定

采用MAl04细胞从疑似轮状病毒腹泻犊牛粪样中进行轮状病毒分离，盲传4代后接种细胞出现明显细胞病变（CPE），对分离病毒进行核酸聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳条带为4：2：3：2型，具备典型A群轮状病毒特征。依据NCBI等登录的牛轮状病毒的VPl基因序列设计一对引物，对其VPl基因进行克隆及序列分析，结果分离毒与国外牛轮状病毒分离株RF的核苷酸同源性为98．9％，与UK的核苷酸同源性为91．5％，证明分离毒株是一株牛轮状病毒。     

盱眙水牛病病原研究初报

采取人工传代，部分原代细胞或传代细胞系分离培养，超薄切片电镜观察以及免疫沉淀反应等方法对盱水牛病的病原进行研究。结果表明，将患有该病的水牛经过全血静脉接种在健康牛体内，可使其人工感染发病并长期继代。     

山羊表皮干细胞的分离培养及EGFP基因转染研究

采用组织块法和酶消化法对山羊表皮干细胞进行分离,对分离的表皮干细胞进行了免疫组化染色鉴定,并对其进行了增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因转染研究。结果表明,2种方法均能得到山羊表皮干细胞,其中组织块培养法简单易行,组织块可重复利用,但原代细胞脱出时间较长,平均为8 d,且培养季节对细胞脱出时间、原代传代时间、传代数有显著影响;酶消化法周期短,8 d左右即可传代,不同培养季节对细胞克隆形成时间、细胞传代时间和传代数无显著影响,但处理过程繁琐。EGFP基因在转染表皮干细胞24 h后大量表达,转染率达20%~30%,72 h时转染强度最大,荧光可持续5周;转染使细胞增殖能力明显下降。     

鸡传染性法氏囊病毒在DF-1细胞系上繁殖特性研究

对鸡传染性法氏囊病毒(IBDV) HQ株在DF-1细胞上的适应及增殖条件进行了研究,结果表明,HQ株不适应在Vero细胞上生长,而在DF-1细胞上能够很好的适应.经培养条件优化,最终选用pH值为7.0,血清含量体积分数为2％的DMEM/F12培养基做维持液,在细胞传代后第2天接种IBDV HQ株,接毒量为1％(约0.7...     

奶山羊乳腺上皮细胞的体外培养及形态观察

【目的】建立奶山羊乳腺上皮细胞体外培养方法,并对原代和传代细胞进行形态观察。【方法】分别采用组织块法和胶原酶消化法培养奶山羊原代乳腺上皮细胞,然后通过胰酶消化法结合反复贴壁法纯化细胞,免疫组化法鉴定细胞,并利用倒置显微镜观察细胞形态。【结果】组织块法和胶原酶消化法均能培养奶山羊原代乳腺上皮细胞;纯化获得的细胞呈卵圆形或多角形,形成典型的鹅卵石或铺路石样,且细胞角蛋白检测呈阳性;多次传代后乳腺上皮细胞出现分化现象,形态多样,增殖仍然旺盛。【结论】成功建立了一种简单易行、经济而实用的奶山羊乳腺上皮细胞体外培养方法。     

鸡肠上皮原代细胞体外分离培养与鉴定

为了探讨鸡肠上皮原代细胞分离培养方法,进一步研究人源志贺菌对鸡的致病性和为相关侵袭特性提供体外模型,分别取不同日龄鸡胚,用0.1 g/mLⅠ型中性蛋白酶和300 U/mLⅪ型胶原酶联合分离纯化鸡肠上皮原代细胞,筛选其最佳培养方法,并对培养细胞进行鉴定;然后采用0.125％胰酶和0.01％ EDTA联合消化进行鸡肠上皮原代细胞传代.结果显示,应用Ⅰ型中性蛋白酶和Ⅺ型胶原酶消化15日龄鸡胚肠组织可获得满意的肠上皮细胞分离效果,细胞贴壁性良好.培养出圆形或多角形单层生长呈“铺路石样”的细胞,培养的细胞在12 h内贴壁,24 ～48 h明显增殖,72 h后细胞增殖速度减慢,生长状况不良.经透射电镜观察鉴定为肠上皮细胞.且传代后细胞贴壁生长良好.建立的鸡肠上皮原代细胞分离培养方法可获得纯度较高的鸡肠上皮原代细胞,制备的细胞可以连续传代3次.     

斑马鱼性腺组织的原代细胞培养技术的建立

[目的]建立斑马鱼卵巢和精巢组织的原代细胞培养技术,获得原代和传代培养细胞单层。[方法]采用组织块贴壁法进行斑马鱼卵巢和精巢组织的原代细胞培养,采用0.25%胰蛋白酶消化法进行传代培养。[结果]斑马鱼性腺组织的原代细胞培养条件为:最适培养基为DMEM/F12(p H 7.0~7.2),培养温度为24℃,在添加20 ng/m L表皮生长因子(EGF)、20 ng/m L碱性成纤维细胞生长因子(b FGF)、0.5 mmol/Lβ-巯基乙醇和15%胎牛血清时更有利于细胞的存活。其中,卵巢的组织块接种3~4 d后,上皮样细胞首先开始迁出,迁出的上皮样细胞生长5 d后,逐渐凋亡;此后,成纤维样细胞和另一种上皮样细胞开始大量迁出,10 d后可生长汇合成80%的原代细胞单层;可成功传代培养1次,但传代后的上皮样细胞不贴壁,很快死亡,而传代后的成纤维样细胞可贴壁生长,但基本不分裂,健康存活7 d后开始逐渐凋亡。精巢组织接种5 d后,上皮样细胞和成纤维样细胞同时开始迁出,培养16 d后逐渐凋亡,仅得到60%原代培养细胞单层。[结论]初步建立了斑马鱼性腺组织的原代细胞培养条件,并将卵巢组织块迁出的成纤维样细胞成功传代1次。     

牛轮状病毒免疫初探

研究证实,轮状病毒是近年来广泛流行于黄淮平原地区的黄犊牛腹泻症的主要致病因子之一.作者先后从安徽、河南两地的腹泻黄犊牛粪样中分离出3株适应MA-104细胞的轮状病毒株,通过人工发病试验证实它们对剥夺初乳的黄犊牛有致病作用.我们用牛轮状病毒BRV014高代细胞培养物,通过非肠道途径,在黄犊牛腹泻流行区免疫孕期母牛,较有效的控制了黄犊牛腹泻症的发生.材料与方法(一)病毒及免疫物牛轮状病毒BRV014株系从安徽省界首县黄犊牛腹泻粪样中分离.病毒经胰酶预处理后,接种MA-104细胞单层.待产生75%以     

黑龙江省犊牛腹泻粪便中轮状病毒的分离与鉴定

用MA—104细胞,以静止培养条件,从1月龄内的犊牛腹泻粪便中,分离出4电轮状病毒。经传至4～6代均使感染细胞出现特征性细胞病变。经直接电镜和免疫株镜观察,见有典型的轮状病毒颗粒,其RNA电泳型与NCDV株一致,以抗NCDV株高免血清琼扩检测及轮状病毒ELISA检测均为阳性。这4株病毒分别命名为DNRV_1,DNRV_2,DNRV_3,DNRV_4。     

一株电泳型独特的猪B组轮状病毒的分离鉴定

１９８９年春，在新疆某猪场采集的仔猪腹泻粪样中，以ＰＡＧＥ法检出一株电泳型独特的非典型轮状病毒，其电泳型与Ｃｈａｓｅｙ等［１］报道的猪Ｅ组轮状病毒相似，该毒株样品口服接种剥夺初乳仔猪可在１２～１６ｈ后引起仔猪急性水样腹泻，并可在剥夺初乳仔猪体内稳定传代，但在用ＥＬＩＳＡ和ＣＩＥ法检测时发现该毒株不具有Ａ组轮状病毒组抗原，而具有Ｂ组轮状病毒组抗原．后用Ａ、Ｂ组轮状病毒全基因核酸探针斑点杂交检测，它与Ａ组探针无杂交信号，而与Ｂ组探针则有杂交信号。证明该毒株为一电泳型独特的仔猪Ｂ组轮状病毒．     

牛体外受精卵与牛胎儿睾丸支持细胞体外共培养研究

【目的】研究牛胎儿睾丸支持细胞对牛早期胚胎的体外发育是否有促进作用。【方法】从屠宰场采集5~7月龄胎牛睾丸,经原代和传代培养制备牛胎儿睾丸支持细胞(sertoli cells,SCs)饲养层,对比原代和传代胎牛睾丸SCs与牛体外受精卵共培养时受精卵的发育情况;分别以4×104,2×104mL-1两个密度接种传代胎牛睾丸SCs与牛受精卵体外共培养,并以培养液中无牛胎儿睾丸SCs饲养层为对照,研究体外牛胎儿睾丸支持细胞(sertoli cells,SCs)对牛受精卵体外发育的影响。【结果】与牛受精卵体外共培养时,接种密度为2×104mL-1传代胎牛睾丸SCs饲养层共培养组的卵裂率(79.3%)高于原代牛胎儿睾丸SCs饲养层共培养组(69.2%),但差异不显著(P>0.05);囊胚发育率(41.3%)极显著地高于原代SCs饲养层共培养组(16.7%)(P<0.01)。接种密度为4×104mL-1传代牛胎儿睾丸SCs饲养层共培养组的卵裂率大于接种密度为2×104mL-1传代牛胎儿睾丸SCs饲养层共培养组和对照组,但差异不显著;胚胎发育率极显著地低于接种密度为2×104mL-1传代牛胎儿睾丸SCs饲养层共培养组和对照组。【结论】制备的传代牛胎儿睾丸SCs饲养层,能有效促进牛体外受精卵的体外发育,提高囊胚发育率;接种的传代牛胎儿睾丸SCs饲养层密度过大,将严重影响牛体外受精卵的发育。     

抗腺病毒五邻体单克隆抗体的制备及双抗夹心ELISA方法的建立

为获得稳定性好、特异性强、效价高的抗腺病毒五邻体单克隆抗体,用腺病毒五邻体基因工程表达抗原免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,以腺病毒五邻体为筛选抗原对融合后的杂交瘤细胞间接ELISA进行筛选.结果表明:试验获得5株杂交瘤细胞,标记为3C4、4C4、4D7、4F2和4H3,4D7免疫球蛋白亚类为IgG2a,其余4株为IgG1;对5株细胞连续3个月体外传代试验和小鼠腹水连续传代试验,5株细胞都能持续稳定分泌单克隆抗体,对细胞上清和腹水采用间接ELISA进行效价测定,细胞上清效价稳定维持在2 000左右,腹水效价稳定维持在200 000以上,且与引起腹泻的鼠伤寒沙门氏菌和轮状病毒无交叉反应;对其中可以配对的2株单抗4D7、4F2建立双抗夹心ELISA,可以应用于临床检测腺病毒.     

羊口疮病毒DZ株在不同细胞上的增殖特性研究

为研究羊口疮病毒(ORFV) DZ株在不同细胞上的增殖特性,将ORFV-DZ株分别接种犊牛睾丸细胞(BT)和鸡胚成纤维细胞(CEF)2种原代细胞,以及山羊皮肤成纤维细胞系(GSFs)、小鼠胚胎成纤维细胞系(NIH3T3)、宫颈癌细胞系(Hela)、牛肾细胞系(MDBK)、犬肾细胞系(MDCK)、非洲绿猴肾细胞系(Vero)、乳仓鼠肾细胞系(BHK-21)7种传代细胞,通过细胞病变(CPE)、间接免疫荧光试验(IFA)、TCID50测定和实时荧光定量PCR检测ORFV-DZ株在不同细胞上的增殖特性.结果 表明:ORFV-DZ株能在BT、Hela以及MDBK 3种细胞中有效增殖,且出现细胞变圆、聚集、脱落等CPE;IFA检测ORFV-DZ株接种这3种细胞均能出现特异性绿色荧光;收集BT、Hela和MDBK细胞培养的F5代细胞毒,测得其TCID50值分别为10-5.81·0.1 mL-1、10-4.22· 0.1 mL-1、10-4.88·0.1 mL-1;qPCR检测结果中,ORFV-DZ株在BT细胞中随传代次数增加病毒拷贝数未发生明显变化,在MDBK细胞中F5代时病毒拷贝数已下降,而在Hela细胞中,随着传代次数的增多,病毒拷贝数逐步下降.这一研究得到了适合ORFV-DZ株有效增殖的细胞为BT和MDBK,为后续ORFV的基础研究以及疫苗研发等提供了细胞学研究基础.     

三种转染试剂对PEF细胞与BHK细胞转染效率的比较

[目的]比较三种转染试剂对原代细胞和传代细胞的转染效率,选择合适的转染试剂.[方法]以EGFP为报告基因,分别用脂质体、磷酸钙、罗氏试剂转染PEF细胞和BHK细胞.通过改变转染试剂和质粒DNA的剂量,利用流式细胞仪分析转染效率,从而确定最佳的转染试剂.[结果]对于PEF细胞,脂质体和磷酸钙转染效果不理想,细胞死亡率高,绿色荧光表达量少.罗氏转染试剂相对较好,细胞死亡率低,并且保持原有细胞形态.对于传代细胞BHK细胞而言,各转染试剂均可达到理想转染效果.[结论]不同的细胞对转染试剂的选择也不同,传代细胞BHK用脂质体即可达到理想的效果.利用罗氏试剂可以提高转染效率,但不明显.而对于原代细胞PEF,脂质体与磷酸钙试剂的转染效率很低.相比较而言,罗氏转染试剂效果更好些,细胞毒性小,转染率在10;～12;.     

鲫鱼尾鳍细胞培养及冻存与复苏的初步研究

本文主要从鱼类种质资源保存的目的出发,一方面以鲫鱼尾鳍组织为材料,进行细胞培养,并对所获得的原代和传代细胞进行形态学观察;另一方面以传代细胞为材料,采用逐步降温法和悬于液氮罐口两种方法冻存细胞,每种方法均以甘油和DMSO为冻存剂,通过计算复苏率,找到最适宜的冻存方法与冻存剂。实验结果：成功培养了鲫鱼尾鳍细胞,现已传至第7代;细胞在传代过程中呈成纤维细胞增多的趋势;采用逐步降温法和使用DMSO为冻存剂细胞复苏率较高。     

我国牛猪轮状病毒部分分离株的亚组鉴定

利用轮状病毒亚组特异性单克隆抗体进行捕捉法ＥＬＩＳＡ，对我国４株牛轮病毒分离株和４株猪轮状病毒江苏分离株进行了亚组抗原特异性鉴定，结果证实，所有被测试的牛，猪轮状病毒国内分离株，在亚组抗原特异性上均属第Ｉ亚组，未发现有属于第ＩＩ亚组的毒株。     

SD大鼠肾小管上皮细胞两种原代培养及传代方法的比较

目的：建立较理想的大鼠肾小管上皮细胞原代培养、传代及鉴定方法。方法：采用肾小管节段贴块法及0．2％胰蛋白酶消化20min两种方法进行原代培养,以0．25％胰蛋白酶(A组)、0．125％胰蛋白酶-0．02％EDTA(B组)消化传代,利用免疫细胞化学方法鉴定细胞种类。结果：两种方法均能成功培养肾小管上皮细胞,但前者较好,小管节段贴壁早。B组成功传代(4代)并鉴定为肾小管上皮细胞,A组传代失败。结论：肾小管节段贴块、0．125％胰蛋白酶-0．02％EDTA消化是大鼠肾小管上皮细胞原代培养及传代的有效方法。