鹅细小病毒主要免疫原性蛋白VP3基因遗传变异及其原核表达

根据鹅细小病毒(GPV)B株全基因序列,设计并合成了1对特异性引物,采用PCR技术对GPV GD-01株的VP3基因进行扩增,将目的基因克隆到pGEM(R)-T后测序,分析了GPV GD-01株VP3基因的遗传变异情况,并进行原核表达.结果表明,GPV GD-01株VP3基因全长1605bp,编码534个氨基酸(DQ665790),与已发表的GPV、番鸭细小病毒(MDPV)的核苷酸、氨基酸同源性分别为96.15%、80.1%,97.78%、89.13%,说明GPV VP3基因具有较高的遗传稳定性.结合亲水性、表面极性、抗原位点分析比较GPV、MDPV VP3基因,为研究GPV和MDPV感染谱差异的分子机制提供了一定的理论基础.原核表达显示,VP3蛋白的最高表达量占整个菌体蛋白含量的29.9%,经表达条件优化可产生大量可溶性VP3表达蛋白.SDS-PAGE与Western-blot分析显示,表达的VP3蛋白的相对分子质量约60000,并能与鼠抗GPV阳性血清反应,证明具有一定的反应原性,为进一步研制基因工程疫苗及诊断制品奠定了基础.     

稳定表达小鹅瘟病毒VP3基因的293T细胞系构建

为构建稳定表达鹅细小病毒(goose parvovirus, GPV)VP3基因的293T细胞系,利用PCR技术扩增GPV的VP3基因,构建真核表达质粒pcDNA3.1-GPV-VP3,再将其转染至293T细胞,并利用博来霉素(zeocine)进行药物压力筛选。结果表明,获得的293T细胞系能够高效表达VP3蛋白,这为小鹅瘟病毒VP3蛋白的生物学功能的深入研究以及鹅细小病毒抗体检测方法的建立提供良好的生物材料。     

鹅细小病毒YBLJ株VP3基因的真核表达

为了研究鹅细小病毒(GPV)YBLJ株VP3基因的生物学特性,根据已克隆的GPV YBH株VP3基因序列(GenBank:JN836326),设计并合成一对特异性引物,经PCR扩增、克隆、转化、酶切与亚克隆,构建真核表达载体pcDNA-VP3,将鉴定正确的质粒转染至Vero细胞,经RT-PCR检测VP3基因转录水平,通过间接免疫荧光试验(IFA)观察VP3基因表达水平.结果显示,克隆的VP3基因全长约1 605 bp;构建了真核表达载体pcDNA-VP3,经RT-PCR对转染细胞总RNA扩增得到特异性目的片段,IFA检测显示VP3基因在Vero细胞中获得了稳定表达.本研究为GPV核酸疫苗的研制奠定了基础.     

共表达鹅细小病毒VP3-gIL2重组乳酸杆菌的构建及其口服免疫评价

笔者拟构建共表达鹅细小病毒(GPV)VP3和鹅白细胞介素-2(IL-2)的分泌性重组乳酸杆菌,评价口服表达融合蛋白GPV VP3-gIL2的重组乳酸杆菌的免疫效果。通过酶切将VP3基因和IL-2基因连接,并在其5′端连入乳酸杆菌的信号肽基因SP,亚克隆到乳酸杆菌整合表达载体pMJ67,电转化入干酪乳杆菌L.CECT5276,SDS-PAGE和Western blot法鉴定重组菌GPVVP3-gIL2融合蛋白的表达活性。将重组乳酸杆菌口服免疫雏鹅后检测血清GPV抗体、小肠黏液sIgA和脾淋巴细胞增殖情况,评价其免疫效果。结果表明,酶切和测序结果表明成功构建重组表达载体pMJ-SP-GPVVP3-gIL2,PCR证实质粒pMJ-SP-GPVVP3-gIL2成功整合到乳酸杆菌基因组;Western blot表明重组乳酸杆菌分泌表达的融合蛋白GPVVP3-gIL2能与GPV阳性血清特异性结合;淋巴细胞增殖试验表明口服重组菌后能特异地刺激脾淋巴细胞增殖,且在第4、5、6周明显高于GPV VP3组和gIL2组;重组乳酸杆菌口服免疫雏鹅可以产生抗VP3蛋白抗体,且具有中和活性的抗体显著高于GPV VP3组;小肠黏液sIgA细胞生成的数量自第2周较GPV VP3组和疫苗组显著上升。动物攻毒试验结果显示GPV VP3-gIL2融合蛋白免疫组能够获得85%的保护率,表明所构建的重组乳酸杆菌口服后对GPV的攻击具有较好的免疫保护作用。本试验成功构建能稳定表达GPV VP3-IL2融合蛋白的口服乳酸杆菌工程菌,为研究其作为口服疫苗奠定了基础。     

鹅细小病毒VP2基因在大肠杆菌中的表达及纯化

将鹅细小病毒 (GPV) VP2基因插入原核表达载体 p PROEX- HTb,获得重组表达质粒 p PROEX- HTb- VP2。将其转化大肠杆菌 DH5α,用 IPTG诱导表达 ,表达菌体蛋白中可产生与预期大小相符的约 72 0 0 0的蛋白。以光密度扫描对该表达产物进行定量分析 ,表达产物约占菌体总蛋白的 14 %。经 His- tag金属螯合层析纯化 ,获得纯度较高的 6 His- VP2融合蛋白。 Western- blot结果表明 ,所得蛋白与鹅抗 GPV高免血清有较好的免疫反应性 ,说明在 VP2的 N端融合 6个组氨酸不影响其与特异抗体结合的活性。     

鸡贫血病毒VP2蛋白单克隆抗体的制备

鸡贫血病毒是鸡传染性贫血病的病原体，它广泛存在于世界各地，成为危害养禽业的主要病原之一。鸡贫血病毒基因组含有3个开放阅读框架，分别编码分子量为51.6kDa（VP1）、24kDa（VP2）和13．6kDa（VP3）的3种蛋白质。本文将克隆化VP2基因亚克隆到PET-32a（＋）载体上并进行原核表达，用PET-32a（＋）表达的VP2融合蛋白免疫Balb/c小鼠，经过杂交瘤细胞的建立、融合细胞的筛选和克隆化培养，获得一株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为3C5。腹水单克隆抗体的ELISA效价为1：409600，经Western—blotting证明单抗3C5为针对VP2融合蛋白的单抗。为VP2融合蛋白的纯化和鸡贫血病毒的检测、鉴定和奠定了基础。     

番鸭细小病毒安徽分离株结构蛋白基因的克隆及序列分析

为研究番鸭细小病毒(MDPV)安徽分离株的遗传变异特征,通过PCR扩增获得了MDPV结构蛋白(VP)基因全长序列AH-MDPV-VP,并将该序列与GenBank中登录的12条MDPV和鹅细小病毒(GPV)VP基因序列进行比对。结果显示,AH-MDPV-VP基因全长2 199bp,包括完整的VP1、VP2和VP3蛋白编码区。MDPV与GPV的VP基因部分序列一致,但具有明显的差异。进化分析显示,MDPV安徽分离株与基因重组型MDPV上海分离株SAAS-SHNH为同一分支,亲缘关系较近。同源性分析显示二者核苷酸序列同源性最高,为99.9%,且AH-MDPV-VP与GPV毒株SHFX1201的序列同源性也有89.5%。此外安徽分离株与其他MDPV的VP1、VP2和VP3基因同源性有逐步下降的趋势,而与GPV则相反呈上升趋势。进一步显示MDPV安徽分离株与基因重组型MDPV上海分离株SAAS-SHNH相似,可能为MDPV和GPV基因重组型水禽细小病毒。     

鹅细小病毒VP3亚单位疫苗的制备及其免疫效果

为了研究鹅细小病毒(GPV) VP3亚单位疫苗的免疫效果,从ZJ-04分离株基因组DNA扩增VP1和VP3基因并克隆到pMD18-T载体,测定其核苷酸序列;将VP3基因亚克隆至质粒载体pET-32a(+),重组质粒pET-VP3用于转化E.coli BL-21(DE3)感受态细胞获得重组菌BL-VP3;以VP3重组蛋白和BL-VP3重组菌制备油乳剂疫苗免疫接种种鹅,用琼脂扩散试验检测血清GPV抗体,观察母源抗体对雏鹅GPV感染的免疫保护效果.结果表明,ZJ-04株VP1基因大小为2 199 bp,编码732个氨基酸,与Gen-Bank收录的GPV毒株的核苷酸序列同源性为95.3％～99.2％,氨基酸序列同源性为97.7％～99.3％;SDS-PAGE、Western blot检测结果表明,重组VP3分子质量约80 ku,能与GPV抗体发生特异性反应;VP3包涵体和BL-VP3重组菌均能诱导种鹅产生GPV抗体,新生雏鹅可获得良好的免疫保护.     

密码子优化型鹅细小病毒病毒样颗粒的表达与鉴定

根据昆虫细胞密码子的偏嗜性,对鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)VP2基因的密码子进行优化,利用Bac-to-Bac表达系统构建了表达优化VP2基因的重组杆状病毒,通过感染昆虫细胞(Sf9)获得病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)。SDS-PAGE分析显示Sf9细胞中出现了65 kDa的蛋白条带,间接免疫荧光(indirect immunofluorescent assay,IFA)和Western blot结果均证实表达产物能与鼠抗GPV VP2抗体发生特异性反应,说明其具有良好的免疫反应性。同时,试验结果还证明,密码子优化后的GPV VP2基因在昆虫细胞中表达量得到了提高,明显高于野生型VP2基因。透射电镜观察纯化后的昆虫细胞表达产物,可见直径约30 nm的VLPs,表明密码子的优化并不影响VP2蛋白的组装。本研究为进一步研制诊断抗原以及新型GPV疫苗等奠定了基础。     

鹅细小病毒VP3基因在昆虫杆状病毒表达系统中的表达

为真核表达鹅细小病毒（GPV）融合蛋白VP3基因,本研究通过PCR扩增GPV FY89株VP3基因,并将其克隆至杆状病毒转移载体pFastBac/HBM-TOPO中,经双酶切、PCR及测序鉴定正确后,转化感受态细胞DH10Bac,提取重组杆状病毒穿梭质粒rBacmid-VP3,将经PCR鉴定正确的rBacmid-VP3转染Sf9昆虫细胞,连续传代后,细胞病变明显。SDS-PAGE分析结果表明成功表达了分子质量约为61 ku的VP3蛋白;Western blotting分析结果表明重组VP3蛋白具有良好的抗原性。     

中国麇鹿朊蛋白核心片段的原核克隆表达与纯化

从采取的新鲜麋鹿血液中提取麋鹿基因组DNA,通过PCR的方法从麋鹿基因组中扩增麋鹿PrP蛋白核心片段的DNA,并分别在引物的5’和3’端引入EcoR I和HindⅢ两个酶切位点,下游引物将原序列TATTAC突变为TAATAA变成两个终止密码子。通过两个酶切位点将麋鹿PrP蛋白核心片段DNA连接到pET-32a(+),转化DH5α,通过酶切鉴定和PCR鉴定,筛选出阳性克隆送菌液测序,从测序结果分析阳性克隆是否符合要求。测序正确后将核心片段基因连接到pET-32a(+),阳性质粒命名为MPrP-pET-32a(+),阳性质粒转化E.coli BL21(DE3),进行诱导表达、蛋白质纯化鉴定。     

山羊痘病毒p32基因的克隆、表达及单克隆抗体制备

本研究旨在表达山羊痘病毒p32蛋白、制备p32蛋白单克隆抗体。通过PCR克隆p32基因,连接到pMD18-T并测序;酶切、连接后将p32基因克隆到pET28a(+)中,将重组质粒转化大肠杆菌Rosseta,在IPTG诱导下成功表达p32蛋白;利用亲和层析法纯化p32蛋白,用纯化蛋白免疫BALB/c小鼠后制备p32蛋白单克隆抗体,获得22株识别重组蛋白的单抗,通过间接免疫荧光鉴定,其中3株能识别病毒的p32蛋白。山羊痘病毒p32蛋白的表达和单克隆抗体的制备为山羊痘病毒抗原、抗体检测提供了生物材料。     

中国麇鹿朊蛋白核心片段的原核克隆表达与纯化

从采取的新鲜麋鹿血液中提取麋鹿基因组DNA,通过PCR的方法从麋鹿基因组中扩增麋鹿PrP蛋白核心片段的DNA,并分别在引物的5′和3′端引入EcoRⅠ和HindⅢ两个酶切位点,下游引物将原序列TATTAC突变为TAAT从变成两个终止密码子。通过两个酶切位点将麋鹿PrP蛋白核心片段DNA连接到pET-32a（＋）,转化DH5α,通过酶切鉴定和PCR鉴定,筛选出阳性克隆送菌液测序,从测序结果分析阳性克隆是否符合要求。测序正确后将核心片段基因连接到pET-32a（＋）,阳性质粒命名为MPrP-pET-32a（＋）,阳性质粒转化E.coli BL21（DE3）,进行诱导表达、蛋白质纯化鉴定。     

鹅细小病毒NS2基因的原核表达及抗原性检测

为原核表达鹅细小病毒(GPV)NS2蛋白,本研究利用特异性引物扩增获得GPV的H1分离株NS2基因,将其克隆于pMD18-T载体后进行序列测定。并将NS2基因亚克隆于原核表达载体pGEX-6P-1中,获得重组质粒pGEX-NS2。该质粒转化于感受态菌BL21(DE3)plysS中,经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳分析,表达的重组蛋白约为75ku左右。经过亲和层析方法获得了纯化的重组NS2蛋白。Westernblot和Dot-ELISA鉴定结果表明,表达的重组NS2蛋白可以与GPV阳性血清发生特异性反应。     

荣昌猪白细胞介素-2基因的原核表达

应用DNA重组技术,将克隆的荣昌猪白细胞介素-2基因亚克隆到PET-32a( )表达载体上,构建重组表达载体。酶切鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21,用1 mM的HPTG诱导表达重组蛋白。RT-PCR方法检测表明白细胞介素-2基因得到了转录;对表达蛋白进行SDS-PAGE电泳,发现在相对分子质量约37 Ku处有明显的蛋白质条带,而对照组无相应条带产生。最后用MTT法检测表达蛋白的生物学活性,表明所获得的重组蛋白具有较好的生物学活性,这为利用该蛋白及其基因研制高效抗病免疫制剂和基因工程疫苗奠定了良好的基础。     

布鲁菌外膜蛋白OMP10表达及其抗原性的研究

设计1对特异性引物对羊布鲁菌16M总DNA进行外膜蛋白omp10的PCR扩增,得到了一个大小为330 bp的目的基因片段(去掉17个氨基酸编码的信号肽),测序证实它与国外报道的羊布鲁菌omp10基因完全一致.将其克隆到表达载体PET-30a中,经酶切、PCR扩增和测序分析,表明重组表达载体构建成功.将此重组质粒转化入大肠埃希菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,该基因以包涵体的形式在大肠埃希菌中表达,经过包涵体的变性、复性和亲和层析纯化,成功获得大小为14.2 ku的融合蛋白,与理论推测的蛋白分子质量一致;Western blot和间接ELISA试验证明,纯化之后的OMP10重组蛋白可以被布鲁菌阳性血清识别.     

山羊痘病毒P32基因重组表达载体的构建及原核表达

以含山羊痘病毒贵州LD株P32基因的质粒pMD18-T-P32/LD为模板,应用PCR方法扩增P32基因,将该基因片段克隆至原核表达载体pET-28a,构建了重组表达载体pET-28a-P32/LD,转化大肠杆菌BL21(DE3)中并诱导表达。SDS-PAGE分析结果显示,有分子量约为35.5 ku的融合蛋白获得表达,与预期结果相符;Western-Blotting证实该表达蛋白具有免疫学活性。P32蛋白的成功表达为山羊痘基因工程疫苗的研制及诊断方法的建立奠定了基础。     

胸膜莫肺炎放线杆菌APXIV部分基因片段的表达及纯化

参照GenBank中已发表的ApxⅣ基因序列,以自行分离的AppDNA为模板,利用PCR方法扩增出ApxⅣ3’端,大小为552bp的保守基因序列。将PCR产物克隆到pMD18-T Simple Vector中,获得重组质粒pMD-ApxⅣ,对其重组质粒pMD-ApxⅣ进行BamHI、HindIII双酶切,并将酶切产物克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,构建了重组表达质粒pET-ApxⅣ。将表达质粒转化至大肠杆菌BL21中,用IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE和Western blot分析,结果表明pET-ApxⅣ在BL21中成功表达,并能被App阳性血清所识别,具有良好的免疫原性。表达蛋白的分子质量约为39.5KDa。利用HiTrapFFcrude columns将表达的蛋白进行了纯化。     

吉林白鹅α干扰素在大肠杆菌中的表达及抗病毒活性检测

用PCR方法扩增了吉林白鹅α干扰素(IFN-α)成熟肽编码序列,将IFN-α片段定向插入原核表达载体pGEX-6p-1中,构建重组质粒pGEX-IFN-α,将重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞里,在IPTG诱导下表达可溶性的融合蛋白(GST-IFN-α)。SDS-PAGE、Western-blot检测结果表明,重组吉林白鹅IFN-α融合蛋白(rGoIFN-α)的分子量大小约为43ku,能与IFN-α抗血清发生特异性结合反应。重组吉林白鹅α干扰素经谷胱甘肽Sepharose-4B亲和柱层析纯化后,在鸭胚成纤维细胞上抗鹅细小病毒的活性为3.32×105 U/mg,本试验结果表明,该表达系统能够表达重组鹅α干扰素,且表达的重组鹅α干扰素具有一定的抗病毒活性。     

猪附红细胞体ORF2的全基因合成、表达与鉴定

通过重叠区扩增法（PCR-based accurate synthesis,PAS）人工合成猪附红细胞体ORF2基因,并使其在大肠杆菌（DE3）中高效表达。根据GenBank注册的AJ504999的ORF2基因序列,选择大肠杆菌偏爱的密码子,设计并合成11对寡核苷酸片段,用PAS方法,人工合成ORF2基因。基因克隆入pMD18-T载体,经测序证实正确后,连接到表达载体PET-28a,获得重组表达质粒PET-28a/ORF2,导入大肠杆菌BL21（DE3）,在37℃,IPTG终浓度1mmol/L的条件下诱导表达,经SDS-PAGE分析,Western-blot鉴定,在35 000附近出现目的片段。同时通过生物信息学软件对其蛋白二级结构及抗原表位等方面进行预测。