球根鸢尾3种主要病毒多重RT-PCR检测体系的建立

根据GenBank中已发表的鸢尾轻花叶病毒(Iris mild mosaic virus,IMMV)、水仙潜隐病毒(Narcissus latent virus,NLV)和菜豆黄花叶病毒(Bean yellow mosaic virus,BYMV)外壳蛋白(CP)基因序列保守区域分别设计特异性引物,通过优化多重PCR反应条件,建立能同时检测球根鸢尾3种病毒的多重PCR检测体系。该体系能够一次扩增出IMMV、NLV和BYMV的特异片段,其大小分别是770bp、266bp和186bp。测序结果表明,3种病毒序列与相应的参考序列相似性均达98%以上。灵敏度测定结果表明,从相当于或大于10-2 mg的感病植物组织中能够检测到这3种病毒。     

文心兰3种主要病毒多重RT-PCR检测体系的建立

根据GenBank中已发表的建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,CyMV)、齿兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus,ORSV)和菜豆黄花叶病毒(Bean yellow mosaic virus,BYMV)外壳蛋白(CP)基因序列保守区域分别设计特异性引物,通过优化多重PCR反应条件,建立能同时检测文心兰3种病毒的多重PCR检测体系。该体系能够一次扩增出CyMV、ORSV和BYMV的特异片段,其大小分别是551、325和212bp。测序结果表明,3种病毒序列与相应的参考序列相似性均达98%以上。灵敏度测定结果表明,从相当于或大于10-2 mg的感病植物组织中能够检测到这3种病毒。     

3种大白菜病毒多重RT-PCR检测技术的建立

【目的】建立3种大白菜病毒病多重RT-PCR检测技术,为病毒病快速检测、白菜病毒病防治与抗病育种提供参考。【方法】针对我国大白菜芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus,TuMV)、烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)和黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)3种病毒的外壳蛋白(CP)基因保守区序列,设计特异性检测引物,从多重RT-PCR(mRT-PCR)扩增引物、Mg~(2+)浓度、Taq DNA聚合酶及dNTPs浓度、退火温度、延伸时间和循环次数等方面对RT-PCR检测技术进行优化。【结果】在dNTPs浓度为0.24 mmol/L,Mg2+浓度为2.8mmol/L,Taq DNA聚合酶浓度为0.12U/μL,退火温度为52℃,延伸时间为30s,循环30次,即可成功地在一个体系中对TuMV、TMV和CMV 3种病毒复合侵染的大白菜病样进行多重RT-PCR扩增,扩增得到228,305和460bp3条特异性条带,其大小与试验设计相符合。灵敏度接近单重RT-PCR(sRT-PCR),体现了多重RT-PCR的优越性。【结论】建立了能同时检测大白菜样品中TuMV、TMV和CMV的多重RT-PCR检测体系,该多重RT-PCR方法能对田间大白菜样品进行3种病毒的准确、快速、高效检测。     

半夏3种花叶病毒的mRT-PCR鉴定及遗传进化分析

半夏(Pinellia ternata)因长期无性繁殖导致病毒病高发。本研究以河北安国疑似病毒感染的半夏为材料，通过优化扩增反应体系及反应程序，建立了可以同时检测黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus, CMV)、大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus, SMV)和芋花叶病毒(Dasheen mosaic virus, DsMV)的多重RT-PCR体系，RNA稀释10⁶倍时亦能同时检测3种病毒。对侵染病毒外壳蛋白进行基因克隆和遗传进化分析，结果表明CMV的外壳蛋白编码区序列为657 bp，与浙江侵染半夏的CMV(DQ399550.1)序列相似性高达96.16%，与感染其他寄主的病毒序列差异较大；SMV和DsMV外壳蛋白序列分别为843和828 bp，与同种株系遗传变异度分别达到0.38和0.37以上，独立为1个进化支。生物信息学统计分析发现，病毒外壳蛋白序列高度保守，具有较为丰富的变异位点，碱基转换率大于颠换率，CMV AT偏倚度大于GC,SMV、DsMV与之相反。研究结果为半夏病毒检测和脱毒提供了技术和理论基础。     

百合病毒的高通量测序鉴定和RT-PCR检测

为明确百合在生产中被病毒侵染的情况,利用高通量测序技术对云南、浙江等地的百合染病样品进行病毒鉴定,通过序列比对和拼接,获得了车前草花叶病毒(plantago asiatica mosaic virus,PlAMV)、百合斑驳病毒(lily mottle virus,LMoV)、大丽花花叶病毒(dahlia mosaic virus,DMV)、黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus,CMV)、玄参花叶病毒(figwort mosaic virus,FMV)、玫瑰黄脉病毒(rose yellow vein virus,RYVV)、大丽花普通花叶病毒(dahlia common mosaic virus,DCMV)、木薯脉花叶病毒(cassava vein mosaic virus,CsVMV)等8种已知病毒和2种未知病毒的序列信息。对从云南、浙江、江西、上海、广东、湖南6个省(市)采集的48份百合样品进行了上述8种病毒的RT-PCR检测。结果显示,在百合样品中,DMV、RYVV、PlAMV和LMoV发生普遍,检出率均高于95%,FMV检出率高于85%,CMV检出率最低,且...     

黄瓜花叶病毒荧光定量PCR检测方法的建立

【目的】建立检测香蕉中黄瓜花叶病毒Cucumber mosaic virus(CMV)的实时荧光定量方法.【方法】根据CMV外壳蛋白(CP)保守序列设计了TaqMan实时荧光定量PCR特异性探针及引物,优化反应体系检测TaqMan探针实时荧光定量方法的灵敏度、特异性和重复性.【结果和结论】该方法检测灵敏度为4.2×102μL-1,比普通PCR高100倍,且与香蕉束顶病毒Banana bunchy top virus(BBTV)、香蕉线条病毒Banana streak virus(BSV)无交叉反应,特异性和重复性都较好.用实时荧光定量PCR检测14份田间香蕉样品有5份样品为阳性,进一步证明建立的实时荧光定量方法可用于香蕉CMV的检测.     

云南、黑龙江两省南瓜主要病毒病原种类鉴定

应用电镜、酶联免疫吸附测定(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)方法检测了云南、黑龙江两省南瓜病毒病病原种类。研究结果表明,云南省南瓜病毒病原种类较多,检测到番木瓜环斑病毒西瓜株系(Papararingspot virus W,PRSV-W)、西葫芦黄色花叶病毒(Zucchini yellow mosaicvirus,ZYMV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、粉虱传双生病毒(Whitefly-transmitted geminivirus,WTGs)。黑龙江省检测到两种病毒:西瓜花叶病毒2号(Watermelon mosaic virus 2,WMV-2)、黄瓜花叶病毒(CMV)。两省样品的电镜检测均观察到了番茄斑萎属病毒(Tospovirus)。     

小麦3种病毒病BSMV、BYDV-PAV、WYMV及WBD植原体病害的多重PCR同步检测

 【目的】通过对检测小麦病毒病和植原体病害的多重PCR体系各成分和循环参数进行摸索和优化,建立了一种同时检测大麦条纹花叶病毒（barley stripe mosaic virus,BSMV）、大麦黄矮病毒PAV株系（barley yellow dwarf virus,BYDV-PAV）、小麦黄花叶病毒（wheat yellow mosaic virus,WYMV）和小麦蓝矮植原体（wheat blue dwarf,WBD）的多重PCR技术体系。【方法】运用根据3种病毒核苷酸保守区序列设计的特异性引物对、根据WBD植原体核糖体蛋白基因序列设计特异性引物对rpF1/R1,从影响多重PCR（M-PCR）扩增的引物浓度、Mg2+浓度、Taq DNA聚合酶浓度、dNTPs浓度、退火温度等方面进行多重PCR体系的优化。【结果】成功的在一个体系中对BSMV、BYDV-PAV、WYMV和WBD复合侵染的小麦材料进行多重PCR扩增,得到503、600、898、1 240 bp 4条特异性大小与试验设计相符的条带,建立了同时检测4种病原的多重PCR体系。【结论】该体系实现了植原体DNA病原和病毒RNA病原的同时检测,体现了多重PCR的优越性。     

高粱红条病病原的分子鉴定

从山西高粱红条病病叶中得到一种病毒分离物,命名为GL-SX.根据甘蔗花叶病毒亚组(SCMV subgroup)外壳蛋白(CP)基因C-端和复制酶(NIb)基因C-端的保守序列设计引物,对GL-SX进行免疫捕获反转录PCR (IC-RT-PCR) 扩增,获得一条长约1.1 kb的扩增片段,扩增片段克隆后测定序列,该序列含1087个核苷酸(nt),编码362氨基酸(aa),取其中的近全长CP氨基酸序列(296 aa)与甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus, SCMV)、玉米矮花叶病毒 (Maize dwarf mosaic virus, MDMV)、高粱花叶病毒(Sorghum mosaic virus, SrMV)和约翰逊草花叶病毒(Johnsongrass mosaic virus, JGMV) 等4种病毒的对应序列进行同源性比较,结果与SCMV的同源性最高(95.3%),而与SrMV、MDMV和JGMV等3种病毒的同源性相对较低,依次为69.3%、69.1%和55.4%.根据Potyvirus属病毒种类划分的标准,将GL-SX鉴定为SCMV.将GL-SX的近全长CP氨基酸序列与SCMV种内各分离物的对应序列进行同源性比较及构建关系树,结果显示GL-SX与SCMV-MDB具有较远缘的种内亲缘关系,而与德国的一个SCMV玉米分离物(SCVM-Hoe)及中国的两个玉米分离物(SCMV-ZJ和SCMV-BJ)具有很高的同源性.     

马铃薯3种病毒的多重PCR检测方法构建

[目的]构建马铃薯A病毒（Potato virus A,PVA）、烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）、马铃薯Y病毒（Potato virus Y,PVY）3种马铃薯主要易受感染的病毒多重PRC（multiplex PCR）检测方法。[方法]根据GenBank公布的PVA、TMV、PVY基因序列分别设计引物,建立3种马铃薯病毒的多重PCR方法;通过构建3种病毒PCR扩增目的基因的质粒用于制备标准品进行敏感性验证,利用PVX（Potato virus X）、PVM（Potato virus M）、PVS（Potato virus S）、PVV（Potato virus V）,CMV（Cucumber mosaic virus）等其他马铃薯病毒进行特异性试验;并对11份疑似发生病毒病的马铃薯块茎采集样品进行了检测。[结果]研究中构建的马铃薯3种病毒多重PCR检测方法,最低检测下限：PVA为100 copies/2μl,PVY为100 copies/2μl,TMV为1 000 copies/2μl,与PVX、PVM、PVV、PVS、CMV等其他马铃薯病毒无交叉反应,具有良好的特异性;11份疑似发生病毒病的马铃薯块茎中7份样品检出3种病毒感染阳性。[结论]该研究成功构建了马铃薯PVA、TMV、PVY病毒的多重PCR方法,为马铃薯病毒检测技术应用奠定一定基础。     

豇豆花叶病毒和黑眼豇豆花叶病毒RT-Realtime PCR及IC-RT-Realtime PCR检测方法研究

建立了豇豆两种种传病毒豇豆花叶病毒(CPMV)和黑眼豇豆花叶病毒(BlCMV)RT-Realtime PCR检测方法以及双重RT-Realtime PCR检测方法。在此基础上,根据免疫学抗原抗体特异性吸附的特点,建立了CPMV和BlCMV免疫捕获反转录荧光定量(IC-RT-Realtime)PCR检测方法以及双重IC-RT-Realtime PCR检测方法。该单重及双重IC-RT-Real-time PCR检测方法具有灵敏度高、特异性强和稳定性好等优点,适用于豆类种苗中对CPMV和BlCMV的检测。     

马铃薯三种病毒的多重PCR检测方法构建(英文)

[目的]构建马铃薯A病毒(Potato virusA,PVA)、烟草花叶病毒(Tobacco mosaicvirus,TMV)、马铃薯Y病毒(Potato virusY,PVY)3种马铃薯主要易受感染的病毒的多重PRC(multiplex PCR)检测方法。[方法]根据GenBank公布的PVA、TMV、PVY基因序列分别设计引物,建立3种马铃薯病毒的多重PCR方法;通过构建3种病毒PCR扩增目的基因的质粒用于制备标准品进行敏感性验证,利用PVX(Potato virus X)、PVM(Potato virus M)、PVS(Potato virus S)、PVV(Potato virus V),CMV(Cucumber mosaic virus)等其他马铃薯病毒进行特异性试验;并对11份疑似发生病毒病的马铃薯块茎采集样品进行了检测。[结果]研究中构建的马铃薯3种病毒多重PCR检测方法,最低检测下限:PVA为100落copies/2μl,PVY为100copies/2μl,TMV为1000copies/2μl,与PVX、PVM、PVV、PVS、CMV等其他马铃薯病毒无交叉反应,具有良好的特异性;11份疑似发生病毒病的马铃薯块茎中7份样品检出3种病毒感染阳性。[结论]研究成功构建了马铃薯PVA、TMV、PVY病毒的多重PCR方法,为马铃薯病毒检测技术应用奠定一定基础。     

鸡3种主要DNA病毒多重感染复合PCR检测方法的建立

依据Gen Bank中注册的鸡马立克氏病病毒(MDV)、鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)、鸡痘病毒(FPV)基因组核苷酸序列中的保守序列设计引物,3种病毒各设计3对引物,共计9对引物,经生物学软件筛选后,得到3对相互匹配较佳的引物。3对匹配引物经单一PCR验证后,优化复合PCR反应条件,确定最佳的退火温度、引物浓度和Taq DNA聚合酶浓度;经特异性、敏感性试验及简化PCR试验,建立简易复合PCR检测方法。复合PCR扩增出的3条带大小与预期一致,即228 bp(MDV)、400 bp(ILTV)、499 bp(FPV);建立的复合PCR方法能同时检测出100 fg MDV、ILTV、FPV的DNA。同时依据PCR技术原理,将经典的三温热循环改进为二温热循环试验,即将退火和延伸合并为一步(62℃),缩短了反应时间。建立的3种病毒的复合PCR检测方法具有较高的特异性和敏感性,可以用于临床病料的快速诊断。     

一种快速提取烟草病毒的方法

为寻找高效快速提取植物总RNA的检测方法,以白肋烟叶片为材料,用Trizol试剂盒提取总RNA。依据黄瓜花叶病毒和马铃薯X病毒的外壳蛋白保守序列设计特异性引物,进行RT-PCR检测,从感病叶片中分别扩增出326bp、392bp的目的片断,而对照叶片中无此扩增带。将PCR产物连接pGEM-T载体上,转化大肠杆菌DH5α,得到了含有目的片断的重组子。序列分析表明,与Gene Bank中报道的这两种病毒核苷酸序列进行比较,同源性均达到96%以上。从而证明Trizol试剂盒可以在1 h内提取到纯度高、含量高、完整性好的总RNA,快速、简便、可靠。     

建立环介导间接PCR同时检测3种主要猪源性病毒

 【目的】建立同时检测猪圆环病毒2型（PCV2）、猪瘟病毒（CSFV）和猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的环介导间接PCR方法,实现3种病毒快速检测。【方法】根据GenBank数据库中猪圆环病毒2型（PCV2）、猪瘟病毒（CSFV）和猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的核苷酸序列设计3对特异性探针,利用PCR技术分别标记于大豆Lectin基因片段的两端形成3种不同的报告基因,此标记的报告基因与3种待测靶标基因经杂交、缺口补平、环化后,采用1对引物反向PCR扩增报告基因,建立了PCV2、CSFV和PRRSV的环介导间接PCR检测方法,扩增片段大小分别为564 bp、434 bp和338 bp,该方法即可用于单病毒检测又可用于多病毒检测。【结果】灵敏度和特异性试验结果表明,无论是单病毒检测还是多病毒检测,该法都具有高度特异性,与其它病原检测无明显交叉反应;对PCV2、CSFV和PRRSV 3种病毒同时检测的底限分别为0.8、25和6.2 pg•μL-1,和单个病毒的检测灵敏度相同。利用环介导间接PCR和常规PCR对20份临床样本进行比较检测,结果表明,无论单病毒检测还是多病毒检测,其结果均与常规PCR检测结果完全一致。【结论】环介导间接PCR检测技术可用于PCV2、CSFV和PRRSV 3种病毒的同时检测,是一种简便快速、灵敏、特异的病原学诊断工具。     

侵染荷兰郁金香的郁金香碎色病毒和黄瓜花叶病毒的RT-PCR检测

以从荷兰引进的4个郁金香品种病株为材料,利用马铃薯Y病毒的简并引物和黄瓜花叶病毒CP基因的一对特异引物,通过RT-PCR技术分别扩增出与预期大小相一致的1 800 bp和840 bp左右的片段,而对照无任何产物.感受态转化后,进行测序,结果表明田野、多道多、雪莉和克思尼4个品种中均能检测到郁金香碎色病毒和黄瓜花叶病毒.     

香蕉束顶病毒复制酶和黄瓜花叶病毒衣壳蛋白融合基因植物表达载体的构建

利用重组PCR技术将香蕉束顶病毒的复制酶基因和黄瓜花叶病毒的衣壳蛋白基因融合重组,并与植物表达载体pBI121连接,构建了抗香蕉束顶病和香蕉花叶病的双价植物表达载体,通过冻融法转化载体人根癌农杆菌LBA4404,获得了工程农杆菌pBI121．FBC,从而为培育抗病转基因香蕉品种奠定了基础．     

双重一步法RT-PCR检测2种主要兰花病毒

[目的]研究建兰花叶病毒（CymMV）和齿兰环斑病毒（ORSV）双重一步法RT—PCR检测方法,为病毒的早期快速诊断提供技术支持。[方法]根据2种病毒的外壳蛋白基因的保守序列分别设计两对特异性引物,并进行双重与单一RT—PCR对比试验。[结果]结果在健康蜘蛛兰被人工接种病毒后第10天和第21天用一步法RT-PCR方法分别获得CymMV和ORSV与预期相符的约764和946bp扩增产物务带;且双重一步法RT—PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后,出现两务与单一RT—PCR产物相对应的清晰务带,获得较理想的检出效果;扩增产物的核酸序列经BLAST分析,同源性均在85％以上,证实了检测结果的准确性。[结论]该方法具有更加灵敏、特异、快速和简便的特点,适合于两种主要兰花病毒的同时快速检测。     

福建长汀小米椒病毒病的病原鉴定

1987—1988年从小米椒的主要产地长汀县采回具有花叶、叶片斑驳、皱缩、畸形.叶脉肿大、黄化、小叶和侧枝丛生等病株的标样189份,经5科10种鉴别寄主的传染性试验、血清学反应(酶联免疫吸附测试)和电子显微镜观察,鉴定出4种小米椒病毒病原:马铃薯 X 病毒(PVX),马铃薯 Y 病毒(PVY),烟草花叶病毒(TMV)和黄瓜花叶病毒(CMV).其中复合感染的样本占42.9%,病毒病原为 PVX,PVY 2种或 PVX,PVY,TMV 3种病毒的复合感染,其中以 PVX,PVY TMV 3种病毒感染占优势,为29.75%,是为害小米椒的主要毒源种类;单独浸染的样本88份,占46.6%,其中 PVX 占18.1%,PVY13.9%,TMV9.06%,CMV5.5%;未知病原样本20份占10.6%.