针对fimW基因沙门氏菌的特异性PCR检测

为建立沙门氏菌快速检测方法,本研究根据沙门氏菌Ⅰ型菌毛蛋白调控基因fimW设计一对引物,建立PCR检测方法,并对收集的A群～F群14个血清型40株沙门氏菌和5种12株非沙门氏菌菌株进行PCR扩增.结果显示所有沙门氏菌均扩增出与预期(477 bp)相符的特异性片段,而非沙门氏菌扩增结果均为阴性.另外,以肠炎沙门氏菌50336株DNA为模板,敏感性试验结果显示该方法可以检测出扩增体系中1pg DNA染色体和102cfu的沙门氏菌.表明本研究建立了检测沙门氏菌简洁、敏感、特异的PCR方法.     

基于等位基因特异性PCR原理建立鸡白痢沙门氏菌PCR方法

根据鸡白痢沙门氏菌与鸡伤寒沙门氏菌的rfbS基因在第237和598位碱基的不同,设计和合成等位基因特异性PCR引物,建立快速检测鸡白痢沙门氏菌的PCR方法,并应用该法对鸡白痢沙门氏菌临床分离样品进行了PCR鉴定。结果显示,该PCR方法能特异性地鉴定鸡白痢沙门氏菌,检测灵敏度达18 pg/μL DNA,4.7×10⁴ CFU/mL菌液,表明建立的等位基因特异性PCR方法能准确而快速地鉴定鸡白痢沙门氏菌。     

双重PCR检测肠炎沙门氏菌方法的建立

沙门氏菌是引起人类食物中毒事件的主要病原之一,其中,肠炎沙门氏菌因其可感染家禽、污染禽蛋而受到广泛关注。本试验根据沙门氏菌属特异性基因片段fimY和肠炎沙门氏菌特异性基因片段sdfI分别设计一对引物,对25株沙门氏菌和大肠杆菌进行双重PCR扩增,结果显示22株沙门氏菌均出现与理论值大小497bp相符的属特异性条带,作为对照的3株大肠杆菌则未显示该条带,并且7株肠炎沙门氏菌均出现与理论值大小293bp相符的特异性条带。另外,敏感性试验结果显示肠炎沙门氏菌50336和鸡白痢沙门氏菌SP1的模板浓度分别为18ng和15ng时仍能清晰扩增出特异性条带。上述结果表明建立的PCR方法具有快速简便、灵敏性高、特异性强等特点,为公共卫生、食品安全、畜牧兽医及出入境安检等多部门检测和监测沙门氏菌提供了前提基础和技术保障。     

鸡白痢沙门氏菌PCR检测技术的建立与应用

为鸡沙门氏菌的临床检测提供了一种更快速、敏感、特异的诊断,参照GeneBank中已公布的的鸡白痢沙门氏菌fliC基因序列,合成出了一对引物,使用PCR法对1株沙门氏标准菌株和其他3株非沙门氏菌标准菌株进行DNA抽提扩增并检测其敏感度。采用上述技术,对12份可疑病料及10份饲料进行PCR检测,同时与传统检测方法进行比较。结果表明1株沙门氏菌PCR产物出现600 bp的特异性DNA扩增带,而非沙门氏菌均未出现扩增条带,证明所设计引物具有沙门氏菌特异性;通过敏感度检测,此PCR体系能检出50 pg以上的细菌DNA,敏感性较高。运用PCR法阳性检出率及敏感性均高于常规检测方法。由此可见,沙门氏菌PCR检测是一种快速、敏感和高度特异的诊断方法。     

基于pegB基因的鸡白痢沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌分子鉴别方法的建立

为建立一种能快速、准确、简便区分鸡白痢沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌的方法，研究通过对鸡白痢沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌pegB序列进行分析，发现存在3个单核苷酸多态性位点，基于此建立了一种特异性PCR方法用于鉴别鸡白痢沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌。结果显示，该方法特异性强、耗时短，检测限为10.14 pg/反应。临床样品检测表明，该方法不仅具有良好的特异性，且操作比传统方法更为简便。该方法的建立为准确区分鸡白痢沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌提供了实用技术，将在分子检测中发挥重要作用。     

鸡白痢沙门氏菌病原的分离鉴定及耐药性分析

为鉴定新疆某些地区鸡白痢沙门氏菌主要流行株的流行现状和耐药情况,本研究采用平板凝集试验方法对有发病史的种鸡场进行现场检测,被检的750只鸡中,发现78例疑似鸡白痢沙门氏菌感染,运用沙门氏菌鉴别培养基、组织病理学观察和PCR方法进行确诊,并进行药敏试验。结果显示,疑似的78例鸡白痢沙门氏菌中有69例符合鸡白痢沙门氏菌的生化特性和病理学特点,PCR成功扩增出invA基因,分离率为9.2%,血清型诊断为D1型;其中分离菌对万古霉素和新霉素耐药性最高,耐药率分别为100.0%和81.2%,而对头孢曲松、克拉维酸和多黏菌素的敏感率达60.0%以上。本研究为养殖户和兽医工作者在净化鸡白痢沙门氏菌及临床用药方面提供参考。     

西藏拉萨市鸡源沙门氏菌分子生物学鉴定与血清分型

鸡源沙门氏菌作为重要的食源性病原菌,其血清型分布和致病性研究对于维护公共卫生安全具有重要意义。本研究分别在西藏拉萨市养鸡密集的城关区、曲水县、达孜县、墨竹工卡县、堆龙德庆县5个地区,选择12个养鸡场,采集疑似发病鸡样品121份,最终分离鉴定出104株沙门氏菌。血清学鉴定结果显示,这104株沙门氏菌分属于4个血清群,其中A群(O2)13株、C1群(O7)29株、C2群(O8)9株、D群(O9)53株;优势血清群为D群(51%),其次为C1群(27%)。PCR扩增结果显示,这104株沙门氏菌和标准阳性对照均扩增出inv A基因片断,表明均为致病性沙门氏菌。动物致病性试验结果显示,7日龄雏鸡接种后感染率可达100%。上述结果表明,拉萨市鸡源沙门氏菌流行较为普遍,且均有致病性,会对当地禽产品卫生安全带来威胁,因此西藏地区需要加强鸡源沙门氏菌的控制。     

PCR扩增invA基因特异性检测沙门氏菌

建立了扩增invA基因检测沙门氏菌的PCR方法。对收集的50个血清型123株沙门氏菌及7种27株非沙门氏菌进行PCR,2％琼脂糖电泳检查,结果所有沙门氏菌都扩增出了300bp的特异性产物,非沙门氏菌都未扩增出此目的条带。产物的特异性由slot blot杂交进一步证实。通过电泳判定结果,该法可检出扩增体系中10pg染色体DNA及10~2cfu的纽波特沙门氏菌50029。为下步克隆而设计的两个酶切点（Bam HI,Eco RI）对引物的特异性没有影响。本研究为沙门氏菌的检测提供了简洁、敏感、特异的新方法,同时为克隆invA基因做属特异性探针打下了基础。     

饲料中沙门氏菌的PCR检测方法研究

研究应用PCR技术建立饲料中沙门氏菌的快速检测方法,根椐沙门氏菌的invA基因核苷酸序列设计1对特异性引物,分别对4种沙门氏菌的标准菌株及2种非沙门氏菌株进行PCR扩增。结果:4种沙门氏菌均扩增出331bp的特异条带,非沙门氏菌皆无特异条带,特异性达100%,敏感性达104cfu/ml。DNA序列分析证实,所扩增片段为沙门氏菌的invA基因的特异性片断。本研究建立的沙门氏菌检验方法具有较高的特异性和灵敏性,invA基因的序列分析表明,其基因序列较保守,可以做为PCR检验的目的模板。     

鸡白痢沙门菌等位基因特异性PCR检测方法的建立

根据鸡白痢沙门菌与鸡伤寒沙门菌的rfbS基因在第237和第598位碱基的不同，设计和合成了等位基因特异性PCR引物，建立了快速检测鸡白痢沙门菌的PCR方法，并应用该方法对鸡白痢沙门菌临床分离样品进行了PCR鉴定。结果显示，该PCR方法能够特异性地鉴定鸡白痢沙门菌，检测灵敏度达100PgDNA。对35个经常规方法鉴定的鸡白痢沙门菌分离株应用等位基因特异性PCR方法进行鉴定，鉴定出33株鸡白痢沙门菌，符合率为94．3％。表明，建立的等位基因特异性PCR方法能够准确而快速地鉴定鸡白痢沙门菌。     

超级细菌bla_(NDM-1)基因TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法的建立

为建立快速检测超级细菌编码新德里金属β-内酰胺酶1(NDM-1)的bla_(NDM-1)基因的方法,本研究针根据bla_(NDM-1)及其变异体的基因序列设计一对特异性引物和一条MGB探针,以构建的含有bla_(NDM-1)基因片段的重组质粒作为阳性标准品,经条件优化,建立了检测bla_(NDM-1)基因的TaqMan-MGB荧光定量PCR方法。结果显示该方法可以特异性扩增bla_(NDM-1)基因重组质粒标准品,而对鸡白痢沙门氏菌、大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌和鼠伤寒沙门氏菌的标准菌株扩增均为阴性;检出下限为2.59拷贝/μL,比常规PCR敏感性高100倍;组内及组间重复性试验的变异系数均小于1.5%。利用所建立的方法对34株鸡源致病性沙门氏菌分离株进行检测,结果均未检测到目的片段,表明所有分离株均未携带bla_(NDM-1)基因。本研究建立的TaqMan-MGB荧光定量PCR方法特异性强、敏感性高、重复性好,可用于监测携带bla_(NDM-1)基因及其变异体的超级细菌。     

山东省鸡源沙门氏菌的分离鉴定及毒力基因分析

本研究旨在调查山东地区鸡源沙门氏菌的流行情况及毒力基因分布。在山东地区规模化养鸡场采集病料,利用四硫磺酸钠煌绿增菌液（TTB）进行沙门氏菌选择增菌,并对分离菌株进行纯化培养、革兰氏染色、生化试验、培养基菌落形态鉴定,利用沙门氏菌属及血清型特异性引物对分离菌进行PCR扩增鉴定,并利用PCR方法检测分离菌中33种毒力基因分布。结果显示,分离菌在LB固体培养基和麦康凯培养基上呈无色半透明、光滑且边缘整齐的菌落,镜检为革兰氏阴性、两端钝圆的小杆菌。生化试验、培养基菌落形态鉴定、沙门氏菌属及血清型特异性引物PCR扩增结果显示,共分离到25株鸡源沙门氏菌,其中肠炎沙门氏菌9株,鸡白痢沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌各8株。毒力基因检测结果显示,33种毒力基因在25株分离菌中均有检出,其中20种毒力岛基因（invJ、virK、sopA、mogA、hilA、hisJ、ssaB、ssaQ、ssiD、misL、mgtC、orf319、siiE、siiD、bcfA、pipC、sopB、araB、spoB和avrA基因）、肠毒素基因（stn基因）及菌毛毒力基因（fimA基因）检出率均为100%;2种毒力岛基因（sipA和sodC基因）及4种毒力质粒基因（spvA、spvC、spvD和spvR基因）检出率均为96%,spoE基因检出率为68%,fliC基因检出率为36%,gipA与spvB基因检出率均为32%,sseL基因检出率为4%;25株鸡源沙门氏菌中,分别携带31种（8株）、30种（1株）、29种（15株）和24种（1株）毒力基因;毒力基因gipA和spvB只在鼠伤寒沙门氏菌中检出,且在鼠伤寒沙门氏菌中检出率为100%。本研究结果表明,山东地区鸡源沙门氏菌主要为肠炎沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌,分离菌皆携带多种毒力基因,其中gipA和spvB毒力基因只在鼠伤寒沙门氏菌中检出,可作为鼠伤寒沙门氏菌鉴定的备选基因之一。     

鸡白痢与鸡伤寒沙门菌双重PCR方法的建立和初步应用

分析不同血清型/生物型沙门菌全基因组序列筛选出鸡白痢和鸡伤寒沙门菌特异性基因组序列,设计两对引物,建立双重PCR方法鉴别检测鸡白痢和鸡伤寒沙门菌不同生物型,并进行初步的临床应用。双重PCR方法结果显示,鸡白痢沙门菌显示417 bp条带,鸡伤寒沙门菌显示417 bp和636 bp两个条带,而阴性对照未出现条带,与预期设计相符。双重PCR体系对56株不同血清型沙门菌鉴定结果与细菌学分离的血清型鉴定结果完全一致,说明本试验建立的双重PCR体系特异性良好,应用上述方法检测鸡场疑似20份临床样本,结果发现8株鸡白痢沙门菌阳性,1株鸡伤寒沙门菌阳性。上述结果表明,已建立双重PCR方法特异性检测鸡白痢和鸡伤寒沙门菌。本试验为鸡白痢和鸡伤寒不同生物型沙门菌的检测提供了一种简洁、敏感、特异的新方法。     

犬腹泻病例沙门氏菌的分离与鉴定

对南京农业大学动物医院9例有腹泻症状的病犬采取直肠粪便进行沙门氏菌(Salmonella)的分离鉴定。通过生化鉴定和PCR扩增沙门氏菌invA基因,筛选出5株沙门氏菌菌株。对分离出的菌株进行血清型鉴定和对抗生素药物的敏感性试验。结果显示,5株分离菌株中4株属于B群鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium),1株属于D群伊斯特本沙门氏菌(S.eastbourne)。2个分离菌株仅对阿米卡星、头孢西丁、链霉素及头孢吡肟较为敏感。在动物致病性试验中,鼠伤寒沙门氏菌血清型的菌株的致病力则强于伊斯特本沙门氏菌。     

1例鸡白痢沙门氏菌的分离鉴定与耐药性分析

为查明河南省新乡市某规模化蛋鸡场疑似沙门氏菌感染病例的病原,进而制定合理的治疗方案,本研究无菌采集疑似病雏鸡肠管样品,用革兰氏染色、培养特性观察、生化试验、PCR方法对其进行确诊,并进行病原回归试验,采用药敏纸片琼脂扩散法(K-B法)分析分离菌对19种常见抗生素的耐药性。结果显示,本试验成功分离了一株革兰氏阴性短杆菌,该分离菌符合鸡白痢沙门氏菌的培养特性和生化特性;PCR成功扩出invA基因,通过与GenBank数据库比对分析确定该细菌为鸡白痢沙门氏菌;用分离细菌株感染SPF鸡能复制出与自然感染一致的病例,说明鸡白痢沙门氏菌是造成本养鸡场雏鸡发病的主要病原;分离株具有较强的致病性和多重耐药性,对阿米卡星、苯唑青霉素、青霉素耐药,对复达欣、氨苄青霉素、头孢曲松等药物敏感,将敏感抗生素用于临床治疗效果明显。结合以上结果,本研究提出该病的具体防治措施,并取得了较好的效果,为鸡白痢沙门氏菌的分离鉴定及防治提供了参考,对鸡白痢沙门氏菌病病原的早期诊断和治疗具有重要临床意义。     

PCR鉴定沙门氏菌血清分型方法的建立与应用

为建立快速有效、经济适用的沙门氏菌血清型鉴定方法,利用Primer Plex软件设计畜禽中常见沙门氏菌的菌体(O)抗原和鞭毛抗原(H)的引物,优化引物比例和退火温度等反应条件,建立沙门氏菌血清型鉴定的PCR法,并对46株沙门氏菌分离株进行血清型鉴定,同时与传统玻片凝集法和美国CDC的液相芯片(Luminex-x MAP)法进行比较。优化后获得了O抗原中B、C1、D和E1群的多重PCR引物,以及鞭毛抗原H1相抗原基因(fli C)和H2相抗原基因(flj B)的2对引物;建立了一套基于沙门氏菌O和H抗原的多重PCR血清型鉴定法;PCR法和Luminex-x MAP法鉴定出7种沙门氏菌血清型,传统玻片凝集法鉴定出6种血清型;PCR法与传统玻片凝集法和Luminex-x MAP鉴定结果的符合率均为95.65%。本研究建立的PCR沙门氏菌血清型鉴定法简便、快速,预期可在沙门氏菌的血清分型研究中发挥作用。     

1例鸡白痢沙门氏菌的分离鉴定与耐药性分析

为查明河南省新乡市某规模化蛋鸡场疑似沙门氏菌感染病例的病原，进而制定合理的治疗方案，本研究无菌采集疑似病雏鸡肠管样品，用革兰氏染色、培养特性观察、生化试验、PCR方法对其进行确诊，并进行病原回归试验，采用药敏纸片琼脂扩散法（K-B法）分析分离菌对19种常见抗生素的耐药性。结果显示，本试验成功分离了一株革兰氏阴性短杆菌，该分离菌符合鸡白痢沙门氏菌的培养特性和生化特性；PCR成功扩出invA基因，通过与GenBank数据库比对分析确定该细菌为鸡白痢沙门氏菌；用分离细菌株感染SPF鸡能复制出与自然感染一致的病例，说明鸡白痢沙门氏菌是造成本养鸡场雏鸡发病的主要病原；分离株具有较强的致病性和多重耐药性，对阿米卡星、苯唑青霉素、青霉素耐药，对复达欣、氨苄青霉素、头孢曲松等药物敏感，将敏感抗生素用于临床治疗效果明显。结合以上结果，本研究提出该病的具体防治措施，并取得了较好的效果，为鸡白痢沙门氏菌的分离鉴定及防治提供了参考，对鸡白痢沙门氏菌病病原的早期诊断和治疗具有重要临床意义。     

鸡白痢沙门氏菌平板凝集抗原的制备

从郑州某鸡场死亡雏鸡的肝脏、脾脏和肾脏中分离纯化细茵,通过致病性试验、生化试验,并结合临床症状、病理变化和培养特性鉴定为鸡白痢沙门氏菌.经传代分离株、培养细菌、收集细菌、灭活细菌、浓缩抗原、调整抗原浓度、无菌检查及染色制备鸡白痢沙门氏菌平板凝集抗原,建立了检测鸡白痢血清抗体的微量平板凝集法.该方法具有特异性强、操作简便快速的优点.     

鸡白痢沙门氏菌平板凝集抗原的制备

从郑州某鸡场死亡雏鸡的肝脏、脾脏和肾脏中分离纯化细菌，通过致病性试验、生化试验，并结合临床症状、病理变化和培养特性鉴定为鸡白痢沙门氏菌。经传代分离株、培养细菌、收集细菌、灭活细菌、浓缩抗原、调整抗原浓度、无菌检查及染色制备鸡白痢沙门氏菌平板凝集抗原，建立了检测鸡白痢血清抗体的微量平板凝集法。该方法具有特异性强、操作简便快速的优点。     

沙门氏菌通用PCR快速检测试剂盒的研制与应用

根据沙门氏菌fimY基因建立了用于检测沙门氏菌的通用PCR方法。对收集的A-F群标准菌株和临床分离的60株沙门氏菌分离株和11种非沙门氏菌进行PCR检测,采用2.0%琼脂糖电泳进行检测,结果所有沙门氏菌均扩增出526bp的特异性条带,而非沙门氏菌均未扩增出任何条带。通过电泳判定结果,该法可检出扩增体系中93cfu的沙门氏菌,还可检出含3cfu的样品用BP预增菌或MM增菌后的菌液。说明该方法敏感性高、特异性强。采用直接菌体加入法、热裂解、反复冻融、CTAB碱裂解法和柱式试剂盒提取法分别提取核酸模板,结果CTAB法效果最好,但操作烦琐,而直接菌体加入法和热裂解法可以达到和柱式试剂盒同样的效果,且操作简便快速、经济、效果好,值得推广应用。