RT-PCR技术检测猪流感病毒

根据猪流感病毒（SIV）的M基因的序列,设计合成了1对引物,建立了检测猪流感的RT-PCR方法。应用该方法对H1、H3、H9亚型的猪流感病毒进行基因扩增,均获得了分子量为460bp的特异性目的片段,而对PRRSV、 PCV2、PRV、CSFV进行同条件检测,结果均为阴性;SIV扩增产物测序结果与SIV其他毒株序列同源性达99%～100% 。敏感性试验表明,该方法可检测到103 EID50的SIV;可直接从猪流感病毒感染小鼠的组织样品中检测到病毒。     

鸡传染性支气管炎病毒RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank上发表的鸡传染性支气管炎病毒（IBV）基因序列,针对IBV M基因全序列设计合成了一对引物, 以IBV疫苗株为模板, 建立了检测IBV的RT-PCR方法。应用该方法对IBV疫苗株RNA进行扩增, 获得与预期大小相符, 长度为1105bp的特异性目的片段;敏感性测定该RT-PCR可扩增到18pg的IBV-M-cDNA。结果表明建立的RT-PCR方法对IBV的检测敏感性高、特异性强,可用于IBV感染的诊断和流行病学调查。     

猪博卡病毒不同基因型三重PCR检测方法的建立及初步应用

为鉴别猪博卡病毒1型、2型和3型3种基因型,根据猪博卡病毒基因序列分别设计3对针对保守区域的引物进行PCR扩增,扩增目的片段大小分别为645 bp(PBoV1型)、352 bp(PBoV2型)和259 bp(PBoV3型)。通过引物浓度和退火温度等条件优化,首次建立了同时检测猪博卡病毒3种基因型的三重PCR方法。所建立的三重PCR方法扩增其他猪病病毒结果均为阴性,最低检测限为8×10-7ng/μL。结果表明,该方法具有较好的特异性和敏感性。对临床样品进行三重PCR和单项PCR检测,对比结果显示符合率为100%。该方法的建立为猪博卡病毒3种不同基因型的鉴别检测提供了有效手段。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒HN-HW株的分离与鉴定

用细胞传代的方法从湖南省宁乡县发病猪所采病料中分离到一株猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)毒株.该毒株能在Marc-145细胞上增殖并产生特征性的细胞病变,RT-PCR检测可扩增出670 bp的特异性的ORF5基因片段,经美洲型PRRSV荧光抗体染色呈阳性反应,电镜观察其超微结构显示,病毒粒子大小为50～60 nm.命名该分离毒株为HN-HW株.     

CSFV,SIV,PCV2,PRV和PRRSV多重PCR检测方法的建立及初步应用

参照GenBank中的猪瘟病毒(CSFV)、猪流感病毒(SIV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合病毒(PRRSV)基因序列,设计了5对引物分别用于扩增CSFVE2、SIV、PCV2ORF2、PRVgB、PRRSVN基因的目的片段。通过对反应条件进行优化,建立了检测CSFV、SIV、PCV2、PRV和PRRSV的多重PCR(mPCR)诊断方法。敏感性和特异性结果显示,该mPCR对5种病毒的最低核酸检测量为10pg。而对大肠杆菌、葡萄球菌、链球菌、猪细小病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、鸡新城疫病毒、猪传染性胃肠炎病毒的多重PCR的扩增结果均为阴性。临床样品的多重PCR检测结果表明,建立的多重PCR方法能够对SIV、CSFV、PCV2、PRV、PRRSV单个或混合感染的临床样品进行快速鉴别诊断。     

辣椒三种病毒的多重RT-PCR同步检测

本研究根据辣椒轻斑驳病毒(PMMo V)、烟草花叶病毒(TMV)和黄瓜花叶病毒(CMV)的外壳蛋白(CP)编码序列设计了3对PCR检测引物,并初步建立了同步检测以上3种辣椒病毒的多重RT-PCR方法。以被感染了3种病毒的叶片的总RNA作为模板,可同时扩增到324 bp(TMV)、220 bp(PMMo V)和112 bp(CMV)的3个目标条带,在电泳图上清晰可辨。测序结果表明所扩增产物确为待检病毒靶序列。除阳性对照外,该多重RT-PCR体系不对ORSV、PVX和PVY等同属或不同属的其它病毒发生反应;该体系可检测到104倍稀释的病毒c DNA模板。同时,以建立的三重RT-PCR法对10份田间辣椒病样进行检测,其结果与单重RT-PCR结果一致,说明该法检测结果可靠,可用于PMMo V、TMV和CMV 3种辣椒病毒的同步检测。     

猪流感病毒M基因核酸探针的制备与应用

以地高辛(DIG)标记猪流感病毒(SIV)M基因的保守片段制成核酸探针,与H1及H3亚型的猪流感病毒(SIV)的cDNA、猪呼吸与繁殖综合征病毒(PRRSV)的cDNA、猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)的DNA、猪瘟病毒(CSFV)cDNA、猪伪狂犬病(PRV)的DNA进行斑点杂交,以检测探针的特异性,结果该探针仅与H1及H3亚型的猪流感病毒(SIV)的cDNA杂交呈阳性,与其余病毒杂交呈阴性;敏感性试验显示,探针最低能检出约5 pg的H3亚型的SIV RT-PCR产物.应用该探针对35份疑似SI临床病料进行检测,结果检出9份阳性,与RT-PCR检测结果一致.本研究结果表明,建立的DIG标记的核酸探针特异性强,敏感性高,适合于对SI的诊断和流行病学调查.     

猪主要RNA病毒病多重二温式RT-PCR检测方法的建立及初步应用

通过对Genbank登录的CSFV、PRRSV和JEV的核苷酸序列进行比对分析,找出CSFV的E2基因,PRRSV的Nsp2基因和JEV的E基因为相对保守区域[1]。利用生物学软件在保守序列分别设计一对引物,通过对PCR反应条件的优化,确定了最佳引物浓度、最佳Mg2+浓度和最佳退火温度,建立了多重二温式PCR方法检测CSFV、PRRSV和JEV。其扩增的目的片断大小分别为CSFV(482 bp)、PRRSV(576 bp)和JEV(375 bp),将传统三温式PCR过程中的退火与延伸合并为一步,从而大大节省临床检测时间,同时又能通过一个反应体系对CSFV、PRRSV及JEV三种猪主要RNA病毒病进行检测。用50份临床病料对本研究多重PCR技术和单项PCR技术进行对比验证,结果显示,两者的总符合率为93%以上。表明建立的多重PCR检测方法,具有特异、快速、准确的特点,可用于对这3种病毒的同时检测和鉴别诊断。     

牛病毒性腹泻病毒RT—PCR检测方法研究

【目的】建立快速、简便、特异的检测牛病毒性腹泻病毒抗原的RT-PCR方法;【方法】根据已发表的牛病毒性腹泻病毒株(BVDV)5’端非编码区保守序列设计合成了两条引物,应用RT-PCR技术对两株BVDV标准株(OregonC24V and NADL)进行基因扩增,对扩增产物进行酶切鉴定。同时设猪瘟兔化弱毒疫苗株、轮状病毒株、MDBK细胞作对照;【结果】两株BVDV标准株均扩增出了长度为325bp的片段,扩增产物经酶切后形成长度为111bp和214bp两条片段,而对猪瘟兔化弱毒疫苗株、轮状病毒株、MDBK正常细胞扩增均为阴性,与预期结果一致。【结论】PCR检测方法可以快速准确地对牛病毒性腹泻-黏膜病作出诊断。该方法的敏感性可高达10-1TCID50。     

甘薯病毒多重RT-PCR检测方法的建立

为了快速进行甘薯病毒田间检测和脱毒苗诊断,该研究建立了一个能够同时检测SPCSV、SPLV和SPFMV这3种病毒的多重RT-PCR检测方法。根据GenBank公示的甘薯病毒基因序列来设计3种甘薯病毒的引物,分别对模板浓度、退火温度、Mg2+浓度和循环次数进行优化,同时对模板浓度进行10倍梯度稀释,检测多重RT-PCR灵敏度。结果显示,模板浓度为19 ng/μL、退火温度为52℃、Mg2+浓度为0 mmol/L、循环次数为40次时,可以同时扩增出大小为276 bp、570 bp、425 bp三种病毒的基因片段,多重RT-PCR检测灵敏度为10-4,单一RT-PCR检测灵敏度为10-3,多重RT-PCR检测灵敏度是单一RT-PCR的10倍。该研究使用优化的多重RT-PCR检测技术可获得稳定、灵敏、准确、高效地和同时地检测田间复合侵染的3种甘薯病毒。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒Hn-1/06株GP3蛋白的原核表达与纯化

根据GenBank中PRRSV美洲株ATCC VR2332的ORF3基因序列,利用Primer 5.0软件设计合成了1对特异性引物,经RT-PCR从河南分离株Hn-1/06株扩增得到了大小为765 bp的片段,并将扩增的片段插入pTG19-T载体进行测序而获得含有ORF3的阳性克隆pTG19-T-GP3.将此基因亚克隆到原核表达载体pET-32a,经筛选获得了阳性重组质粒pET-GP3,进而在IPTG的诱导下成功表达,获得了大小约为45 kDa的融合蛋白GP3-His,纯化后经Western blot检测证实表达的融合蛋白具有良好的生物学活性.从而为进一步研究PRRSV次要结构蛋白GP3的免疫特性和功能奠定了基础.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒河南分离株NSP2和GP5基因遗传变异分析

扩增了自2006-2009年间从河南省不同地区分离的9株PRRSV株NSP2和GP5编码基因,并进行了序列测定和分析。结果显示,9株分离株NSP2全长2 850～2 937 bp,编码950～979个氨基酸,GP5基因全长603 bp,编码200个氨基酸,与CH-1a株比对,其中有7株分离株的NSP2基因均出现30个氨基酸的缺失。对9株分离株NSP2和GP5基因进行核苷酸序列分析并绘制进化树,结果表明,9株河南分离株都属于美洲型毒株,对9株PRRSV分离株NSP2和GP5基因同时进行序列分析,比较其变异结果是否一致,为进一步探寻PRRSV流行株遗传变异规律奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征的套式PCR方法建立及应用

通过设计2对引物,建立了PRRSV的套式PCR方法,PRRSV细胞毒稀释10 000倍,依然能扩增出相应的片断,多次重复能得到一致的结果,非PRRSV病毒(猪瘟病毒、猪乙型脑炎病毒)均未扩增出相应片断.应用该方法对各地样品进行检测,表明建立的套式PCR方法适合进行流行病学调查.     

猪源2型链球菌福建株CPS2J基因PCR检测及序列分析

设计并合成一对扩增2型猪链球菌CPS基因的特异性引物,以猪2型链球菌福建株DNA为模板,筛选最佳反应条件,建立检测CPS2J基因的PCR方法,并对PCR扩增产物进行序列测定和同源性比较分析。结果如下：应用该方法对猪2型链球菌福建株和标准阳性株进行扩增,均获得与预期大小一致的675bp特异性目的片段,而对8株非2型猪链球菌的扩增结果均呈阴性;敏感性测定最低可检出100cfu细菌量或50pg 细菌DNA;SS2PFJ06CPS2J 基因部分核苷酸及其推导的氨基酸序列与猪链球菌2型不同菌株的同源性分别达98.7%-100%和97.8%~100%。上述结果表明建立并优化的猪2型链球菌CPS2J基因的PCR检测方法敏感性好、特异性高,能用于2型猪链球菌的分子流行病学调查和快速检测; 序列分析表明猪2型链球菌福建株与国内外8株标准株之间同源性高、亲缘关系密切。     

几种槭属植物亲缘关系的ITS序列分析

本文对槭属植物的8个种(含变种)核糖体 DNA 内转录间隔区(ITS)序列进行了PCR扩增和序列分析,扩增出约750bp左右的的序列(包含完整的ITS1、5.8S和ITS2序列及部分18S和26S rRNA基因片段。各样品的 ITS1长度为221~236 bp,ITS2 为 231~237 bp,含有多个特异性信息位点。并利用 ITS 序列为依据对8种槭属植物系统发育进行分析,从分子水平上阐明了8种槭属植物的亲缘关系,为挪威槭嫁接生产中适宜砧木的选择提供了理论依据。     

Characterization of CMS and maintainer lines in indica rice (Oryza sativa L.) based on RAPD marker analysis

Total DNA from WA type CMS lines: Zhenshan 97 A, Longtepu A and theirmaintainers Zhenshan 97 B, Longtepu B wasextracted by CTAB method. One hundredprimers were used for screening RAPDmarkers to distinguish CMS line (A) andmaintainer (B) plants at seedling stage.Results showed that under the conditions of37 ^°C annealing temperature and1.5 mM MgCl₂ concentration, in Zhenshan97 A, Longtepu A there was a 1600 bp DNAfragment in product amplified by primerOPA12, while in Zhenshan 97 B, and LongtepuB no 1600 bp fragment was found. The 1600 bpfragment was also found in DA type CMS lineXieqingzao A, but was absent in XieqingzaoB. Also in the restorer line, Minghui 63the 1600 bp fragment was absent. In F₁and F₂ generation of Zhenshan97A/Minghui 63, all plants investigated hadthe 1600 bp fragment. When mitochondrial DNA(mtDNA) was isolated from the three CMS (A)and their B lines and amplified by OPA12,results showed that the 1600 fragment wasfound in all the three A lines and wasabsent in the three B lines. In DA typeXieqingzao A, two other fragments (700 bp,1000 bp) were also found except the 1600 bp.These results indicate that the 1600 bpfragment derived from CMS mitochondrial DNAcan be used as a RAPD marker to distinguishA and B plants at seedling stage, and thefragments (700 bp, 1000 bp) can be used todistinguish WA and DA cytoplasms.     

转基因玉米MON88017旁侧序列分析及定性PCR检测

采用基因组步移法和巢式PCR方法研究转基因玉米MON88017外源基因插入位点旁侧序列特征,获得了外源基因插入位点的左边界旁侧序列504bp,包括336bp的插入载体序列和168bp的玉米基因组序列。根据此旁侧序列,设计MON88017转化事件特异性引物并进行定性PCR扩增,扩增片段为446bp,建立了转基因玉米MON88017转化体特异性检测方法。该方法特异性强、灵敏度高(0.1%),为转基因玉米品种MON88017进出口检测和标识检测提供了技术基础。     

人工合成六倍体小麦与普通小麦杂交后代衍生群体的PPO基因分析

四倍体小麦与节节麦杂交培育的人工合成六倍体小麦已广泛应用于国内外小麦品种改良。以引自CIMMYT的Syn768、Syn769、Syn780和Syn786人工合成六倍体小麦分别与中国四川成都平原主栽普通小麦品种杂交、回交的BC2F2：6后代群体中选育的113份优良高代系和川麦38、川麦42、川麦43和川麦47育成品种为材料,采用SSR特异引物Xgwm312标记位点的PAGE凝胶电泳对其PPO基因型进行了研究。结果表明,Xgwm312位点的标记具有多态性,其PCR扩增产物可产生198bp、216bp、232bp和240bp四种等位基因变异片段。在所检测的117份后代衍生群体材料中,65份材料具有198bp片段的等位基因,占全部材料的55．56％;13份含216bp片段的等位基因,其频率为11．11％,35份材料具有232bp片段的等位基因,分布频率为29．91％;只有4份材料含有240bp片段的等位基因,仅占全部材料的3．42％。从每个人工合成六倍体小麦亲本材料所形成的后代衍生群体来看,基因等位变异片段分布频率各不相同。说明PPO基因在小麦杂交后代材料中基因型的表现存在着随机性,与亲本的基因型状况关系极大,并且在后代材料中出现了亲本都没有的240bp等位基因变异片段的材料。通过研究人工合成六倍体小麦与普通小麦杂交后代的PPO基因型,有助于提高分子标记育种效率,也有助于PPO基因型的多态性研究,并为人工合成六倍体小麦在我国小麦品种改良和分子标记育种中的应用提供依据和方法。     

瓣化型胡萝卜雄性不育基因atp6的CAPS标记建立

根据atp6的基因序列设计特异扩增引物，以瓣化型胡萝卜核质互作雄性不育系H05A及其保持系H05B为试材，扩增获得了1条约500bp的特异扩增片段。用限制性内切酶BglII对该片段进行酶切，不育系产生1条保持系中没有的特异片段，其分子量约为60bp。建立了atp6基因的CAPS标记，该分子标记可用于胡萝卜雄性不育分子标记辅助育种。