转基因水稻BarKasalath-01事件特异性检测

利用hi TAIL-PCR方法研究了转基因水稻Bar Kasalath-01中外源基因在基因组上插入位点的序列特征,获得了外源基因T-DNA右边界旁侧序列511 bp,与水稻基因组数据库比对发现,外源基因插入位点位于水稻基因组第8号染色体的第3 326 720处。根据整合位点水稻基因组序列和外源基因T-DNA左边界序列设计引物,扩增得到了左旁侧序列783 bp。基于左右旁侧序列,建立了转基因水稻Bar Kasalath-01的事件特异性定性PCR检测方法,扩增片段分别为783 bp和411 bp。该方法特异性强、灵敏度高,能够在Bar Kasalath-01基因组DNA含量为0.1%的模板中检测出转基因成份。依据旁侧序列,还建立了快速鉴定转基因后代植株基因型的3引物PCR检测方法。这些方法的建立,实现了对转基因水稻Bar Kasalath-01转化事件的特异性检测。     

转基因玉米ND207转化事件特异性定性PCR检测方法及其标准化

转基因玉米ND207是中国农业大学研发的转mCry1Ab和mCry2Ab基因的抗虫玉米,本研究的目的是建立ND207转化事件特异性定性PCR检测方法。根据研发者提供的引物进行PCR扩增,PCR产物测序分析,获得了5’端旁侧序列262 bp,包括109 bp的载体序列和153 bp的玉米基因组序列, 3’端旁侧序列316 bp,包括76 bp的载体序列和240bp的玉米基因组序列。针对两端旁侧序列设计14条引物,组成25对引物组合进行引物筛选,选中3’端一对最佳引物优化PCR反应体系及反应条件,建立ND207的转化事件特异性定性PCR检测方法, PCR产物片段大小为166 bp。经过测试,该方法的检出限为0.1%,相当于20个拷贝的ND207特异分子片段。国内8家转基因生物安全检测机构对本方法进行了特异性测试、检出限测试和再现性测试,循环验证报告显示:该方法符合国家标准方法的各项要求,可在检测行业推广应用。ND207转化事件特异性定性PCR检测方法的建立,为我国ND207及其衍生品系的安全监管提供技术支撑。     

转基因抗虫棉外源DNA插入整合结构分析和转化事件特异性检测方法的建立

通过3’端2次高效热不对称交互PCR(hiTAIL-PCR)和5’端4次hiTAIL-PCR及1次长链PCR获得了转基因抗虫棉材料06N-119的外源DNA插入片段的全序列。外源DNA插入片段全长11578bp,由NptⅡ基因和Bt基因两个表达盒串联构成。插入位点处缺失75个碱基,未发生基因重组现象。根据3’端旁侧序列设计引物,特异性和灵敏度检测结果表明,建立的3’端定性PCR检测方法特异性强,灵敏度高,最低检测限为每100ng模板量的0.05%,相当于11个靶标序列拷贝。本研究结果对转基因抗虫棉外源基因检测和生物安全评价具有重要意义。     

转基因马铃薯外源基因插入位点分析及检测方法的建立

09-4为本实验室构建的抗马铃薯PRLV的RNAi基因和特异切割马铃薯PSTVd的核酶基因无标记双价表达载体p CAMBIA3301-DR-IS导入马铃薯中获得的转基因无性系。本研究通过染色体步移获取转基因无性系09-4的插入位点左边界旁侧序列,对获得的左边界序列进行分析,扩增获得片段大小为382 bp,包括转化载体序列119 bp及转基因马铃薯的旁侧序列263 bp;依据转化马铃薯的RNAi基因和左旁侧序列分别设计引物,扩增出大小为300 bp的片段,建立了09-4转基因无性系特异性标识和特异PCR检测方法,为转基因马铃薯的检测和身份识别提供技术基础。     

以实时荧光定量PCR技术检测转基因玉米MON88017

根据转基因玉米MON88017的左侧侧翼序列和玉米内标基因(zSSIIb)分别设计特异性引物及Taqman探针,通过实时荧光PCR技术建立MON88017的定量特异性检测方法。利用含有内标基因和侧翼序列的标准质粒分子,建立了玉米内标基因和侧翼序列的标准曲线。检测了5个已知MON88017含量(0.01%、0.05%、0.10%、0.50%、1.00%)的混合样品中的转基因含量,结果表明检测底限可以达到19~30个阳性拷贝。该研究建立的实时荧光定量PCR技术灵敏度高、特异性强。     

转基因高油酸油菜T-DNA插入拷贝数及整合位点分析

为获得转基因高油酸油菜T-DNA插入拷贝数及整合位点相关信息,本研究应用地高辛标记的NPTII基因片段为探针,与经BamHI酶切的转基因甘蓝型油菜高油酸株系W-4的T2代单株的基因组DNA进行Southern杂交。结果显示:W-4的T2代单株的基因组含有一个T-DNA拷贝。用3到4个根据载体pCNFIRnos序列设计的嵌套特异性引物分别与简并引物组合进行TAIL-PCR反应,扩增得到转基因油菜T-DNA插入位点的左、右边界旁侧序列。经分析右边界旁侧序列长度为470bp,其中180bp为载体序列,290bp为W-4的基因组序列;左边界旁侧序列长度为641bp,其中365bp为W-4的基因组序列,276bp为载体序列。序列比对结果发现该转基因事件中,T-DNA左边界序列完全整合到油菜基因组中,仅有1个碱基由G转换成了A。而右边界则缺失了包括RBborder在内的62个碱基。结果表明:转基因高油酸油菜T-DNA的整合是一次无其他额外载体序列的整合。blast分析获得的与左右边界相连的油菜基因组序列,未检索到与之高度同源的序列,推测T-DNA插入位点可能位于油菜基因组非编码区。综上所述,本研究分析了转基因油菜W-4基因中T-DNA拷贝数、整合特点和旁侧序列,研究结果为转基因油菜的生物安全性评价以及转基因高油酸油菜的检测提供重要的基础信息。     

三引物法鉴定转基因水稻U5纯合体

转基因水稻纯合体性状稳定,在水稻基因组功能研究中具有重要的作用。本研究利用TAIL-PCR法获得了T-DNA旁侧序列,序列比对显示插入位点在水稻第8号染色体的7 821 534~7 821 535之间;通过扩增旁侧序列,建立了转基因水稻U5的事件特异性检测方法;以旁侧序列为基础,还建立了能快速、准确鉴定U5纯合株系的三引物PCR检测法。这些纯合体的鉴定,缩短了获得U5转基因纯合体的时间,对加快水稻Os PUT1基因的功能研究和育种进程具有实用价值。     

转基因玉米目标基因纯合体快速准确的PCR鉴定方法(英文)

本文以转基因玉米NK603为例,介绍了一种检测目标基因纯和体的PCR方法.该方法利用4个引物的多重PCR反应,这4个PCR引物分别来自于目标基因的5'端(5'TP)和3'端(3'TP)DNA序列,目标基因5'端一侧的玉米基因组DNA序列(5'GP),以及目标基因3'端一侧的玉米基因组DNA序列(3'GP).视玉米个体有无目标基因以及目标基因的杂合/纯和状态,PCR扩增可得到三种不同的结果:如果被检测个体无目标基因,5'GP与3'GP间的玉米基因组DNA将被扩增,PCR只产生一条条带:如果被检测个体是目标基因的纯合体,5'GP与5'TP及3'TP与3'GP间的DNA将被扩增,PCR则产生两条条带;如果被检测个体是目标基因的杂合体,5'GP与3'GP、5'GP与5'TP以及3'TP与3'GP间的DNA将都被扩增,PCR则产生三条条带.三条不同长短的PCR产物条带在琼脂糖凝胶上清晰可分,易于辨别.和费时昂贵的定量PCR相比,该方法简单、快速、结果准确,在目标基因位点玉米基因组DNA序列已知的前提下,该方法可扩展到诸如Btll、Event176、GA21、MON810、MON863和TC1507等任何转基因玉米的回交转育程序中.     

转cry1Aa基因抗虫棉整合结构解析及转化体特异性检测方法的建立

【目的】cry1Aa基因是2011年本实验室在我国棉花商品种子中发现的1种未经批准的转基因成分,本研究旨在通过整合结构解析,建立特异性检测方法,对市售棉种进行初测,明确该外源基因在我国棉种中的存在情况。【方法】通过Genome walking、长链PCR分离获得了转cry1Aa基因棉花转化体(定名为NN6转化体,简称NN6)的外源基因整合结构,同时基于插入位点基因组及外源DNA连接区,建立了NN6转化体特异性的定性聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)方法和实时荧光定量PCR方法。【结果】NN6整合结构主要包括cry1Aa、aad和Npt II基因,插入棉花基因组7号染色体37 169 450位,产生91 bp基因组缺失;所构建的定性PCR检测方法能特异、快速地对棉花单株和种子单粒中NN6转化体的纯/杂合状态进行鉴定,实时荧光定量PCR检测限为44拷贝,能满足国内外对转基因标识的需要;对含有cry1Aa基因的3个市售棉种进行检测,其纯合度分别为1.51%,5.21%和21.09%。【结论】本研究解析了NN6的整合结构,并建立特异性检测方法,为我国转基因棉花新品种选育及转基因安全管理提供技术手段。     

外源抗草膦EPSPs基因在大豆基因组中的整合与定位

通过基因特异引物扩增和免疫层析试纸法分别对EPSPs基因和其编码的蛋白进行检测。结果表明,EPSPs基因不仅已整合到大豆基因组中,而且EPSPs蛋白可以正常表达。利用染色体步移方法获得了转基因大豆插入位点的侧翼序列,序列比对表明35S上游的大豆DNA序列起始于Gm02:7912740,NOS下游的大豆DNA序列起始于Gm02:7777705。外源基因不是以点插入方式整合,而是导致大豆基因组约135 kb片段的移位和重排。基因组序列重排导致一个编码HEC1和HEAT repeat功能域的基因(Glyma02g09790)结构受到影响,该基因在ABA和PEG处理时下调表达。本研究发现外源基因的插入导致插入位点附近DNA序列发生重排,并鉴定出一个编码HEC1和HEAT repeat功能域的基因可能会在ABA信号通路中参与干旱胁迫应答。本研究通过对抗除草剂EPSPs基因在大豆基因组中的插入位点分析,明确了外源EPSPs基因在大豆基因组中的整合、定位及其侧翼序列,为转基因大豆安全评价提供了依据。     

转G2-EPSPS基因玉米D-3侧翼序列分析与转化体特异性检测方法

通过一次3'端高效热不对称交互PCR（hiTAIL-PCR）和一次长链PCR扩增方法获得了转抗草甘膦基因（G2-EPSPS）玉米品系D-3的外源DNA插入片段的全DNA序列（T-DNA）及两端侧翼序列,并建立了转化体特异性PCR检测方法。结果显示：T-DNA插入片段全长4 318bp,由一个G2-EPSPS基因的表达盒构成。根据T-DNA 5'、3'端侧翼序列设计引物,建立了转化体特异性检测方法,并分析了该方法的灵敏度以及检出限,研究结果表明,3'端定性PCR检测方法特异性强,灵敏度高,检出极限为每100ng模板量的0.05%。本研究结果对转抗草甘膦外源基因检测和生物安全评价及监管具有重要意义。     

基因组测序技术解析耐除草剂转基因水稻G2-7的分子特征

Molecular characterization, such as copy number and flanking sequence of foreign DNA fragment insertion site, is the important identity information, provided during safety assessment of genetic modified crop. In this study, the T-DNA insertion site, copy number and flanking sequences were identified in transgenic glyphosate-tolerant rice G2-7 based on whole genome sequencing in combination bioinformatics analysis method. 47.13 Gb clean sequence data for G2-7 was generated on Illumina NovaSeq 6000 platform. The junction reads mapped to boundaries of T-DNA and flanking sequences in G2-7 were identified by comparing with sequence of transformation vector and rice reference genome. The results showed that exogenous T-DNA fragments was integrated in the position of Chr. 1 36,189,491-36,189,507 with a single copy, 16 bp rice genome sequence was deleted at the insertion site and no insertion of vector backbone. 375 bp and 353 bp flanking host DNA sequence of 5′-end and 3′-end of the insertion DNA fragment were also obtained, respectively. The putative insertion location and flanking sequences were further confirmed by PCR amplification and Sanger sequencing. The results not only provided data support for safety assessment and event specific detection, but also demonstrated that WGS was an effective technique for identifying molecular characterization in rice.     

转基因耐除草剂大豆A2704-12定性PCR检测方法研究

本研究建立了转基因耐除草剂大豆A2704-12定性PCR检测方法.根据A2704-12转化体外源插入片段5'端与大豆基因组连接区序列设计特异性引物,以大豆内源基因Lectin为内标,从A2704-12转化体中特异性扩增出239 by大小的特异性目的片段.同时对该方法特异性和灵敏度进行测试,结果显示:该方法能检测出A27...     

基于atpF-atpH序列鉴定稻属植物

为从分子水平上鉴定稻属,对稻属9种32份植物材料DNA条形码基因atpF-atpH进行PCR扩增并对PCR扩增产物测序,以近缘种植物为外类群建立系统进化树及序列差异分析,设计了鉴定稻属的特异性引物。结果表明,应用该特异性引物对稻属材料进行扩增,均获得与预期大小一致的113bp特异性目的片段,而对非稻属材料的扩增结果均呈阴性。系统进化树也显示出atpF-atpH基因可以很好将稻属区分开。这说明在条码基因差异位点分析的基础上,设计特异分子标记可用于稻属的鉴定,为珍贵物种的口岸鉴定提供了检测方法。     

猪圆环病毒的分子生物学检测

根据GenBank中发表的猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2, PCV-2)基因组序列,利用Primier5设计了一对特异性引物,分别采用CTAB法和DNA试剂盒提取猪脾脏总DNA,用PCR方法扩增猪PCV-2基因保守区序列,并对PCR扩增程序进行优化,对PCR检测方法的敏感性、重复性做了研究。结果显示扩增的目的片段约为573 bp,94°C 30 sec,60°C 30 sec,72°C 30 sec,30个循环扩增效果最好;模板DNA最低稀释倍数为100倍,即能检测到最低模板DNA的质量为25.8 ng;同一组织不同部位PCR检测的重复性较好;该检测方法为PCV-2的快速检测提供了方法和依据。     

道地中药材川贝母特异性PCR鉴别方法研究

为建立快速检测中药材川贝母成分的特异性PCR法,从NCBI数据库下载植物HMGR基因序列,根据同源性区域设计兼并引物,对川贝母及其易混品鳞茎基因组进行扩增。通过比对川贝母特异性DNA片段区域,设计引物扩增获得川贝母基原物种特异核酸片段。从川贝母基原鳞茎中提取DNA,设计特异引物对BMH-TF/BMH-TR,优化PCR扩增条件,通过特异性、灵敏度实验验证,建立特异性PCR检测体系。采用该方法从川贝母基原中扩增出一条120 bp左右条带,而非川贝母样品、空白对照在相同条件下无扩增条带,检测灵敏度为2 ng/μL,检测下限为4 ng。对10个市售药材的检测结果证明,该方法简便可行、重现性好。该PCR法可快速、准确鉴别川贝母基原,具有操作简便、快速、特异性高的优点。     

水仙花叶病毒RT-PCR检测方法的建立及应用

旨在建立水仙花叶病毒(Narcissus mosaic virus,NMV)的分子快速检测方法。根据已公布的NMV基因序列,设计一对特异性引物,以提取的水仙样品总RNA为模板进行RT-PCR,并对该方法的特异性、灵敏度、重复性及实际检测效果进行测定。从感染NMV的水仙样品中成功扩增出预期大小（约483 kb）的特异性目的片段,而健康水仙上未扩增到相应的片段。特异性、灵敏度及重复性测定结果表明,本研究建立的RT-PCR方法特异性强、灵敏高、重复性好。应用该方法成功检测了一批口岸送检的水仙样品。本研究建立的RT-PCR方法可为水仙上NMV的检测提供可靠的技术支持。     

The integration and insertion site of GbVe1 gene in the genome of transgenic cotton (Gossypium hirsutum)

[Objective] The aim of this study was to obtain the flanking sequences of T-DNA in the transgenic cotton containing a GbVe1 over-expression cassette. [Method] The T-DNA insertion copy number in the transgenic GbVe1 cotton was analyzed by southern blot. Flanking sequences of the transgenic lines with putative single T-DNA insertion copy were obtained using high-efficiency Thermal asymmetric interlaced polymerase chain reaction (hiTAIL-PCR). The T-DNA insertion sites were further confirmed by PCR with specific primers. [Result] RB-flanking sequences (119-1 018 bp) and LB-flanking sequences (243-516 bp) were obtained from three transgenic lines with low copy number of T-DNA insertion. The AT content was more than 63% in these flanking sequences. A same single insertion site in the intron of Gohir.D01G157600.1 was found in the two transgenic lines 7/100826-152 and 12/100826-393, while two separated insertion sites, one also in the intron of Gohir.-D01G157600.1 and the other in the intergenic region of A12 chromosome, were found in the transgenic line 1/w-ch14. A deletion of 21 bp was found in the insertion site in the intron of Gohir.D01G157600.1. The T-DNA insertion in the intron of Gohir.D01G157600.1 was further confirmed by the specific PCR. [Conclusion] The flanking sequences of T-DNA in the transgenic GbVe1 cotton were obtained and the specific transformation event in the intron of Gohir.D01G157600.1 was further confirmed by PCR.