猪主要RNA病毒病多重二温式RT-PCR检测方法的建立及初步应用

通过对Genbank登录的CSFV、PRRSV和JEV的核苷酸序列进行比对分析,找出CSFV的E2基因,PRRSV的Nsp2基因和JEV的E基因为相对保守区域[1]。利用生物学软件在保守序列分别设计一对引物,通过对PCR反应条件的优化,确定了最佳引物浓度、最佳Mg2+浓度和最佳退火温度,建立了多重二温式PCR方法检测CSFV、PRRSV和JEV。其扩增的目的片断大小分别为CSFV(482 bp)、PRRSV(576 bp)和JEV(375 bp),将传统三温式PCR过程中的退火与延伸合并为一步,从而大大节省临床检测时间,同时又能通过一个反应体系对CSFV、PRRSV及JEV三种猪主要RNA病毒病进行检测。用50份临床病料对本研究多重PCR技术和单项PCR技术进行对比验证,结果显示,两者的总符合率为93%以上。表明建立的多重PCR检测方法,具有特异、快速、准确的特点,可用于对这3种病毒的同时检测和鉴别诊断。     

CSFV,SIV,PCV2,PRV和PRRSV多重PCR检测方法的建立及初步应用

参照GenBank中的猪瘟病毒(CSFV)、猪流感病毒(SIV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合病毒(PRRSV)基因序列,设计了5对引物分别用于扩增CSFVE2、SIV、PCV2ORF2、PRVgB、PRRSVN基因的目的片段。通过对反应条件进行优化,建立了检测CSFV、SIV、PCV2、PRV和PRRSV的多重PCR(mPCR)诊断方法。敏感性和特异性结果显示,该mPCR对5种病毒的最低核酸检测量为10pg。而对大肠杆菌、葡萄球菌、链球菌、猪细小病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、鸡新城疫病毒、猪传染性胃肠炎病毒的多重PCR的扩增结果均为阴性。临床样品的多重PCR检测结果表明,建立的多重PCR方法能够对SIV、CSFV、PCV2、PRV、PRRSV单个或混合感染的临床样品进行快速鉴别诊断。     

变异猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-PCR检测方法的建立

摘要：根据GenBank已发表及本研究室分离鉴定的变异PRRSV的NSP2基因序列,设计并合成了一对引物,建立了一种鉴别PRRSV的RT-PCR检测方法。结果表明：该方法扩增变异PRRSV基因组时可获得217bp的片段,扩增普通PRRSV时则获得307bp的片段,同条件扩增猪瘟病毒(CSFV)、圆环病毒Ⅱ型(PCV2)、伪狂犬病病毒(PRV)均为阴性;该体系可检测到2.6pg的PRRS病毒核酸,具有较高敏感性。对2007～2008年送检的40份临床样品进行检测,结果检出12份为变异PRRSV,其阳性率为30.0%。研究结果表明, 建立的RT-PCR鉴别变异PRRSV方法具有特异性强、敏感性高、重复性好等特点,适用于对猪繁殖与呼吸综合征病毒的鉴别诊断。     

马铃薯X病毒的分子生物学方法检测探究

根据马铃薯X病毒的基因序列,合成了1对特异性引物,从感染PVX的马铃薯病叶组织中提取出总RNA,进行cDNA合成和PCR扩增,得到一条长度约为101 bp的特异性PCR扩增产物.为马铃薯PVX的检测用分子生物学手段提供了一套快速、简便的RNA提取、PCR扩增的基础参数.     

猪圆环病毒II型PCR检测方法的研究

【目的】建立快速、简便、特异的检测猪圆环病毒II型的PCR方法;【方法】根据已发表的猪圆环病毒II型基因序列设计合成了一对引物,用酚-氯仿法抽提可疑病料中的病毒DNA,应用PCR技术对猪圆环病毒进行基因扩增,PCR产物进行序列测定;以猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒为对照,进行特异性试验;取部分病料进行重复性试验;【结果】PCR方法扩增出了长度为702bp的片段,扩增产物经测序和序列分析表明扩增的序列为PCV2序列;猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒的PCR扩增均为阴性,与预期结果一致;部分病料PCR重复检测5次,检测结果完全一致;【结论】PCR检测方法可以对猪圆环病毒病作出敏感、特异、准确地诊断,该方法检测的基因最低模板量为2×10-5 ng/ml     

猪繁殖与呼吸综合征病毒HN-HW株的分离与鉴定

用细胞传代的方法从湖南省宁乡县发病猪所采病料中分离到一株猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)毒株.该毒株能在Marc-145细胞上增殖并产生特征性的细胞病变,RT-PCR检测可扩增出670 bp的特异性的ORF5基因片段,经美洲型PRRSV荧光抗体染色呈阳性反应,电镜观察其超微结构显示,病毒粒子大小为50～60 nm.命名该分离毒株为HN-HW株.     

猪圆环病毒Ⅱ型PCR检测方法的研究

【目的】建立快速、简便、特异的检测猪圆环病毒II型的PCR方法;【方法】根据已发表的猪圆环病毒II型基因序列设计合成了一对引物,用酚-氯仿法抽提可疑病料中的病毒DNA,应用PCR技术对猪圆环病毒进行基因扩增,PCR产物进行序列测定;以猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒为对照,进行特异性试验;取部分病料进行重复性试验;【结果】PCR方法扩增出了长度为702bp的片段,扩增产物经测序和序列分析表明扩增的序列为PCV2序列;猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒的PCR扩增均为阴性,与预期结果一致;部分病料PCR重复检测5次,检测结果完全一致;【结论】PCR检测方法可以对猪圆环病毒病作出敏感、特异、准确地诊断,该方法检测的基因最低模板量为2×10-5ng/ml。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的克隆及杆状病毒表达载体的构建

根据猪繁殖与呼吸综合症病毒已知序列(ch-1a,AY032626)设计包含完整ORF5序列的1对引物,采用RT-PCR方法扩增PRRSV甘肃LZH株的ORF5基因,将其克隆到杆状病毒载体pFastBacHTA上,经酶切鉴定、PCR鉴定筛选出阳性重组转移载体pFastBacHTA-ORF5,并对阳性质粒进行测序及序列分析;将pFastBacHTA-ORF5转化到DH10Bac感受态细胞中,与Bacmid发生位点特异性转座作用,获得重组转座子rBacmid-ORF5;并成功构建了PRRSV LZH株ORF5基因的杆状病毒载体,为基因工程疫苗的研制奠定了基础.     

应用PCR方法检测鸡传染性贫血病毒

根据鸡传染性贫血病毒(CIAV)基因组序列，设计一对引物扩增基因组上nt358～nt1042之间684bp DNA片段。在CIAV感染MDCC-MSBl细胞系中提取核酸为模板可扩增出相应DNA片段，且以感染细胞核酸为模板反应敏感性可达1fg，而以其他病原核酸为模板扩增结果均为阴性。应用该PCR方法对实验感染鸡肝脏、脾脏、胸腺、肾脏、法氏囊、骨髓、白细胞、泄殖腔棉拭子等不同样品进行检测，均可扩增出相应DNA片段。证明我们建立的PCR方法敏感性特异性强，可用于临床感染不同组织CIAV的检测。     

猪博卡病毒不同基因型三重PCR检测方法的建立及初步应用

为鉴别猪博卡病毒1型、2型和3型3种基因型,根据猪博卡病毒基因序列分别设计3对针对保守区域的引物进行PCR扩增,扩增目的片段大小分别为645 bp(PBoV1型)、352 bp(PBoV2型)和259 bp(PBoV3型)。通过引物浓度和退火温度等条件优化,首次建立了同时检测猪博卡病毒3种基因型的三重PCR方法。所建立的三重PCR方法扩增其他猪病病毒结果均为阴性,最低检测限为8×10-7ng/μL。结果表明,该方法具有较好的特异性和敏感性。对临床样品进行三重PCR和单项PCR检测,对比结果显示符合率为100%。该方法的建立为猪博卡病毒3种不同基因型的鉴别检测提供了有效手段。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒Hn-1/06株GP3蛋白的原核表达与纯化

根据GenBank中PRRSV美洲株ATCC VR2332的ORF3基因序列,利用Primer 5.0软件设计合成了1对特异性引物,经RT-PCR从河南分离株Hn-1/06株扩增得到了大小为765 bp的片段,并将扩增的片段插入pTG19-T载体进行测序而获得含有ORF3的阳性克隆pTG19-T-GP3.将此基因亚克隆到原核表达载体pET-32a,经筛选获得了阳性重组质粒pET-GP3,进而在IPTG的诱导下成功表达,获得了大小约为45 kDa的融合蛋白GP3-His,纯化后经Western blot检测证实表达的融合蛋白具有良好的生物学活性.从而为进一步研究PRRSV次要结构蛋白GP3的免疫特性和功能奠定了基础.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因不同编码区的表达和反应原性鉴定

为鉴定猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)囊膜糖蛋白GP5编码基因ORF5不同编码区的原核表达能力,利用PCR方法分别扩增ORF5基因缺失信号肽的D片段、缺失信号肽和跨膜区的L片段、缺失信号肽的5′端N片段和缺失跨膜区的3′端C片段,经克隆测序后分别插入原核表达载体pET-32a中进行原核表达,结果显示未缺失跨膜区的D片段未见表达产物,而L片段、N片段和C片段分别表达大小约为33,25,29 kDa的融合蛋白。Western blotting检测结果显示L片段表达蛋白可与PRRS阳性血清发生阳性反应,C片段反应性稍弱,而N片段未出现阳性反应,证实ORF5基因编码产物的C端在与抗体结合的反应原性方面具有重要作用。     

一种快速高效检测转基因玉米方法的建立

建立高效的目的基因检测方法是保障生物育种研发和产业化进程的重要技术支撑。应用常规PCR法、TaqMan探针实时荧光PCR法及叶片直接PCR法对转基因玉米叶片进行CaMV35S启动子和NOS终止子2个转基因元件的检测。结果表明,叶片直接PCR法分别较常规PCR方法和TaqMan探针实时荧光PCR法节约62%、48%的时间和25%、43%的成本,而且扩增出的目的条带清晰可见,符合目的片段大小,结果真实可靠,适用于大量转基因玉米植株叶片的快速筛选和鉴定。     

PRRS病毒E基因的克隆及表达载体的构建

分别以质粒pBV221和pPIC9K为表达载体,成功构建了PRRS病毒E基因克隆载体,转化后经抗性筛选、PCR扩增、双酶切鉴定,确认得到了含有目的基因的阳性克隆。对含有E蛋白原核表达载体的阳性克隆进行诱导表达,经过酶联免疫鉴定,结果显示外源蛋白在宿主菌中有表达,成功实现了在大肠杆菌细胞中的克隆。本研究成功构建了PRRSV BJ-4毒株E基因的原核表达载体和真核表达载体,为基因工程疫苗的研制奠定了基础。     

猪源2型链球菌福建株CPS2J基因PCR检测及序列分析

设计并合成一对扩增2型猪链球菌CPS基因的特异性引物,以猪2型链球菌福建株DNA为模板,筛选最佳反应条件,建立检测CPS2J基因的PCR方法,并对PCR扩增产物进行序列测定和同源性比较分析。结果如下：应用该方法对猪2型链球菌福建株和标准阳性株进行扩增,均获得与预期大小一致的675bp特异性目的片段,而对8株非2型猪链球菌的扩增结果均呈阴性;敏感性测定最低可检出100cfu细菌量或50pg 细菌DNA;SS2PFJ06CPS2J 基因部分核苷酸及其推导的氨基酸序列与猪链球菌2型不同菌株的同源性分别达98.7%-100%和97.8%~100%。上述结果表明建立并优化的猪2型链球菌CPS2J基因的PCR检测方法敏感性好、特异性高,能用于2型猪链球菌的分子流行病学调查和快速检测; 序列分析表明猪2型链球菌福建株与国内外8株标准株之间同源性高、亲缘关系密切。     

利用荧光定量PCR方法研究猪繁殖与呼吸综合征病毒在Marc-145细胞的增殖规律

摘要:猪繁殖与呼吸综合征病毒可以在原代猪肺泡巨噬细胞(PAM)、CL2621细胞系及Marc-145细胞系上生长繁殖,但对于其增殖规律不甚了解。试验利用实时荧光定量PCR技术,研究猪繁殖与呼吸综合征病毒在Marc-145细胞中的增殖规律;结果发现:病毒在接种后12 h开始大量增殖,在18-36 h增殖最为迅速,在36-48 h病毒增殖达到最高峰;研究还发现在18 h 时Marc-145细胞开始释放病毒,48 h达最高峰。该结果为研究猪繁殖与呼吸综合征病毒的致病机理及利用细胞毒生产疫苗提供试验基础。     

PCR及核酸探针检测耐甲氧西林葡萄球菌mecA基因的研究

为了解耐甲氧西林葡萄球菌在畜禽间的存在情况,本试验建立针对mecA基因的PCR方法及地高辛标记核酸探针技术,分别用两种方法对75株葡萄球菌分离株进行检测。结果,经PCR方法检出42株耐甲氧西林葡萄球菌,占分离株的56.0%;经核酸探针方法检出47株耐甲氧西林葡萄球菌,占分离株的62.7%,两种方法的总符合率为93.3%。通过本研究证实,在畜禽的体表及体内能够分离到耐甲氧西林葡萄球菌,且有较高的分离率,应该引起兽医工作者的足够重视。