洛克沙胂对猪肝微粒体CYP3A4及CYP2E1蛋白的影响

洛克沙胂是一种常用的饲料添加药物,细胞色素P450酶系(CYP或P450)是动物体内药物代谢的主要酶类。本文研究了洛克沙胂对猪肝微粒体P450酶系中的2种酶CYP3A4和CYP2E1的蛋白表达的影响,为揭示该药的代谢机理、残留机制以及临床安全用药提供理论依据。实验将洛克沙胂以5、25和125mmol/L 3个剂量,分别添加到猪肝微粒体体外孵育体系中,以生理盐水作对照,于37℃孵育1h,测定微粒体蛋白含量及CYP3A4及2E1的蛋白表达。结果表明中剂量和高剂量的洛克沙胂对猪肝细胞微粒体的CYP3A4及2E1的蛋白表达均呈现抑制作用,而低剂量的洛克沙胂对CYP3A4和CYP2E1的蛋白表达影响很小。     

细胞色素P4503A46基因的异源表达及药物代谢活性分析

为了克隆巴马小型猪细胞色素P4503A46基因,建立P4503A46稳定表达肝癌细胞株(Hep G2-P4503A46),并探究其药物代谢活性,通过RT-PCR从肝组织中钓取基因P4503A46,将基因与真核表达载体pc DNA3.1连接并转染Hep G2细胞,经G418筛选10代,获得稳定表达重组细胞株Hep G2-P4503A46,以P4503A特异性代谢底物硝苯地平(NF)探针药物,将探针药物与重组细胞在优化的细胞浓度、药物浓度、孵育时间等条件下进行体外孵育,通过高效液相色谱仪检测其药物代谢(抑制)动力学参数,并将对照组进行比较分析。结果表明,本研究成功从人Bama小型猪肝组织克隆了P4503A46基因,并通过G418筛选,成功建立了细胞稳定表达株,其硝苯地平代谢活性显著高于阴性对照组(P0.01);因此,成功克隆、并建立了小型猪P4503A46的稳定表达细胞株(Hep G2-P4503A46),该细胞株具有显著的硝苯地平代谢活性。     

氰戊菊酯对草鱼肝微粒体CYP3A活性的影响

通过设计1.2、6.0、12.0μg/L 3个氰戊菊酯质量浓度组,1个空白对照组,1个恩诺沙星阳性对照组,进行氰戊菊酯对草鱼肝微粒体CYP3A活性影响及草鱼CYP3A活性的组织分布研究。结果表明:CYP3A存在于肝脏、鳃、肾脏、脾、肠、脑组织中,其中肝脏中活性最高;氰戊菊酯能显著抑制CYP3A的活性,随暴露时间的延长抑制作用增强,但抑制趋势减弱,3 d内趋势最强,各试验浓度组之间的差异不显著。建议临床用药,尤其是联合用药、多次用药时要充分考虑氰戊菊酯对代谢酶活性的影响。     

复方柴芩颗粒对鸭黄曲霉毒素慢性中毒CYP450酶活性的影响

建立肉鸭aflatoxin B1（AFB1）慢性中毒模型,设立正常组、模型组、亚硒酸钠组、复方柴芩颗粒（中药）高、中、低剂量组。造模后第7,14和21天处死肉鸭取肝,采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测肝标本中CYP3A4,CYP1A2和CYP2E1活性。结果表明,与模型组相比,中药高、中、低剂量组用药7和14 d后肝脏微粒体细胞色素P450酶系CYP3A4,CYP1A2和CYP2E1活性显著降低;用药21 d后CYP3A4,CYP1A2和CYP2E1活性升高,但与模型组相比差异不明显。说明前期复方柴芩颗粒通过抑制CYP3A4,CYP1A2和CYP2E1活性,减少AFB1前体物质代谢激活,降低其化学性肝脏损伤达到保护肝脏的作用。而用药后21 d CYP450活性升高的原因可能是AFB1蓄积较多,需要更多的CYP450代谢AFB1。     

辛硫磷对鲫鱼肝微粒体中CYP1A活性及其表达水平的影响

[目的]研究辛硫磷暴露对鲫鱼肝微粒体中细胞色素P4501a(CYP1A)活性及其mRNA和蛋白表达的影响,明确其剂量—效应及时间—效应关系,为揭示有机磷农药对水生生物的代谢调节机制提供理论依据.[方法]设辛硫磷低、中、高浓度组(0.0825、0.165和0.33 mg/L)和丙酮(助溶剂)对照组,采用半静态染毒法染毒鲫鱼,分别于染毒24、48、72和96 h后取样并迅速剖解取出鲫鱼肝胰脏,以CYP1A相关酶7-乙氧基-3-异吩唑酮-脱乙基酶(EROD)活性反映CYP1A活性,采用实时荧光定量PCR和Western blotting分别测定鲫鱼肝微粒体中CYP1A基因mRNA及其蛋白的表达情况.[结果]辛硫磷对鲫鱼肝微粒体中CYP1A活性产生抑制作用,辛硫磷染毒24 h时CYP1A活性与辛硫磷存在明显的剂量—效应关系;各辛硫磷浓度组间均存在明显的时间—效应关系,至染毒96 h时低、中、高浓度组鲫鱼肝微粒体中CYP1A活性分别较对照组下降54.7%、30.4%和65.5%,且差异极显著(P<0.01,下同).辛硫磷染毒后,鲫鱼肝微粒体中CYP1A基因mRNA的表达整体上呈明显下调趋势,各染毒时间组间均存在较强的剂量—效应关系,除染毒48 h时CYP1A基因mRNA相对表达量与辛硫磷浓度呈正相关外,其他染毒时间点均呈负相关.辛硫磷对鲫鱼肝微粒体中CYP1A蛋白表达的影响均达极显著水平,且呈明显的剂量—效应及时间—效应关系,至染毒96 h时低、中、高浓度组的表达量分别较对照组降低74.6%、82.6%和85.7%.[结论]辛硫磷能抑制鲫鱼肝微粒体中CYP1A活性并下调CYP1A基因mRNA及其蛋白的表达;相对于辛硫磷产生的剂量—效应影响,其对CYP1A活性及其蛋白表达的时间—效应影响更明显.     

黄芩等中药提取物对异育银鲫肝微粒体CYP1A和CYP3A的抑制作用

通过肝微粒体体外孵育实验,研究黄芩、柴胡、连翘、吴茱萸和野菊花5种中药提取物对异育银鲫肝微粒体CYP450的影响。体外给药测定IC₅₀以及相关酶动力学参数,并推测其可能的作用机制。结果显示, 5种中药对7乙氧基异吩唑酮-O-脱乙基酶(EROD) (CYP1A标志酶)的抑制程度为黄芩>连翘>野菊花>柴胡≈吴茱萸,半抑制浓度（₅₀）依次为0.27,2.88,7.62,16.20和16.42 mg/mL,酶促反应动力学常数V_max 和K_m为（83.33±11.32） pmol/(min·mg)和（3.05±0.89） μmol/L。据此计算黄芩、连翘、野菊花、柴胡和吴茱萸的抑制常数分别为0.16、0.39、0.61、0.40和0.59 mg/mL;黄芩、连翘和吴茱萸对红霉素N-脱甲基酶（ERND）（CYP3A标志酶）有很弱的抑制作用,IC₅₀分别为90.9,70.8和43.5 mg/mL。柴胡和野菊花未检测到对ERND有抑制作用。结果表明,这5种中药对CYP酶的影响因亚型不同而差别较大,对CYP1A的抑制均较显著,而对CYP3A的抑制则不明显。进一步研究它们对CYP1A的抑制机制,推测黄芩、柴胡和吴茱萸对EROD的抑制为竞争性抑制,野菊花和连翘则是反竞争性抑制。建议这5种中药与其他渔药合用时,要注意其引起其他渔药的药动学的变化,使疗效发生改变。     

采用特异性探针药物法测定双峰驼CYP3A酶活性

【目的】探究双峰驼CYP3A酶体外活性及其对外源性药物代谢的影响。【方法】将双峰驼禁食过夜12 h,颈静脉放血处死后,立即于肝门静脉处采集块状肝脏组织,洗去血污称重匀浆后,采用Ca²⁺沉淀法制备双峰驼肝微粒体,并通过BCA法测定其蛋白含量。同时优化双峰驼肝微粒孵育体系,取不同浓度的双峰驼肝微粒体蛋白悬液（0.016、0.031、0.063、0.125、0.250、0.500、1.000、2.000 mg?mL^-1）、不同浓度的探针药物咪达唑仑（MDZ）（7.813、15.625、31.250、62.500、125、250、500、1 000 µg?mL^-1）分别加入到孵育体系中,37℃预孵育5 min后,加入NADPH溶液后再孵育不同时间（0、2、5、10、15、20、25、30 min）。待反应完全后加入冰冷的甲醇和地西泮（DZP）溶液,涡旋混匀,800 µL全部混合液体经14 500 r/min离心20 min后,取20 µL上清液进行高效液相色谱紫外检测（HPLC-UV）,确定最适底物浓度、最适酶浓度以及最适孵育时间。分别取浓度为7.813、15.625、31.250、62.500、125、250、500、1 000 µg?mL^-1 MDZ探针药物溶液20 µL与双峰驼肝微粒体共同孵育15 min后,以混有内标DZP的冰冷甲醇终止反应,采用高效液相色谱紫外检测法测定反应产物1'-羟基咪达唑仑（1'-OHMDZ）的动态含量,计算出部分药物动力学参数。色谱条件：Sigma-Aldrich/Supelco Discovery C₁₈色谱柱（150 mm×4.6 mm,5 μm）;流动相为V（乙腈）﹕V（0.01 mol?L^-1 PBS缓冲液）= 40﹕60;等浓度洗脱20 min;检测波长为254 nm;流速为0.8 mL?min^-1;柱温为30℃;进样量为20 μL。【结果】使用Ca²⁺沉淀法制备的双峰驼肝微粒体保持了酶的良好活性,能满足后续体外药物代谢试验的基本要求,经BCA法测定其蛋白含量为(1.936±0.052) mg?mL^-1。双峰驼肝微粒体蛋白悬液、探针药物MDZ、PBS缓冲液、MgCl₂溶液以及NADPH溶液构成双峰驼肝微粒体孵育体系,随着孵育时间的延长,酶和底物进一步反应,当MDZ浓度为125 µg?mL^-1（终浓度为7.073 nmol?mL^-1）,肝微粒体浓度为2.000 mg?mL^-1（终浓度为0.050 mg?mL^-1）时,孵育15 min,酶和底物的结合最紧密,并呈现出饱和的状态,故确定其终浓度和时间为最适浓度和最佳孵育时间。经HPLC-UV法测定,1'-OHMDZ、MDZ和DZP的出峰保留时间分别为6.710、11.383和15.263 min,各成分色谱峰分离良好,且不受肝微粒体孵育体系中其他干扰峰的影响。HPLC检测方法的精密度、稳定性及回收率的试验结果均符合色谱测定的基本要求,即成功建立了准确、灵敏、可靠、重现性好的双峰驼CYP3A酶特异性探针药物的检测方法。以底物MDZ浓度和反应产物1'-OHMDZ生成速率进行Lineweaver-Burk双倒数作图,分别计算出最大反应速度V_max和米氏常数K_m。经Origin Pro8.6软件进行线性回归分析得到最大反应速度V_max为(0.380±0.028)nmol?mg^-1?min^-1,米氏常数K_m为(9.603±3.229)nmol?mL^-1,以此体现酶和底物的反应情况,并对双峰驼CYP3A酶的活性进行了间接测定。【结论】成功建立了跟踪检测CYP3A酶的特异性探针药物MDZ及其代谢产物浓度的高效液相色谱紫外检测方法。MDZ在体内经CYP3A酶的特异性氧化代谢后主要生成1'-OHMDZ,本文以MDZ的代谢产物1'-OHMDZ的生成速率为检测指标,首次对双峰驼CYP3A酶的体外活性及酶与底物的相互作用特点进行了研究。     

猫眼草黄素对不同来源大鼠肝微粒体CYP450亚酶活性影响的对比研究

采用“Cocktail”探针底物法,分别以咪达唑仑、非那西丁、香豆素、奥美拉唑、氯唑沙宗、右美沙芬、甲苯磺丁脲作为CYP3A4、1A2、2A6、2C19、2E1、2D6、2C9的特异性探针底物,采用RP-HPLC-UV测定体系中底物浓度变化,比较猫眼草黄素对不同来源肝微粒体体系中(市售/自制)各亚酶活性影响及抑制类型差异。结果表明：猫眼草黄素在市售大鼠肝微粒体孵育体系中,对CYP1A2、3A4、2E1、2C19存在抑制作用,IC₅₀值分别为0.005 (CYP1A2)、0.006 (CYP2C19)、0.003 (CYP3A4)、0.028 (CYP2E1) mmol·L^-1,表明其对1A2、3A4抑制活性更强,但对3A4可能存在低浓度诱导、高浓度抑制的双重调节。抑制类型分别为非竞争性抑制和反竞争性抑制,K_i值分别为0.004 1、0.003 7 mmol·L^-1;在自制大鼠肝微粒体体外孵育体系中,药物对CYP2C9、2A6、3A4存在不同程度的抑制作用,但反而显著提高CYP2C19酶活性,且无法确...     

赤子爱胜蚓对氯氰菊酯暴露的生态毒性响应

以赤子爱胜蚓为供试生物,采用滤纸接触法及土壤培养法,通过急性毒性、生长毒性、再生繁殖毒性试验及CYP3A4酶活性毒性响应试验,进行了在不同生态响应水平上氯氰菊酯胁迫对蚯蚓的毒性效应研究,初步确定了急性毒性、生长繁殖和细胞酶活力指标的敏感性.结果表明:滤纸试验中氯氰菊酯对蚯蚓的48 h LC50和72h LC50分别为445.4、212.1 μg·cm-2,土壤试验中7d LC50和14 d LC50分别为121.6、80.2 mg· kg-1;再生繁殖试验中低剂量氯氰菊酯刺激蚯蚓体重增长、短期内诱导蚯蚓产茧率,抑制蚯蚓幼体孵育.CYP3A4酶活性毒性响应滤纸试验中氯氰菊酯对蚯蚓的CYP3A4酶活性产生明显诱导的浓度为21.5 ng·cm-2,在214.8 ng·cm-2产生明显的抑制作用;土壤试验中3d暴露后,10 mg·kg-1氯氰菊酯诱导蚯蚓体内CYP3A4活性显著升高,随着暴露时间延长,氯氰菊酯对CYP3A4活性的诱导作用始终存在,但诱导的高值浓度随暴露时间的延长而降低,CYP3A4酶活力与土壤中氯氰菊酯浓度之间呈现明显的倒U型量-效响应曲线.研究表明,各指标敏感性表现为细胞酶活力＞生长繁殖＞急性毒性,同时也证明了CYP3A4可以作为土壤拟除虫菊酯风险评价的潜在敏感生物标记物.     

从江香猪CYP2A19基因单核苷酸多态性的群体遗传学分析

[目的]评估从江香猪CYP2A 19基因的纯合度及遗传变异,为开发从江香猪药物代谢模型积累基础资料.[方法]应用SNaPshot检测方法对141份从江香猪样本CYP2A 19基因编码区rs323914689、rs81217981、rs333289891、rs343272409位点及3’端非翻译区rs338584662和rs321736682位点进行分型分析,并计算从江香猪种群的基因型频率、等位基因频率、有效等位基因数(Ne)、杂合度(He)、多态位点数及多态位点百分比.[结果]除rs333289891位点表现为单态外,其余5个位点均检测到2种或3种基因型,多态位点百分比为83.33%.X2检验结果显示,5个多态位点均处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05).5个多态位点的Ne介于1.0071~1.3129,He介于0.0071~0.2057.[结论]不同品系猪种由于遗传背景差异而具有不同的单核苷酸变异,其药物代谢特性也因此存在差异.从江香猪群体纯合度高、遗传稳定性好、变异程度低,是其作为药物代谢动物模型的关键基础.     

复方柴芩颗粒对实验性黄曲霉毒素慢性中毒鸭CYP450酶表达的影响

建立肉鸭黄曲霉毒素（AFB1）慢性中毒模型,设立正常组、AFB1模型组、亚硒酸钠组、中药高剂量组、中药中剂量组和中药低剂量组,采用荧光定量PCR（RT-PCR）法和免疫蛋白印迹（Western\|bolt）法检测肝标本中 CYP3A4,CYP1A2,CYP2E1的mRNA和蛋白表达来探讨复方柴芩颗粒对鸭黄曲霉毒素慢性中毒肝脏微粒体细胞色素P450（cytochrome P450,CYP450）酶系CYP3A4,CYP1A2和CYP2E1表达的影响,并借此深入探讨其解毒机制。结果显示,与模型组相比,中药高、中、低3个剂量组用药7,14和21 d后肝脏微粒体细胞色素P450酶系CYP3A4,CYP1A2和CYP2E1的mRNA相对表达量显著降低。与模型组相比,中药高、中、低3个剂量组用药7～14 d,则CYP3A4,CYP1A2和CYP2E1蛋白表达量显著降低;用药21 d后高剂量组3种基因型蛋白表达量显著降低。研究表明,复方柴芩颗粒连续用药1～2周能有效地降低由鸭黄曲霉毒素慢性中毒引起的CYP1A2,CYP2E1,CYP3A4 mRNA相对表达量和蛋白表达量升高的趋势,但随用药时间增加,各组的CYP1A2,CYP2E1,CYP3A4 mRNA相对表达量和蛋白表达量逐渐升高。     

速眠新对大鼠原代肝细胞CYP3A1、CYP2E1的影响

胶原酶二步灌流法获取原代大鼠肝细胞,用不同浓度的速眠新和保定宁处理,Western blot法测定肝细胞中细胞色素酶P450 3A1(CYP3A1)和细胞色素酶P4502E1(CYP 2E1)的表达水平.结果表明:通过胶原酶灌流法,每只大鼠可获得2～4×108个肝细胞,成活率约为95%.用速眠新、保定宁处理后,肝细胞CYP3A1和CYP2E1的表达随速眠新、保定宁浓度的增加和处理时间的延长而呈升高的趋势.原代大鼠肝细胞可用于速眠新药物代谢分子机制的研究,为其临床上合理地应用提供了理论依据.     

肠侵袭性大肠杆菌感染野猪的诊断和药敏试验

无菌取病死野猪的心脏、肝脏、肺脏、脾脏及肾脏等组织病料,进行细菌的分离培养与PCR鉴定,分离出肠侵袭性大肠杆菌。结合临床症状、剖检病变和实验室诊断,从而确诊野猪病死于肠侵袭性大肠杆菌感染。并对分离菌株进行药敏试验,为野猪的肠侵袭性大肠杆菌感染疾病的诊断和防治提供参考。     

微囊藻毒素对鲢鱼肝脏GST和CYP7A1基因表达的影响

为探究微囊藻毒素(MC)对鲢鱼肝脏谷胱甘肽S转移酶(GST)和胆固醇7α-羟化酶(CYP7A1)基因表达的影响,克隆了鲢鱼肝脏GST和CYP7A1基因的部分c DNA片段,并对饲养密度为1.3×108cell/L的有毒和无毒两种铜绿微囊藻水体中第2 d、第4 d和第6 d的鲢鱼肝脏取样,通过RT-PCR与Q-PCR技术分析肝脏GST和CYP7A1基因在MC影响下不同时间点的表达情况。结果显示,有毒铜绿微囊藻水体中鲢鱼肝脏GST相对表达量在第6 d显著下降,说明GST基因在第6 d时在MC解毒过程中开始发挥作用;鲢鱼CYP7A1相对表达量自第2 d开始显著下调并随时间延续维持在一个较低的水平,说明MC作用下CYP7A1表达受到抑制,可能对胆汁酸合成造成影响。为进一步研究鱼类微囊藻毒素去毒基因以及抑制对MC转运和吸收的关键基因提供依据。     

猪乳脂肪球表面因子8的克隆与表达分布

基于电子延伸序列,本试验成功克隆了猪乳脂肪球表面因子8（MFGE8）基因（GenBank登录号：EU559724）并进行了序列分析,同时利用RT-PCR方法分析了MFGE8基因的组织分布规律。序列分析结果表明MFGE8开放读码框全长为1296bp,编码431个氨基酸残基的多肽链,克隆的MFGE8基因与人、大鼠、小鼠、牛的同源性分别为71．9％、78．7％、79．1％、87．7％,推测的氨基酸序列的同源性分别为65．7％、74．0％、74．0％、84．5％。氨基酸序列N端含有Notch样“EGF”结构,C端含有FA58C结构域。构建的系统发育树显示猪与牛的亲缘关系最近。组织表达分析结果表明MFGE8在乳腺中表达最高,在大脑中表达量最低。     

小立碗藓细胞色素P450基因CYP73A49的克隆与功能分析

本研究克隆了一个小立碗藓（Physcomitrella patens）P450基因CYP73A49,其cDNA全长1629bp,预测编码542个氨基酸。为了进一步研究其生物学功能,利用同源重组技术对CYP73A49基因实施定点突变,成功构建了能诱导其功能缺失的载体,并获得了苔藓的功能缺失突变体。     

猪Hepcidin基因的克隆与序列分析

通过RT-PCR技术从猪肝脏总RNA中扩增出Hepcidin基因的编码序列,将该序列及其推导的氨基酸序列与其它17个已知物种的相应序列进行同源性分析,并构建系统进化树。结果表明,克隆得到的Hepcidin基因cDNA序列长278 bp,编码82个氨基酸,预测的蛋白分子质量和等电点分别为8.76 ku和9.06;与已知牛的Hepcidin序列同源性最高,达81.71%,不同物种Hepcidin蛋白具有高度的保守性,Hepcidin蛋白物种进化树符合物种进化规律。本研究为今后阐明Hepeidin基因表达特性、表达产物理化性质、抗菌活性及其相关功能等奠定基础。