猪乳脂肪球表面因子8的克隆与表达分布

基于电子延伸序列,本试验成功克隆了猪乳脂肪球表面因子8（MFGE8）基因（GenBank登录号：EU559724）并进行了序列分析,同时利用RT-PCR方法分析了MFGE8基因的组织分布规律。序列分析结果表明MFGE8开放读码框全长为1296bp,编码431个氨基酸残基的多肽链,克隆的MFGE8基因与人、大鼠、小鼠、牛的同源性分别为71．9％、78．7％、79．1％、87．7％,推测的氨基酸序列的同源性分别为65．7％、74．0％、74．0％、84．5％。氨基酸序列N端含有Notch样“EGF”结构,C端含有FA58C结构域。构建的系统发育树显示猪与牛的亲缘关系最近。组织表达分析结果表明MFGE8在乳腺中表达最高,在大脑中表达量最低。     

猪Mighty基因的克隆与组织表达分析

Mighty基因是在骨骼肌中发现的一个新颖的肌形成前期因子。基于电子延伸序列,本试验成功克隆出了Mighty基因,其全长874 bp,开放阅读框为579 bp,编码有193个氨基酸,提交GenBank(EU559709)。同时,试验采取半定量RT-PCR法,以18S rRNA为内标,研究了Mighty基因在仔猪18个组织中的分布和mRNA的表达水平。     

猪肿瘤抑制基因候选5的克隆与序列分析

基于电子延伸序列,克隆了仔猪肿瘤抑制基因候选5(TUSC5),并初步分析其组织分布情况;获得了TUSC5基因的全长序列636bp,包括开放阅读框架(ORF)534bp,编码177个氨基酸。克隆的仔猪TUSC5基因与人、小鼠、大鼠的TUSC5基因序列的同源性分别为83.5%,82.4%,82.6%,推测的氨基酸序列同源性分别为71.2%,77.5%,78%,成功克隆了猪TUSC5基因。     

仔猪组织基因表达中实时定量PCR内参基因的选择

实时定量PCR研究中需要选择表达稳定性高的内参基因才能准确地校正目标基因的表达量。以仔猪不同组织为研究对象,应用实时荧光定量PCR技术,检测了beta-肌动蛋白（ACTB）、beta-2-微球蛋白（B2M）、3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）、羟甲基胆素合成酶（HMBS）、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶1（HPRT1）、核糖体蛋白L4（RPL4）、琥珀酸脱氢酶（亚基A）（SDHA）、TATA盒结合蛋白1（TBP1）和酪氨酸3-单氧化酶/色氨酸5-单氧化酶激活蛋白zeta多肽（YWHAZ）共9个看家基因mRNA水平的表达情况。经geNorm程序统计学分析处理,结果表明,9个看家基因的表达稳定性为HMBS和HPRT1〉RPL4〉TBP1〉B2M〉YWHAZ〉SDHA〉GAPDH〉ACTB,确定了HMBS基因在仔猪不同组织中用于校正目标基因的表达量为最佳选择,而RPL4基因则可以作为高转录本的内参基因。     

猪KISS-1基因克隆、序列分析

在猪的不同组织中克隆KISS-1基因,提取总RNA,利用设计的引物进行RT-PCR,PCR产物与pMD-19T载体连接后转化E．coliDH5α,检测阳性克隆并测序;结果：克隆的猪KISS-1基因与牛、人、大鼠、小鼠同源性分别为81．0％、76．8％、71．4％、72．4％;克隆了猪KISS-1基因全长并注册GenBank（Accession．EU934235）,猪KISS-1基因在多种组织中表达。     

猪神经介素B和受体基因的克隆与组织分布

基于电子延伸序列,克隆并分析了猪神经介素B(NMB)和受体(NMBR)基因。猪NMBcDNA克隆片段长度为567 bp,开放阅读框架长度为366 bp,编码121个氨基酸。NMBR cDNA克隆片段长度为1 194 bp,开放阅读框架长度为1 173 bp,编码390个氨基酸。同源分析表明,猪NMB的核酸序列与牛、人、小鼠和大鼠的同源性分别为87.1%,85.2%,78.1%和76.6%,氨基酸序列的同源性分别为81%,74.4%,70.2%和70.1%;NMBR的核酸序列与牛、人、小鼠和大鼠的同源性分别为91%,89%,84.2%和83.6%,氨基酸序列的同源性分别为92.3%,90.3%,86.9%和86.4%。组织分布结果显示,猪NMB在多种组织均有分布,NMBR仅分布在大脑。克隆的猪NMB和受体基因分别注册GenBank(EU375564和EU670045)。