柔嫩艾美耳球虫河北株致病性检测及ITS-1基因序列分析

为分析鸡柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)河北株的致病性及其ITS-1基因序列遗传变异特点,对临床分离的柔嫩艾美耳球虫河北株通过人工感染雏鸡试验验证其致病性,并计算其半数致死量(LD_(50)),采用RT-PCR对柔嫩艾美耳球虫河北株的ITS-1基因进行扩增、克隆,测序后进行生物信息学分析其基因序列变异情况。结果显示:柔嫩艾美耳球虫河北株对雏鸡有较强的致病性,其LD_(50)为3.16×10~4个/只;柔嫩艾美耳球虫河北株的ITS-1基因与GenBank登录的柔嫩艾美耳球虫ETSH4PF3-17株和柔嫩艾美耳球虫上海株的相似性在97.7%～99.0%之间,系统发育进化树分析显示柔嫩艾美耳球虫河北株与GenBank发表的柔嫩艾美耳球虫ETSH4PF3-17株和柔嫩艾美耳球虫上海株聚为一支,亲缘性最近,与其它虫株亲缘性较远;与GenBank发表的柔嫩艾美耳球虫ETSH4PF3-17株序列相比,柔嫩艾美耳球虫河北株的ITS-1基因序列中在第4、13、16、425位4个碱基发生缺失;第258、348位2个碱基发生变异,由C变为T,由G变为T。研究结果为进一步研究柔嫩艾美耳球虫河北株遗传变异情况提供参考依据。     

3株柔嫩艾美耳球虫28SrRNA基因部分序列的扩增与分析

本研究应用PCR技术扩增来自广东的3株柔嫩艾美耳球虫的28S rRNA基因部分序列,并与GenBank^TM登录的柔嫩艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫、鼠肉孢子虫和刚地弓形虫虫株的相应序列进行比对分析。试验结果显示,柔嫩艾美耳球虫3个样品均获得1172 bp的28S rRNA基因部分有效序列,不同虫株序列没有差异,与GenBank^TM登录的柔嫩艾美耳球虫相应序列只有一个碱基差异,显示种内序列高度保守,而与堆型艾美耳球虫、鼠肉孢子虫、刚地弓形虫相应的序列存在不同程度的差异。结果表明,28S rRNA基因部分序列可作为研究艾美耳球虫种间及其他顶复门原虫遗传变异的标记。     

鸡艾美耳球虫18SrDNA序列与系统进化分析

为了确定鸡艾美耳球虫（Eimeria）不同种以及来自不同地区同种不同株之间的亲缘关系,研究其分类地位,对实验室保藏的柔嫩艾美耳球虫（Etenella）、毒害艾美耳球虫（Eneeatrix）、巨型艾美耳球虫（Emaxima）、堆形艾美耳球虫（Eaaervulina）等4种15株鸡球虫孢子化卵囊的18SrDNA基因进行克隆、测序,并与从GenBank下载的鸡球虫18SrDNA序列一起,使用软件DNAstar 5．0 MegAlign进行系统发育分析。结果显示,4种艾美耳球虫种间同源性在94．6％～99．4％之间,7株柔嫩艾美耳球虫的株间同源性在99．0％-99．9％之间,5株巨型艾美耳球虫的株间同源性在96．9％～99．8％之间。用该4种鸡球虫的18SrDNA序列与GenBank下载的另外4种鸡球虫18SrDNA序列构建系统发育树,显示这8种鸡艾美耳球虫形成2个分支,即堆形艾美耳球虫（EASH）、巨型艾美耳球虫（EMSH）、变位艾美耳球虫（Emivati）、和缓艾美耳球虫（Emitis）、布氏艾美耳球虫（Ebrunetti）、早熟艾美耳球虫（Epraecox）构成1个分支,柔嫩艾美耳球虫（ENSH）、毒害艾美耳球虫（ETAS）构成另1分支。巨型艾美耳球虫、柔嫩艾美耳球虫各株的系统发育树均根据地域关系产生2个分支。柔嫩艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫的亲缘关系较近,不同地理区域的同种不同株的亲缘关系相对较远,种间和种内的鉴定结果与普通生物学结果一致。本研究提示18SrDNA基因可用于鸡球虫不同种／株的分类鉴定,为艾美耳球虫分子遗传学鉴定提供了理论基础。     

鸡柔嫩艾美耳球虫HAP2基因的克隆与生物信息学分析

为研究鸡柔嫩艾美耳球虫HAP2(Hapless2/generative cell-specific)基因的抗原性,根据GenBank发表的HAP2基因的cDNA序列ORF设计一对引物,用RT-PCR方法从柔嫩艾美耳球虫配子体总RNA中扩增HAP2基因,将扩增产物与pMD18-T载体连接后进行测序和序列分析,同时应用生物信息学软件对HAP2基因表达蛋白的结构域和在柔嫩艾美耳球虫生活史的各阶段表达情况进行预测。结果获得867 bp的目的基因扩增片段,经同源性分析比较柔嫩艾美耳球虫HAP2基因与其他艾美耳球虫种HAP2基因同源性在70%以上,该基因所表达的蛋白主要在球虫配子生殖阶段的配子体和未孢子化的卵囊中表达。说明HAP2基因具有作为传播阻断疫苗的候选抗原的可行性。     

用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行球虫同工酶的研究

用聚丙烯酰胺凝胶电泳,对柔嫩艾美耳球虫和斯氏艾美耳球虫孢子化卵囊,进行了乳酸脱氢酶(LDH)、葡萄糖磷酸同分异构酶(GPI)和6—磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6PGD)同工酶的初步研究。结果表明柔嫩艾美耳球虫和斯氏艾美耳球虫的LDH和GPI同工酶酶谱存在明显差异,6PGD同工酶酶谱则一致。柔嫩艾美耳球虫的LDH、GPI和6PGD均为1条带,而斯氏艾美耳球虫的LDH为2条带,其位置与柔嫩艾美耳球虫明显不同,斯氏艾美耳球虫的GPI呈现2条带,其中1条的位置同柔嫩艾美耳球虫基本一致。作者认为,聚丙烯酰胺凝胶电泳可作为球虫同工酶研究的一种方法。讨论了同工酶技术在球虫虫种、虫株的鉴定,在致弱株、耐药株的确定,以及在遗传学、免疫学等方面的应用前景     

不同来源柔嫩艾美耳球虫虫株微线体3基因的克隆和序列分析

以8株不同来源柔嫩艾美耳球虫分离株为研究对象,对其艾美耳球虫微线体3(Eimeria tenella microneme protein,EtMIC3)基因进行了RT-PCR扩增、测序及序列分析,并与GenBank上已发表的柔嫩艾美尔球虫相关序列进行比较,研究EtMIC3基因遗传变异情况。结果获得2976 bp的目的片段,各株与FJ374765.1 CDs的序列相似性在99.8%~99.9%之间,各株之间的序列相似性为99.9%~100.0%,各株编码的氨基酸序列与GenBank登记的柔嫩艾美耳球虫EtMIC3蛋白(ACJ11219)相似性在99.6%~99.9%之间,不同地理来源或耐药性虫株之间没有明显差异。本研究首次对中国EtMIC3基因进行了序列分析,结果显示不同来源株EtMIC3基因高度保守,为有效的疫苗候选因子,为进一步进行柔嫩艾美耳球虫基因工程疫苗构建的研究奠定了基础。     

柔嫩艾美耳球虫江苏株微线蛋白-3基因的克隆与序列分析

柔嫩艾美耳球虫微线蛋白-3(EtMIC3)不仅在虫体侵入中起关键作用,而且还决定了球虫侵入部位特异性。为克隆柔嫩艾美耳球虫江苏株的EtMIC3基因,根据GenBank上登录的EtMIC3基因序列设计特异性引物,以子孢子总RNA为模板,用RT-PCR的方法扩增EtMIC3的cDNA序列,将其与pMD19-T连接后送至上海英骏生物技术有限公司测序并进行序列分析。结果表明EtMIC3的开放阅读框(ORF)为2 967 bp,编码988个氨基酸,与GenBank上的EtMIC3基因(登录号:FJ374765.1)比较,核苷酸同源性为99%,推导的氨基酸序列同源性为99%。本研究为揭示柔嫩艾美耳球虫入侵和寄生部位特异性的分子机制提供基础,也为柔嫩艾美耳球虫新型疫苗的研制提供候选抗原。     

柔嫩艾美耳球虫河北株SOSO7基因克隆与序列分析

为分析柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)河北株SO7基因序列遗传变异性,试验根据GenBank发表的SO7序列设计引物,利用RT-PCR技术克隆出柔嫩艾美耳球虫河北株SO7基因,将SO7基因克隆入pMD18-T载体中,进行测序、序列分析及表达蛋白结构的预测。结果显示:柔嫩艾美耳球虫河北株SO7基因编码215个氨基酸,具有一个开放阅读框,大小为645 bp;与GenBank中发表的美国分离株(LS18)、扬州分离株(YZ)、海南分离株(HN)、广东分离株(GD)、北京分离株(BJ)SO7核苷酸序列的同源性分别为99.4%、99.5%、99.7%、99.5%、99.4%,所推导的氨基酸序列的同源性分别为98.6%、99.1%、99.1%、98.6%、98.1%。从进化关系来看,同种间SO7基因相比,柔嫩艾美耳球虫河北株与HN株同属一个分支,遗传关系较近;与GD株、BJ株的遗传关系相对较远。蛋白结构预测显示蛋白的相对分子质量为52.20 ku,理论等电点(PI)为5.08,不稳定系数为52.73,为不稳定蛋白;在1~20个氨基酸具有信号肽;有5个疏水位点;没有跨膜结构。综上所述,柔嫩艾美耳球虫河北株SO7基因序列遗传变异性不明显,可以作为构建核酸疫苗候选基因。     

基于ITS1-5.8S rRNA-ITS2序列兔肝球虫PCR检测方法的建立

通过对多种鸡球虫和松鼠球虫18S rRNA和28S rRNA进行序列比对分析,在18S rRNA 3’端和28S rRNA 5’端保守区设计艾美耳属通用引物,以斯氏艾美耳球虫洛阳分离株LY卵囊基因组DNA为模板首次成功克隆到斯氏艾美耳球虫完整的ITS1-5.8S rRNA-ITS2序列,其大小为1178bp,其中ITS1序列长度为423bp,5.8S rRNA为155 bp,ITS2为600 bp,斯氏艾美耳球虫LY株ITS1/2序列高度变异,与鸡球虫、啮齿动物球虫的序列同源性低于60%。然后在斯氏艾美耳球虫ITS1/2序列超变区设计种特异引物,建立了灵敏、特异的PCR检测方法。本研究结果将为兔球虫强致病种的临床诊断和揭示兔球虫种群遗传特征提供有效的分子工具。     

5株堆形艾美耳球虫线粒体cox3基因的扩增及序列分析

以5株堆形艾美耳球虫为研究对象,对其线粒体细胞色素c氧化酶第Ⅲ亚基(cox3)的部分基因(pcox3)进行了PCR扩增、测序及序列分析,并与GenBank上已发表的顶复门原虫相关序列进行比较,研究其线粒体cox3基因遗传变异情况。结果每个虫株均获得572bp的目的片段,利用DNAStar软件进行序列比对,5株堆形艾美耳球虫线粒体pcox3序列完全一致,与疟原虫和住白细胞虫相应序列的相似性分别为51%和50%,而与泰勒虫的相似性少于50%。本研究首次报道了堆形艾美耳球虫pcox3序列,结果显示不同来源的堆形艾美耳球虫pcox3序列没有差异,与毒力无关,为进一步研究艾美耳球虫的群体遗传学奠定了基础。     

Trail antigen in Eimeria stiedai sporozoites associated with a thrombospondin-related motif and the entry of cultured cells

In order to examine the antigenic similarity and specificity of the trail antigen of Eimeria stiedai and Etp 100, a microneme protein of Eimeria tenella, monoclonal antibodies to the trail antigen of E. stiedai sporozoites were selected by an indirect immunofluorescent antibody method. The monoclonal antibody of one clone, 3D10, reacted with the anterior portion of non-fixed sporozoites. By immunoblotting, the monoclonal antibody was found to react with a 100 kDa antigen of E. stiedai sporozoites, and a 117 kDa antigen of E. tenella sporozoites and merozoites. It was also found to react with a recombinant protein with thrombospondin-/properdin-like motifs homologous to E. tenella microneme protein Etp 100. The monoclonal antibody significantly inhibited the penetration of E. stiedai sporozoites into cultured rabbit hepatobiliary epithelial cells. These results suggest that E. stiedai sporozoites have a trail antigen, located in the anterior region on the outer surface of the sporozoites, which has an epitope with thrombospondin-/properdin-like motifs similar to E. tenella microneme protein Etp 100. This protein may play an important functional role in the process of penetration of host cells.     

利用单孢子囊接种技术建立鸡柔嫩艾美耳球虫克隆

利用显微操作从柔嫩艾美耳球虫长春株、河北株、山东株(由单卵囊接种建立)挑选出单孢子囊接种于雏鸡,接种成功率为17.8%。传代后提取DNA,用7条随机引物PCR扩增,鉴别RAPD图谱及特异条带,结果获得柔嫩艾美耳球虫长春株2个克隆、河北株2个克隆、山东株1个克隆。     

五种不同地理株柔嫩艾美耳球虫免疫保护性比较

用五个不同地理株的柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella），即：广州株、保定株、长春株、北京株、沈阳株，对12日龄雏鸡分别进行免疫攻虫。通过OPG计数，粪便计分，盲肠病变计分，增重测定，计算保护率。结果发现不同地理株球虫的免疫保护率有明显差异，广州株80．2％〉保定株73．2％〉长春株68．4％〉北京株63．8％〉沈阳株51．0％。其中广州株比其他虫株有显著保护率（P〈0．01）。免疫后的雏鸡抽血进行CD4^＋、CD8^＋T细胞检测，结果各株均能引起两种T细胞数量增加，表明CD4^＋、CD8^＋T细胞在球虫免疫中起着重要作用。     

银染mRNA差异显示法克隆柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)抗药性相关基因

以柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）敏感株、地克珠利抗药株和马杜拉霉素抗药株孢子化卵囊为材料，用银染mRNA差异显示方法筛选和克隆与球虫抗药性相关的基因。首先提取这3个虫株孢子化卵囊的总RNA为模板．用Oligo（dT）12GG为锚定引物和2个10碱基随机引物组合进行RTPCR，产物经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后银染。分别切取5务差异条带，进行2次PCR扩增，产物回收后与PGEM—T—easy Vector连接转化。经PCR鉴定正确后，再进行斑点杂交试验、序列分析和同源性比较。结果发现，地克珠利抗药株和马杜拉霉素抗药株分离的差异片段中都有2个cDNA片段（可能为新的基因片段），这为克隆全长cDNA和探索球虫抗药性产生的分子机理奠定了一定的基础。     

柔嫩艾美耳球虫马杜拉霉素抗药株与敏感株的mRNA差异显示

利用柔嫩艾美耳球虫马杜霉素敏感虫株裂殖子和抗药虫株裂殖子为材料,对马杜霉素敏感虫株和抗药虫株进行差异显示PCR,共回收34条电泳差异片段,反向Northern点杂交鉴定4个片段为真正差异片段,并对4个片段进行测序、B1ast同源性比较.来自于马杜霉素抗药虫株裂殖子的ACD3-2序列与柔嫩艾美耳球虫微线-5同源性99%,说明AcD3-2序列是该基因的部分序列,微线-5蛋白与虫体融解宿主细胞膜、入侵、运动和溢出有关,在第二代裂殖子时期,抗药性虫株该序列发生转录,而在敏感虫株中沉默;HCD1序列来自马杜霉素敏感虫株,与柔嫩艾美耳球虫表面抗原16和17序列同源性分别为83%和86%,说明与这2个基因同源.AGD5片段来自抗药虫株,HAD8-2序列来自敏感虫株,通过比较这2条序列可能为新序列.     

Genetic control of immunity to Eimeria tenella. Interaction of MHC genes and non-MHC linked genes influences levels of disease susceptibility in chickens

The relative importance of MHC genes and background genes in the genetic control of disease susceptibility and the development of protective immunity to E. tenella infection was investigated in eight different strains of 15I5-B congenic and four inbred chicken strains. RPRL 15I5-B congenic chickens that share a common genetic background but express different B haplotypes demonstrated wide variations in disease susceptibility and the development of acquired resistance to E. tenella infection. Infection of chickens sharing a common B haplotype but expressing different genetic backgrounds showed quite contrasting levels of susceptibility to secondary E. tenella infection. In all chicken strains examined, infected chickens developed high levels of serum and biliary anti-coccidial antibodies regardless of their B haplotypes. Furthermore, no correlation between antibody levels and the phenotypically expressed levels of disease resistance was demonstrated. These findings lend support to the view that interaction of MHC genes and non-MHC genes influences the outcome of host response to E. tenella infection.     

两株传染性造血器官坏死病病毒的分离及其糖蛋白基因序列分析

对所分离编号为20101008和20101032的两株传染性造血器官坏死病病毒（IHNV）的糖蛋白编码基因进行遗传进化分析,以揭示我国毒株与其他不同国家和地区毒株间的遗传进化关系。以反转录RCR（RT-PCR）法扩增其糖蛋白（G）编码基因,然后克隆入PMD-18T载体并测序。应用DNAStar和MEGA4.0软件,将20101008和20101032的G基因与多株GenBank中已发表的IHNV毒株相应基因进行比较。结果表明两株病毒间G编码基因的核苷酸和推导出来的氨基酸同源性分别为98%和81.9%,其氨基酸序列分别发生了35和20处氨基酸的替换。20101008和20101032与日本、韩国分离株同源性较高,核苷酸及推导出来的氨基酸同源性分别为93.3%～96.4%和75.9%～84.6%;两株病毒在进化关系上亲缘关系最近,属于同一分支,均为基因U型传染性造血器官坏死病病毒,但其G基因的核苷酸序列以及推导出来的氨基酸序列与已知的基因U型IHNV都有一定的差异。     

柔嫩艾美耳球虫裂殖子全长cDNA文库的构建及应用

为克隆柔嫩艾美耳球虫裂殖子阶段的功能基因的全长序列,利用SMART技术,采用Clontech公司的Creator TMSMARTTMcDNA Library Construction Kit构建了鸡球虫裂殖子的全长cDNA文库。用试剂盒提取mRNA后,以cDNA合成试剂盒合成cDNA。连接至pDNR-LIB载体,用电转化法将重组质粒转化到E.coli DH10B内得到原始文库,扩增后保存于-80℃冰箱内;最后以文库为模板,分别以研究室已成功克隆序列(EtSAG2、EtMIC-2、EtMCAT)及Sanger的部分EST序列(Contig1218)设计引物,进行PCR扩增并测序检验文库的实用性。经测定,构建的初级cDNA文库约含有8.72×107个重组子,插入的片段多在1kb～3kb之间,平均插入片段长度约1.8kb,扩增后文库保存的滴度为2.4×104 cfu/mL;通过文库的PCR扩增,不仅可以成功扩增出研究室已成功克隆的序列(EtSAG2、EtMIC-2),并成功获得EtMCAT和EST序列(Contig1218)的全长cDNA序列,经比对分析Contig1218所编码的蛋白为组织蛋白酶B样半胱氨酸蛋白酶(Cathepsin B)。结果表明,已成功构建了柔嫩艾美耳球虫裂殖子高质量的全长cDNA文库,从而为筛选鸡球虫的功能基因全长序列奠定了基础。     

北京部分地区猪瘟病毒流行株E2基因序列分析

为了解北京地区猪瘟病毒(CSFV)流行毒株的遗传变异情况,采用套式RT-PCR方法,对从北京部分地区近期分离的7株CSFV流行毒株的E2基因主要抗原编码区进行了扩增、克隆与序列测定,并应用DNA Star分析软件对所测定的7株毒株与国内外参考毒株的相应序列进行了同源性分析及氨基酸序列比对。结果表明,7株CSFV流行毒株之间核苷酸与氨基酸的同源性分别为96.3%～99.3%和95.6%～100%,与CSFV石门毒株(Shimen株)的核苷酸与氨基酸的同源性分别为81.7%～83.5%和82.4%～84.6%,与CSFV兔化弱毒株(HCLV株)的核苷酸与氨基酸的同源性分别为80.6%～81.7%和78.0%～80.2%,7株CSFV流行毒株均属于基因2群,且705、713、729和734位氨基酸发生置换。本研究初步揭示了北京部分地区目前流行的CSFV毒株与Shimen株和HCLV株在E2基因主要抗原区上存在较大差异。     

猪瘟病毒的分离鉴定及其E2基因序列分析

2004~2005年上海和江苏3家猪场发生仔猪急性死亡,用ELISA鉴别试剂盒证明为猪瘟感染。用PK15细胞分离病毒,传代至第3代无细胞病变,RT-PCR扩增E2基因为阳性,扩增片段经纯化后克隆入T载体并进行序列测定。通过DNAStar软件对3株病毒的基因序列进行了比较,同时构建了系统进化树,结果表明,三株病毒分离株均扩增出269bp片段并且核苷酸序列100%同源,这3株与Alfort、Shimen株、兔化弱毒株(HCLV)和Brescia4个标准毒株核苷酸序列同源性均在90%以上,说明在江苏、上海地区分离得到的3株猪瘟病毒与流行毒株在基因序列上没有发生大的变异。