柔嫩艾美耳球虫河北株致病性检测及ITS-1基因序列分析

为分析鸡柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)河北株的致病性及其ITS-1基因序列遗传变异特点,对临床分离的柔嫩艾美耳球虫河北株通过人工感染雏鸡试验验证其致病性,并计算其半数致死量(LD_(50)),采用RT-PCR对柔嫩艾美耳球虫河北株的ITS-1基因进行扩增、克隆,测序后进行生物信息学分析其基因序列变异情况。结果显示:柔嫩艾美耳球虫河北株对雏鸡有较强的致病性,其LD_(50)为3.16×10~4个/只;柔嫩艾美耳球虫河北株的ITS-1基因与GenBank登录的柔嫩艾美耳球虫ETSH4PF3-17株和柔嫩艾美耳球虫上海株的相似性在97.7%～99.0%之间,系统发育进化树分析显示柔嫩艾美耳球虫河北株与GenBank发表的柔嫩艾美耳球虫ETSH4PF3-17株和柔嫩艾美耳球虫上海株聚为一支,亲缘性最近,与其它虫株亲缘性较远;与GenBank发表的柔嫩艾美耳球虫ETSH4PF3-17株序列相比,柔嫩艾美耳球虫河北株的ITS-1基因序列中在第4、13、16、425位4个碱基发生缺失;第258、348位2个碱基发生变异,由C变为T,由G变为T。研究结果为进一步研究柔嫩艾美耳球虫河北株遗传变异情况提供参考依据。     

斯氏艾美耳球虫ADF基因部分序列的克隆与分析

为了获得我国斯氏艾美耳球虫长春株ADF基因并分析其与柔嫩艾美耳球虫长春株相应序列的同源性,试验根据GenBank中公布的柔嫩艾美耳球虫ADF基因序列设计引物,采用RT-PCR方法获得我国斯氏艾美耳球虫长春株ADF基因部分序列,然后将其克隆到pMD18-T载体中,应用DNAStar软件对测得序列进行序列分析。结果表明:斯氏艾美耳球虫长春株ADF基因大小为357 bp;经DNAStar分析,我国斯氏艾美耳球虫长春株与柔嫩艾美耳球虫长春株ADF核苷酸序列和氨基酸序列同源性均为99.2%。说明ADF基因在进化过程中高度保守。     

不同地理株柔嫩艾美耳球虫(E.tenela)杂交虫株(F2)的培育

将山东株(S)与吉林株(J)柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊通过单卵囊技术接种雏鸡,收获卵囊后提取基因组DNA,利用RAPD技术分析DNA,筛选出杂交株(F1),再用该F1代与黑龙江株(H)柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊单卵囊接种雏鸡,相同方法鉴别筛选,确定了1株为山东株、吉林株和黑龙江株三个地理株的杂交(F2)卵囊。该结果为深入研究球虫的免疫机制奠定了基拙。     

不同地理株柔嫩艾美耳球虫对地克珠利敏感性试验

进行了3个不同地理株的柔嫩艾美耳球虫(吉林株、山东株、黑龙江株)对地克珠利饮水剂的敏感性试验.分别给予试验组鸡1×105个孢子化柔嫩艾美耳球虫卵囊,感染后饮水给予地克珠利药物治疗.结果表明,3株球虫的敏感性不同,其敏感顺序为:山东株＞黑龙江株＞吉林株.由此可见,柔嫩艾美耳球虫不同地理株间存在对地克珠利的敏感性差异.     

鸡艾美耳球虫18SrDNA序列与系统进化分析

为了确定鸡艾美耳球虫（Eimeria）不同种以及来自不同地区同种不同株之间的亲缘关系,研究其分类地位,对实验室保藏的柔嫩艾美耳球虫（Etenella）、毒害艾美耳球虫（Eneeatrix）、巨型艾美耳球虫（Emaxima）、堆形艾美耳球虫（Eaaervulina）等4种15株鸡球虫孢子化卵囊的18SrDNA基因进行克隆、测序,并与从GenBank下载的鸡球虫18SrDNA序列一起,使用软件DNAstar 5．0 MegAlign进行系统发育分析。结果显示,4种艾美耳球虫种间同源性在94．6％～99．4％之间,7株柔嫩艾美耳球虫的株间同源性在99．0％-99．9％之间,5株巨型艾美耳球虫的株间同源性在96．9％～99．8％之间。用该4种鸡球虫的18SrDNA序列与GenBank下载的另外4种鸡球虫18SrDNA序列构建系统发育树,显示这8种鸡艾美耳球虫形成2个分支,即堆形艾美耳球虫（EASH）、巨型艾美耳球虫（EMSH）、变位艾美耳球虫（Emivati）、和缓艾美耳球虫（Emitis）、布氏艾美耳球虫（Ebrunetti）、早熟艾美耳球虫（Epraecox）构成1个分支,柔嫩艾美耳球虫（ENSH）、毒害艾美耳球虫（ETAS）构成另1分支。巨型艾美耳球虫、柔嫩艾美耳球虫各株的系统发育树均根据地域关系产生2个分支。柔嫩艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫的亲缘关系较近,不同地理区域的同种不同株的亲缘关系相对较远,种间和种内的鉴定结果与普通生物学结果一致。本研究提示18SrDNA基因可用于鸡球虫不同种／株的分类鉴定,为艾美耳球虫分子遗传学鉴定提供了理论基础。     

鸡艾美耳球虫哈尔滨株的分离与鉴定

为研究鸡艾美耳球虫哈尔滨株单一虫种的生物学特性,本研究利用单卵囊分离技术分离了6种鸡艾美耳球虫哈尔滨株,用分离的单卵囊接种雏鸡,同时应用PCR方法对收集的单卵囊分离株进行球虫种类鉴定并进行同源性和系统进化分析.结果显示,分离得到的6株鸡艾美耳球虫分别为柔嫩艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫、早熟艾美耳球虫、和缓艾美耳球虫和布氏艾美耳球虫,PCR结果表明单卵囊分离株确为该6种纯株.本研究表明毛细吸管单卵囊分离法简便易行,使接种难度降低,提高了接种成功率,为球虫的分子生物学研究奠定了基础.     

柔嫩艾美耳球虫河北株SOSO7基因克隆与序列分析

为分析柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)河北株SO7基因序列遗传变异性,试验根据GenBank发表的SO7序列设计引物,利用RT-PCR技术克隆出柔嫩艾美耳球虫河北株SO7基因,将SO7基因克隆入pMD18-T载体中,进行测序、序列分析及表达蛋白结构的预测。结果显示:柔嫩艾美耳球虫河北株SO7基因编码215个氨基酸,具有一个开放阅读框,大小为645 bp;与GenBank中发表的美国分离株(LS18)、扬州分离株(YZ)、海南分离株(HN)、广东分离株(GD)、北京分离株(BJ)SO7核苷酸序列的同源性分别为99.4%、99.5%、99.7%、99.5%、99.4%,所推导的氨基酸序列的同源性分别为98.6%、99.1%、99.1%、98.6%、98.1%。从进化关系来看,同种间SO7基因相比,柔嫩艾美耳球虫河北株与HN株同属一个分支,遗传关系较近;与GD株、BJ株的遗传关系相对较远。蛋白结构预测显示蛋白的相对分子质量为52.20 ku,理论等电点(PI)为5.08,不稳定系数为52.73,为不稳定蛋白;在1~20个氨基酸具有信号肽;有5个疏水位点;没有跨膜结构。综上所述,柔嫩艾美耳球虫河北株SO7基因序列遗传变异性不明显,可以作为构建核酸疫苗候选基因。     

柔嫩艾美耳球虫沈阳分离株Mic2基因的克隆及序列分析

<正>随着分子生物学技术的快速发展,国内外均已经克隆出了柔嫩艾美耳球虫微线蛋白2(Mic2)基因[1-2]。为了进一步明确沈阳地区分离株柔嫩艾美耳球虫Mic2基因与其他地区分离株Et Mic2基因之间的序列相似性,本试验从沈阳地区分离到的柔嫩艾美耳球虫中提取总RNA,通过RT-PCR技术扩增出Et Mic2基因,将其插入克隆载体p EASY-T1,对Mic2     

不同地理株柔嫩艾美耳球虫(E.tenela) 杂交虫株(F1)的培育

通过用单卵囊接种技术培育了山东株(S)和黑龙江株(H),然后将山东株(S)和黑龙江株(H)的柔嫩艾美耳球虫的孢子化卵囊同时喂给雏鸡,收获卵囊,提取基因组DNA,再利用RAPD技术对它们基因组DNA进行分析,分析了19株柔嫩艾美耳球虫卵囊的DNA分子,确定了1株为山东株和黑龙江株的杂交株(F1)。这一研究结果为深入研究球虫的免疫机制奠定了基础。     

用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行球虫同工酶的研究

用聚丙烯酰胺凝胶电泳,对柔嫩艾美耳球虫和斯氏艾美耳球虫孢子化卵囊,进行了乳酸脱氢酶(LDH)、葡萄糖磷酸同分异构酶(GPI)和6—磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6PGD)同工酶的初步研究。结果表明柔嫩艾美耳球虫和斯氏艾美耳球虫的LDH和GPI同工酶酶谱存在明显差异,6PGD同工酶酶谱则一致。柔嫩艾美耳球虫的LDH、GPI和6PGD均为1条带,而斯氏艾美耳球虫的LDH为2条带,其位置与柔嫩艾美耳球虫明显不同,斯氏艾美耳球虫的GPI呈现2条带,其中1条的位置同柔嫩艾美耳球虫基本一致。作者认为,聚丙烯酰胺凝胶电泳可作为球虫同工酶研究的一种方法。讨论了同工酶技术在球虫虫种、虫株的鉴定,在致弱株、耐药株的确定,以及在遗传学、免疫学等方面的应用前景     

DNA polymorphism of srRNA gene among Eimeria tenella strains isolated in Japan

DNA polymorphism in twelve starains of Eimeria tenella isolated from various places in Japan was examined using 1.l kb small subunits ribosomal RNA amplified by PCR. Genetic variation was evaluated by random amplification of polymorphic DNA (RAPD) analysis. DNA fingerprint patterns were grouped into two, indicating that at least two DNA polymorphisms exist in Japanese E. tenella strains.     

Differentiation of Pasteurella multocida isolates from cases of atrophic rhinitis in pigs from Zimbabwe by RAPD and ribotyping

Atrophic rhinitis in pigs is rarely reported in Southern Africa. To determine the relationship between Pasteurella multocida clones from clinical cases of atrophic rhinitis, twenty-one strains were characterised by selected phenotypic and genotypic methods. Biochemical analysis classified 18 strains as P. multocida subspecies multocida, whilst the remainder were grouped into separate unassigned biotypes. Capsular groups A (16/21) and D (l/21) were found among the isolates by PCR. Four ribotype patterns were obtained following HpaII ribotyping, whilst random amplification of polymorphic DNA (RAPD) revealed three main clusters. However, subclusters were also noted for each RAPD cluster. Our results indicate that RAPD offers a better discrimination of strains than ribotyping and that none of the phenotypic characters were directly related to the genotypic clusters.     

柔嫩艾美耳球虫野外抗药性虫株的RAPD分析

用RAPD方法对柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）的8个分别来源于黑龙江、北京、四川、甘肃和广东的中山、新会、东莞以及广州近郊的江村镇的野外分离虫株和2个药物敏感性虫株进行了遗传多态性分析。同时用9种抗球虫药物即马杜霉素（5mg/kg）、盐霉素（60mg/kg）、莫能霉素（120mg/kg）、拉沙菌素（90mg/kg）、克球多（150mg/kg）、常山酮（3mg/kg）、氯氢苯乙氰（1mg/kg）、尼卡巴嗪（125mg/kg）和球痢灵（125mg/kg）分别对8个野不进行抗药性试验，8个虫株对上述药物均有不同程度的抗药性。RAPD分析表明：10个样品都有相似而清晰的主带，每个泳道有5－13条带不等，大小为0.18-2.10kb。它们之间的相似率（SI）大于40.58%，最大的为90.72%，这种相似率属种内变异水平。根据SI值可把10个样品划分为3个类群：广东虫株类群，群内比较，平均SI值为76.60%；广东省外虫株类群，群内比较的平均SI值72.14%；敏感株类群，其间的SI值为89.27%。在另一方面，广东株与广东省外株、敏感株之间比较，其SI的平均值分别仅为63.03%和47.25%，说明柔嫩艾美耳球虫抗药性虫株之间有遗传差异法。     

鸡柔嫩艾美耳球虫不同抗药性虫株的种内多态性研究

应用RAPD技术进行柔嫩艾美耳球虫4个单一抗药性虫株与1个敏感株的基因组DNA多态性分析，发现4个抗药性虫株及敏感株之间的相似值均大于99%；OPAO3引物对抗盐霉素株扩增出一条约500bp的特异条带，OPH02引物对抗克球粉株和抗盐霉素株均扩增出了约1kb的第三条主带，这些特异条带的出现很可能与球虫抗药性基因有关，有可能用于抗药性虫株的诊断与鉴定。     

淮南猪遗传特异性的RAPD分析

试验用150个10碱基随机引物对引入品种杜洛克猪、长白猪、大约克猪及河南地方品种淮南猪4个猪种基因组池DNA进行了RAPD分析。电泳检测结果发现,其中72个引物扩增出明显的多态性条带,共检测到911条扩增片段,其中多态性片段462条,占50.71%。统计分析结果表明,大约克猪与长白猪之间的遗传距离指数为0.0064,遗传关系最近;淮南猪与杜洛克猪、大约克猪遗传距离指数相近,分别为0.0068、0.0069,遗传关系较近;淮南猪与长白猪遗传距离指数为0.0072,遗传关系最远。结果显示,河南省地方品种淮南猪与其他引入品种之间有遗传的相似性,也存在差异,同时也证明了RAPD技术可以作为分子标记,很好地检测猪种群内的遗传变异及区分不同猪种的遗传检测方法。     

桑天牛卵啮小蜂不同地理种群间遗传关系的RAPD及酯酶分析

利用随机扩增多态性DNA标记和酯酶同工酶电泳技术,对分别属于河北、山东、湖北3个省区的6个桑天牛卵啮小蜂种群进行了遗传关系的分析。根据扩增结果构建了种群间的聚类树状图,山东泰安种群与河北各种群聚为一类,并与河北易县种群为同一亚类,其结果与形态学上的分类有些不同。而酯酶同工酶电泳图谱的结果显示,泰安种群与河北和湖北种群都有差别,与形态学分类的结果较一致。     

Diversity of swine Bordetella bronchiseptica isolates evaluated by RAPD analysis and PFGE

The degree of genetic diversity in 45 Bordetella (B.) bronchiseptica strains comprised of a vaccine strain (N = 1), reference strains (N = 3) and field isolates (N = 41) was evaluated using random amplified polymorphic DNA (RAPD) fingerprinting and pulsed-field gel electrophoresis (PFGE). Three candidate primers were selected for RAPD analysis after screening 20 random decamer oligonucleotides for their discriminatory abilities. The OPA-07, OPA-08 and OPA-18 primers yielded 10, 10, and 6 distinct fingerprint patterns, respectively. The most common identical RAPD pattern was produced by OPA-07 which was shared by 32 isolates (71.1%), the pattern produced by OPA-08 was shared by 26 isolates (57.8%), and the pattern produced by OPA-18 was shared by 40 isolates (88.9%). The RAPD patterns of the vaccine strain and the 3 reference strains did not match any of the patterns produced by the field isolates when primers OPA-07 and OPA-08 were used. PFGE using the restriction endonuclease XbaI produced a total of 15 patterns consisting of 4 PFGE types (A, B, B1 and C, differing by ≥ 4 bands) and 11 A subtypes (differing by ≤ 3 bands). Most of the field isolates exhibited identical type A and B patterns, suggesting that they were related. The vaccine strain and the three reference strains showed different PFGE patterns as compared to the identical type A strains.     

应用随机扩增多态性进行山羊致病性大肠杆菌的分子多态性分析

为了解山羊致病性大肠杆菌广西分离株的分子多态性,应用随机扩增多态性方法(RAPD)对山羊致病性大肠杆菌进行分型研究.从8条随机引物中筛选出4条能在10株大肠杆菌中具有较好多态性扩增的随机引物,4条随机引物共扩增出18条DNA片段,10个菌株无共有带谱,显示出良好的扩增多态性.菌株Nx31与Nx32曾被认为是同一菌株的两次分离,但是在RAPD分析中,两株细菌的带谱存在明显的差别,表明RAPD比传统的血清学分型具有更高的分辨性.