鲤春病毒血症病毒单克隆抗体的制备及其特性鉴定

为获得针对鲤春病毒血症病毒(SVCV)特异性的单克隆抗体(MAb),以纯化的SVCV为抗原,免疫BALB/c小鼠.将免疫鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,采用间接ELISA法筛选获得4个能稳定分泌抗SVCV MAb的杂交瘤细胞株;4个杂交瘤细胞制备腹水的MAb效价为1:160 000～1:640 000.亚型鉴定结果表明,这些MAb分属2个亚型(1F1、3E1,IgG2a;3F5、4F9,IgGl),轻链均为K链.Western blot分析显示,MAb1F1、3F5、4F9能特异性地识别SVCV的N蛋白(47 ku),3E1能特异性地识别SVCV的G蛋白(69 ku).采用相加ELISA法对抗原表位分析结果显示,1F1、3F5、4F9可能识别相同的表位,3E1则识别不同的表位.间接免疫荧光试验结果显示4株MAb均能对染毒病灶产生特异性的荧光染色.这些MAb的制备为SVCV免疫学检测方法的建立奠定了基础.     

鲑鱼甲病毒病研究进展

1疾病概述
　　冷水鲑科鱼类价格昂贵,是世界三大养殖鱼类之一,主要分布于欧洲和北美。目前我国的鲑科鱼养殖以虹鳟（Oncorhynchus mykiss）为主,年产量占世界总产量的1％以下,每年需要进口大量的鲑鱼,尤其是大西洋鲑鱼（Salmo salar ）［1-2］,鲑鱼甲病毒病对于我国的鲑科鱼养殖具有潜在的威胁。     

水生动物中分离的副溶血性弧菌菌株分子分型研究

本研究通过采用核糖体分型RT、脉冲场凝胶电泳PFGE、多位点序列分型MLST三种方法,对从水生动物中分离到的59株副溶血性弧菌进行分子分型研究。结果将59株副溶血性弧菌分为43个RT型,9个大的聚类群,DI为0.9754;51个PFGE型,13个大的聚类群,DI为0.9988;53个ST型,包括107个新的等位基因、46个新的ST型,DI为0.9982。结果显示PFGE的分辨力最高,MLST较PFGE稍低,RT的分辨力最低。总体来看59株副溶血性弧菌菌株间亲缘关系较远,从同一年份、同一地区、同类样品中分离到的菌株被分为不同的型,表现出较大的遗传多样性。     

蚊虫乙酰胆碱酯酶的真核表达、纯化及活性测定

利用Trizol法从尖音库蚊中提取总RNA,构建cDNA文库,并克隆出乙酰胆碱酯酶外显子序列;利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统对蚊虫乙酰胆碱酯酶进行真核表达,并利用Ni-琼脂糖对酶进行纯化。采用SDS-PAGE对纯化产物进行检测,结果表明得到了纯度较高的乙酰胆碱酯酶。参照Ellman法对酶的活性进行测定,结果显示纯酶的活力为2.219×10-4 mol/(min.g)。     

鱼类病毒性出血性败血症病毒核蛋白基因的原核表达

通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)获得编码病毒性出血性败血症病毒(Viral hemorrhagic septicemia virus,VHSV)核蛋白基因,将其克隆至原核表达载体pET28a,并在E.coli BL21(DE3)中得到表达,用SDS-PAGE与Western-blot对表达产物进行鉴定。结果表明,通过RT-PCR扩增获得长度为1 221bp核蛋白基因片段,诱导表达重组质粒pET28a-N,经SDS-PAGE检测,IPTG终浓度为1mmol/L时,诱导5h蛋白表达量最高,获得的目的蛋白大小与N蛋白的预测分子质量一致,约为48ku。诱导后的菌液进行超声波破碎后,将沉淀和上清分别用于SDS-PAGE电泳,结果表明目的蛋白主要以包涵体的形式存在。表达蛋白经过复性、纯化,得到了较高纯度的可溶性蛋白。经Western-blot检测表明,该表达产物能被羊抗VHSV阳性血清特异性识别。     

流式细胞仪在快速测定鲤春病毒血症病毒滴度中的应用

本研究建立了流式细胞仪快速检测鲤春病毒血症病毒（spring viraemia of carp virus,SVCV）滴度的方法。运用荧光激活细胞分选（fluorescence-activated cell sorting, FACS）技术检测SVCV A1株对草鱼性腺细胞系（GCO）的感染情况。用SVCV病毒单克隆抗体为一抗,FITC标记的羊抗鼠抗体为二抗,运用FACS来检测感染后不同时间点,以及不同病毒接种量的阳性细胞率。感染第3天时为最佳的病毒滴度测定时间点,测得SVCV的病毒滴度为8.31×105 FIU/mL,最低检测病毒滴度为（1000 FIU/mL）,与传统空斑试验（plaque assay,PA）相比,两种方法测得的结果基本一致。实验结果表明,FACS是一种简捷、高效、直接的检测SVCV滴度的方法,是一种新型的病毒滴度测定方法。     

高效表达重组猪IL-10的基因工程菌株的构建

白细胞介素—10(IL-10)是一种Th2细胞等产生的能抑制Th1细胞释放细胞因子的免疫调节因子。从经脂多糖(LPS)活化的猪外周血单核细胞(PBMC)中提取总RNA，用RT—PCR扩增了猪IL-10(poIL—10)编码基因，克隆并测序验证后，将其亚克隆到表达载体pPROEX^TM HTb中，转化DH5α后，用IPTG诱导培养，经免疫印迹和生物活性检测显示，重组菌株表达了具有活性的重组poIL—10，重组poIL-10表达水平达3mg／ml培养液，占菌体细胞总蛋白的30．2％，本研究为poIL-10的功能研究和临床应用奠定了基础。     

传染性鲑鱼贫血症病毒实时荧光环介导等温扩增检测方法的建立

根据ISAV的基因保守序列,利用LAMP Designer软件设计了6条引物,采用新型的环介导等温扩增设备进行扩增和检测,优化了反应条件,分析了所建立方法的特异性和灵敏度,并与RT-PCR和实时荧光RT-PCR进行比较。研究表明,该方法最适反应温度为64℃,反应10 min就可以观察到明显的扩增。该方法灵敏度高,检测限为78.4 fg RNA,比常规RT-PCR灵敏度高100倍,与实时荧光定量RT-PCR灵敏度相当;特异性好,与传染性胰腺坏死病毒(IPNV)、鲤春病毒血症病毒(SVCV)、出血性败血症病毒(VHSV)、鱼类病毒性神经坏死病病毒(VNNV)、鱼腹水病毒(YAV)等14种主要鱼类病毒没有交叉反应。结果表明,本研究建立了ISAV的实时荧光环介导等温扩增检测方法,实验能对整个扩增过程进行实时监测,提高检测灵敏度的同时,防止由于开盖跑电泳或加染料而导致的污染。     

基于RPA的鲤春病毒血症病毒核酸检测技术的建立与评价

重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA)是近几年新发展并普及应用的一种核酸扩增技术,能够实现检测设备小型化,从而满足现场诊断(point-of-care testing,POCT)的需求。本研究以鲤春病毒血症病毒(springviraemiaofcarp virus,SVCV)为检测靶标,建立了SVCV的RPA检测技术,并分析了该方法的灵敏性、特异性和稳定性,评判了该技术应用于POCT的可能性。结果表明:基于RPA的检测方法灵敏度较高,检测下限可达4×10~3 PFU/mL,但比以Taq酶为基础的RT-PCR技术略低;特异性好,未发现对其他水生动物疫病病原,如传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)、病毒性出血性败血症病毒(VHSV)、传染性胰腺坏死病病毒(IPNV)、传染性鲑鱼贫血病病毒(ISAV)等发生非特异性反应;稳定性良好,3次重复性试验的结果近乎一致。试验证明,该方法能够替代RT-PCR技术,应用于POCT的试剂和仪器设备研发。     

草鱼(Ctenopharyngodon idellus)性腺细胞系(GCO)特性和对鲤春病毒的敏感性

草鱼(Ctenopharyngodon idellus)性腺细胞系(GCO)是中国科学院水生生物研究所在20世纪70年代开展草鱼出血病研究时建立的一株细胞系,迄今已传至300多代,在中国鱼类病毒学研究领域发挥了重要作用.本研究采用形态学观察、细胞生长曲线测定、细胞周期测定、细胞核型分析、细胞凋亡检测、电镜观察等方法,对GCO的生长特性及鲤春病毒血症病毒(SvCv)在该细胞中的增殖特性等进行了研究.结果显示,GCO细胞的最适生长温度为25℃,在M199和MEM等细胞培养液中均能较好地生长,培养液中最适的胎牛血清浓度为10％.测定了GCO细胞系对SVCV病毒的敏感性,发现与鲤(Cyprinus carpio)上皮瘤细胞系(EPC)、肥头鲤(Pimephales promelas)细胞系(FHM)、大鳞大麻哈鱼(Oncorhynchus tshawytscha)胚胎细胞系(CHSE-214)等世界动物卫生组织(OIE)推荐和各检测实验室常用的鱼类细胞系相比,GCO细胞系对SVCV表现出非常高的敏感性.生长盐线、电镜观察和凋亡实验显示,SVCV能引起GCO细胞系出现明显而稳定的细胞病变,引起GCO细胞系出现凋亡,并在细胞质中大量增殖.结果表明,GCO细胞系适用于SVCV病毒的分离、检测以及病毒致病性的有关研究.GCO细胞的适宜生长温度为15-28℃,这一特点将使它可以广泛地用于多种水生动物病毒的分离.