梨幼果FWL1膜系统酵母双杂交三框cDNA文库构建及互作蛋白的筛选

【目的】筛选与FWL1互作的蛋白,为研究FWL1基因调节果实大小机理提供依据。【方法】以杜梨、库尔勒香梨、鸭梨、早美香为材料,提取4个梨品种果实细胞分裂关键时期的果肉组织混样RNA。构建梨幼果FWL1膜系统酵母双杂交三框cDNA文库,并鉴定文库质量。构建诱饵载体并转化酵母菌,筛选与FWL1互作的蛋白,对初步筛选出的阳性酵母克隆进行测序并在NCBI中进行Blast比对,确定候选互作蛋白。【结果】文库库容约为3×10⁷ CFU,大于1×10⁷ CFU,平均插入片段大于1 000 bp,阳性率为≥98%。诱饵载体无自激活功能,利用共转化方法,筛选出272个与FWL1互作的蛋白质。【结论】梨幼果膜系统酵母双杂交三框cDNA文库符合酵母双杂文库的基本条件,适用于后期筛选相互作用的蛋白。筛选出的272个互作蛋白在果实发育过程中表达不同,其中collagen and calcium-binding EGF domain-containing protein 1和metallothionein-like protein可能与梨果实大小发育有关。     

“Bolgogragsky”番茄cDNA文库的构建及质量评价

MYB102转录因子在番茄响应低温胁迫中起着重要作用,为了进一步探究番茄转录因子MYB102的分子作用机理,筛选其蛋白,以“Bolgogragsky”为材料,从番茄的根、茎、叶、花、果以及萼片组织中提取总RNA,以其为模板合成双链cDNA,纯化后与载体pGADT7-Rec共转化入酵母Y187感受态细胞中构建酵母双杂交cDNA文库。经测定,文库容量为2.31×10⁷ CFU,cDNA文库的转化效率为7.02×10⁶ CFU/μg,文库滴度为2.5×10⁸ CFU/mL,重组率为97%,插入的cDNA片段长度主要分布在250～2 000 bp。结果表明,构建的番茄cDNA文库符合酵母双杂交文库要求,可用于筛选MYB102的互作蛋白。     

利用酵母双杂交系统筛选玉米ZmPRR73的互作蛋白

为了阐明ZmPRR73基因的生物学功能,构建诱饵表达载体pGBKT7-ZmPRR73，利用酵母双杂交技术，从长日照光照环境诱导的热带玉米自交系的cDNA文库中筛选与ZmPRR73互作的蛋白。结果显示：构建的诱饵载体pGBKT7-ZmPRR73对酵母菌株无毒性，且对报告基因无自激活活性，共鉴定出12个与ZmPRR73互作的候选蛋白。生物信息学分析表明，这些候选互作蛋白的功能涉及植物的转录调控、离子跨膜转运的调节、信号转导、电子传递链等多个方面，推测ZmPRR73蛋白与以上蛋白互作参与多个信号转导和代谢途径，研究结果补充和完善了ZmPRR73蛋白参与的调控途径，为进一步研究生物钟核心元件ZmPRR73的分子功能提供了新的分子证据。     

桃酵母双杂交cDNA文库的构建及生长素响应因子4互作蛋白的筛选

[目的]为解析桃果实发育成熟的机制,通过构建成熟期前后桃果实的酵母双杂交cDNA文库,筛选生长素响应因子4的互作蛋白,探究生长素响应因子4对桃果实成熟过程的调控作用.[方法]以硬溶质桃(Prunus persica L.)'突围'为材料,提取果皮的总RNA,建立酵母双杂交cDNA文库,采用Mating法筛选生长素响应因子4的互作蛋白.[结果]构建的酵母双杂交cDNA文库的总库容量1.6×107CFU,重组率100％,插入片段平均长度大于1 000 bp.构建诱饵载体pGADT7-PpARF4重组质粒,在桃果实酵母双杂交cDNA文库中筛选互作的靶蛋白,共获得有潜在互作的蛋白26个,主要功能涉及信号转导与胁迫响应、器官的形成、大分子代谢及蛋白合成与修饰因子.[结论]试验建立的酵母双杂交cDNA文库质量较高,完整性较好,为后续筛选果实成熟相关蛋白奠定基础.     

红肉苹果MdMKK9互作蛋白的筛选与鉴定

MKK9是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族重要成员之一，是在植物细胞响应外界胁迫信号转导中发挥重要作用的酶。为深入研究苹果MKK9的相关功能，以红肉苹果‘黛红’为材料，克隆到MdMKK9基因CDS序列，利用酵母双杂交试验筛选苹果cDNA文库，并通过酵母双杂交筛选、体内双分子荧光互补(BiFC)和体外Pull-down试验进行MdMKK9互作蛋白验证。结果表明，通过对苹果cDNA文库的筛选，共获得11个参与调控植物生长发育及应答逆境胁迫的候选互作蛋白；选取花青苷合成相关蛋白MdCHS及氮胁迫调控相关蛋白MdSPX3进行酵母双杂交、体内BiFC及体外Pull-down试验，结果证明MdMKK9可与MdSPX3互作。     

水稻高盐胁迫下的酵母双杂交文库构建及OsRPK1胞内互作蛋白质的筛选

为了挖掘水稻OsRPK1胞内互作蛋白质,阐明OsRPK1参与高盐胁迫的分子机制,本研究利用SMART技术,构建水稻高盐胁迫下根尖的酵母双杂交文库。PCR扩增获得OsRPK1基因编码胞内区域的碱基序列,构建诱饵表达载体(pGBKT7-OsRPK1-CD),检测诱饵表达载体在酵母中的毒性和自激活活性,筛选OsRPK1胞内互作蛋白,进一步分析高盐胁迫下候选基因的表达模式。结果表明,构建的cDNA文库库容量为1.11×10~7 CFU,文库重组率为96%,文库插入片段多态性较好。成功构建了诱饵表达载体(pGBKT7-OsRPK1-CD),经检测诱饵表达载体无毒性,无自激活活性。诱饵表达载体与cDNA文库进行双杂交筛选,经测序和比对分析获得了11个重要的候选基因,检测候选基因在高盐处理下的表达情况,其中8个候选基因受高盐诱导表达,2个候选基因受高盐胁迫抑制表达,1个候选基因受高盐胁迫瞬时诱导表达后表达量又受到显著抑制。     

拟南芥转录因子AtMYB73转录活性区域分析及互作蛋白的筛选

【目的】确定拟南芥抗逆转录因子AtMYB73的转录活性区域并筛选获得与其互作的蛋白,为进一步阐明AtMYB73调控拟南芥抗逆的分子机制奠定基础。【方法】构建转录因子AtMYB73的酵母诱饵表达载体pAS1-AtMYB73,检测pAS1-AtMYB73的自激活性及其对酵母Y190的细胞毒性。克隆AtMYB73的N端区域（含有R2R3结构域）和C端区域（不含R2R3结构域）,检测AtMYB73的N端和C端的转录激活活性,分析AtMYB73自激活结构域的位置。利用酵母双杂交技术,以AtMYB73为诱饵筛选拟南芥的cDNA文库,将阳性克隆进行鉴定、测序;利用TAIR数据库对筛选获得的AtMYB73的候选互作蛋白进行分析。构建AtMYB73和F12F1.4的酵母双杂交载体pGBDT7-AtMYB73和pGADT7-F12F1.4,通过酵母双杂交技术,对其互作关系进行分析。【结果】含pAS1-MYB73的酵母菌在不同浓度的3-AT的SD/-His/-Trp/、SD/-Ade/-Trp培养基上均能生长,表明AtMYB73具有较高的自激活活性。含pAS1-AtMYB73的酵母菌在SD/-Trp/Amp液体培养基中培养24 h的OD₆₀₀值大于0.8,表明诱饵载体对酵母Y190没有细胞毒性。成功构建了pAS1-AtMYB73-N和pAS1-AtMYB73-C载体,获得了含有pAS1-AtMYB73-N和pAS1-AtMYB73-C的酵母;含pAS1-AtMYB73-N的酵母在含X-a-gal的YPAD培养基上呈现无色,而含pAS1-AtMYB73-C的酵母则呈现蓝色,表明AtMYB73的C端有明显的自激活性,而N端没有自激活性。以AtMYB73为诱饵,筛选拟南芥的cDNA文库,获得了与光合作用、防御反应途径、抗逆等相关的8个蛋白。利用酵母双杂交技术,确定了MYB73与F12F1.4之间存在一定的互作。【结论】拟南芥抗逆转录因子AtMYB73具有较高的转录激活活性,其活性区域位于C端;以AtMYB73为诱饵,筛选获得了与光合作用、防御反应途径、抗逆等相关的8个AtMYB73的候选互作蛋白;利用酵母双杂交技术,确定了AtMYB73与F12F1.4之间的互作关系。     

茶树CsHIPP26.1互作蛋白的筛选与验证

【背景】‘黄金芽’属于光照敏感型黄化茶树（Camellia sinensis）品种,叶片色泽呈现强光黄化、弱光复绿的特点,但叶色响应光照的黄化机制并不明确。前期通过对黄化叶片、遮阴复绿叶片以及常绿品种叶片的蛋白组研究发现,重金属相关异戊二烯化植物蛋白CsHIPP26.1（TEA000549）的表达响应光照强度,表明CsHIPP26.1可能参与调控‘黄金芽’叶色黄化的光响应过程。【目的】通过筛选与CsHIPP26.1互作的光信号响应相关的蛋白,为叶片色泽响应光照信号变化提供科学依据。【方法】以‘黄金芽’茶树1芽2叶为材料进行CsHIPP26.1和互作基因的克隆,经酵母双杂交筛库,然后将筛选得到的目的蛋白进行酵母双杂交点对点验证、体内双分子荧光互补（BiFC）和体外pull-down等技术进行蛋白互作的进一步验证。【结果】通过酵母双杂交对茶树cDNA文库进行筛选,共筛选到26个候选互作蛋白,主要集中在细胞组分、结合以及催化活性方面发挥作用,其中生物素合成代谢过程富集程度较高,与光信号通路及叶绿素合成相关的蛋白只有编号为TEA026466.1的bHLH30转录因子。克隆bHLH30转录因子后发现,该转录因子与茶树光信号传导途径蛋白PIF4处于同一进化树分支,且含有与茶树PIF4蛋白相同的HLH和ACT结构域,将该bHLH30转录因子命名为CsPIF4.2,GenBank登记号为MW116834。进一步通过体外Pull-down蛋白互作和体内双分子荧光互补（BiFC）验证发现,CsHIPP26.1和CsPIF4.2蛋白能够发生互作,并且发生互作的部位在细胞核内。【结论】初步筛选出26个与CsHIPP26.1互作的蛋白,并验证发现CsHIPP26.1能够在细胞核内与其中一个光敏色素互作因子CsPIF4.2发生蛋白相互作用。     

大豆锌指转录因子GmDi19-5对高温的响应及互作蛋白的筛选

【目的】高温胁迫已经成为威胁作物生长发育的主要非生物胁迫因素之一,转录因子在植物非生物胁迫响应中起着重要作用。通过对大豆锌指转录因子基因Gm Di19-5在高温胁迫下的响应和功能鉴定,以及利用酵母双杂交技术从大豆c DNA文库筛选与其互作的候选蛋白,研究Gm Di19-5对高温胁迫的响应机制。【方法】以大豆c DNA为模板,利用实时荧光定量PCR检测Gm Di19-5在高温处理不同时间段的表达模式;通过Plant CARE和PLACE数据库预测Gm Di19-5启动子元件,并对Gm Di19-5启动子转基因拟南芥在高温处理下进行的组织化学染色,分析Gm Di19-5启动子在高温胁迫下的活性;构建p GBKT7-Gm Di19-5诱饵载体,验证自激活活性;利用酵母双杂交技术,以p GBKT7-Gm Di19-5为诱饵筛选大豆c DNA文库,筛选与其互作的候选蛋白;进一步用酵母双杂交系统验证Gm Di19-5与候选蛋白的互作;利用实时荧光定量PCR检测候选蛋白基因在对高温处理的响应情况;构建融合表达载体,用GFP-Gm Di19-5融合表达载体转化拟南芥原生质体,检测Gm Di19-5蛋白的亚细胞定位情况。【结果】实时荧光定量PCR结果显示,Gm Di19-5在高温胁迫下上调表达;启动子元件分析表明,Gm Di19-5包含多种与胁迫应答相关的顺式作用元件,包括热响应元件HSE;组织化学染色分析发现,经高温处理后,过表达拟南芥幼苗的地上部分和地下部分均有报告基因的表达;亚细胞定位结果表明,Gm Di19-5蛋白定位于拟南芥原生质体的细胞核中;通过酵母双杂交技术筛选到了与Gm Di19-5互作的候选蛋白,试验进一步验证了Gm Di19-5与Gm Dna J在酵母细胞中互作;另外,实时荧光定量PCR结果显示,互作蛋白基因Gm Dna J受高温胁迫诱导表达。【结论】Gm Di19-5受高温诱导表达,Gm Di19-5可能与Gm Dna J互作,表明Gm Di19-5功能的发挥可能需要Gm Dna J的参与。     

水稻种子酵母双杂交体系的构建及种子特异表达蛋白ONAC023互作蛋白的鉴定

酵母双杂交是常用的蛋白-蛋白检测技术。以水稻受精5 d的幼嫩种子为材料,构建了适用于水稻种子发育相关蛋白的互作蛋白酵母双杂交筛选平台,cDNA文库容量达到1.1×106,平均插入大小约为750 bp,开发了改良的酵母菌落PCR方法,用于文库插入片段的扩增,大大提高了筛选效率。NAC是植物特有的一类转录因子,在植物发育、抗逆等多个方面发挥着重要功能。RT-PCR结果显示,NAC家族成员ONAC023在种子中特异表达,可能调控种子早期发育。以ONAC023为诱饵,成功地筛选到21个互作蛋白候选基因,其中包含1个DNA linding protein,推测其可能是ONAC023蛋白复合物的成员。     

稻瘟病菌MoYpt7互作蛋白的初步筛选

利用酵母双杂交系统,以稻瘟病菌MoYpt7激活型为诱饵蛋白,从稻瘟病菌不同生长发育阶段的cDNA文库中筛选互作蛋白,经复筛得到10个候选互作蛋白基因,利用Bi FC或pull-down assay验证蛋白间的互作,为寻找MoYpt7下游调控侵染致病过程的效应因子提供依据.     

水稻NBS-LRR类抗稻瘟病蛋白Pik-h的互作蛋白筛选

【目的】利用酵母双杂交系统,以组成抗稻瘟病基因Pik-h介导的抗病反应途径。【方法】以含抗稻瘟病基因Pik-h的近等基因系IRBL8为材料,取稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)GD0193接种12和24 h后的水稻叶片,等量混合后提取总RNA,按照2个紧密连锁且功能独立的Pikh-1和Pikh-2蛋白为诱饵,在水稻叶片中筛选与之互作的蛋白,以便深入研究抗病基因Pik-h的酵母双杂交试剂盒（Make Your Own “Mate&Plate” Library System）的要求构建水稻叶片靶标cDNA文库。利用快速重组克隆的方法构建pGBKT7-Pikh1和pGBKT7-Pikh2诱饵载体,并分别将它们转化至酵母菌株Y2H Gold,提取细胞总蛋白后利用Western blot检测Pikh1和Pikh2的表达情况,并对这2个诱饵载体自激活和毒性分析后进行酵母双杂交筛选。提取SD/-Ade/-Leu/-Trp/ -His/X-α-Gal筛选平板培养基上呈蓝色的酵母单克隆的质粒,将其分别与对应的诱饵载体共转化酵母菌株Y2H Gold,涂布于筛选平板培养基上进行互作的重复验证,将通过重复验证的质粒测序分析所得的序列比对水稻基因组数据库以确定目的基因,并对这些基因进行gene ontology（GO）注释分析以确定其分子功能、生物过程及细胞组成。【结果】靶标cDNA文库的库容量约为2.2×10⁶,插入片段长度均大于400 bp,表明水稻cDNA文库质量高。诱饵载体pGBKT7-Pikh1和pGBKT7-Pikh2均能在酵母细胞中正确表达出对应的Pikh1及Pikh2蛋白,无自激活活性而且对酵母无毒性作用,符合文库筛选的要求。利用含有诱饵载体的酵母菌株Y2H Gold与靶标文库菌株Y187结合（Mating）的方式筛选,获得13个与Pikh-1相互作用的蛋白、5个与Pikh-2相互作用的蛋白,其中有2个与Pikh-1及Pikh-2同时存在相互作用。这些蛋白包括4个在逆境响应或激素信号转导过程中起到重要作用的（辅）转录因子、3个信号蛋白、4个参与光合作用的叶绿体蛋白、1个含有U-BOX结构域的蛋白及4个未知功能蛋白。【结论】成功构建了适宜于研究抗病基因（R基因）介导反应途径的酵母双杂交cDNA文库,筛选出Pik-h的互作蛋白,为进一步研究Pik-h或其他抗稻瘟病基因介导的抗病机制打下了基础。     

小麦蛋白激酶TaMAPK2互作蛋白的筛选与验证

【目的】利用构建的干旱胁迫处理的小麦cDNA文库,通过酵母双杂系统筛选与小麦TaMAPK2互作的蛋白,并对其进行验证分析。【方法】以小麦cDNA为模板克隆得到TaMAPK2,构建pGBKT7-TaMAPK2诱饵载体,将诱饵载体pGBKT7-TaMAPK2质粒以及pGADT7和小麦cDNA文库共转化酵母AH109菌株感受态细胞,在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade营养缺陷型培养基上30℃培养3-5 d,挑选单克隆于YPDA培养基中培养,吸取1 μL各候选克隆的菌液点至于SD/Raf/Gal/x-gal平板上培养,筛选蓝色单克隆。将筛出的单克隆经测序、序列比对分析,初步获得与TaMAPK2互作的候选蛋白。采用双酶切的方法构建pGADT7-HSP90以及pSPYNE-TaMAPK2和pSPYCE-HSP90双分子荧光互补表达载体,将重组载体质粒pGADT7-HSP90和pGBKT7-TaMAPK2共转化AH109酵母感受态细胞,利用酵母双杂交的方法验证TaMAPK2与候选蛋白HSP90的相互作用;采用PEG-Ca2+介导法将双分子荧光互补表达载体pSPYNE-TaMAPK2和pSPYCE-HSP90共转化小麦原生质体细胞,激光共聚焦显微镜下观察相互作用产生的YFP荧光信号。根据HSP90的保守序列设计特异引物,在SYBR Green Ⅰ的检测模式基础上,构建HSP90的实时荧光定量PCR检测体系,检测HSP90在不同胁迫处理以及不同组织的小麦植株中的表达量。【结果】通过对候选蛋白的初步分析表明这些候选蛋白主要参与植物体的信号转导或免疫过程,表明TaMAPK2在植物的逆境信号转导、基因转录调控过程中发挥着重要作用。通过酵母双杂交显蓝系统和双分子荧光互补技术（BiFc）进一步确认HSP90与TaMAPK2的互作关系。HSP90定位在细胞核、细胞膜以及细胞质中,且在植物的根茎叶中均有表达,在根中的表达量最高。通过实时荧光定量PCR分析显示,HSP90基因受到高温、低温、高盐和ABA胁迫后表达量上调。【结论】HSP90作为分子伴侣,在降解这些受损或异常蛋白以及调控抗逆相关转录因子表达的过程中发挥着重要的作用。非生物胁迫会引起植物体内一些受损或异常蛋白聚合物的积累,HSP90能通过折叠已损坏的蛋白底物以及构象的维持来保持细胞的完整性。表明在植物逆境信号转导过程中,TaMAPK2功能的发挥可能需要HSP90蛋白的参与。     

葡萄细胞分裂素响应调节因子VvRR2互作蛋白筛选与鉴定

【目的】从葡萄中克隆细胞分裂素响应调节因子VvRR2,获得VvRR2的互作蛋白,为阐明VvRR2在欧洲葡萄抗病反应中的作用机制提供依据。【方法】对葡萄接种白粉病菌,提取总RNA后反转录,利用实时荧光定量PCR检测VvRR2转录本对白粉病菌的响应;构建瞬时表达载体pBI221-VvRR2-GFP,转化拟南芥原生质体进行亚细胞定位分析;构建酵母表达载体pGBKT7-VvRR2,转化酵母菌株AH109,检测VvRR2的转录激活活性;构建酵母表达cDNA文库,以VvRR2为诱饵,通过Mating法筛选互作蛋白,对获得候选序列进行Blast分析;将候选蛋白VvTGA的全长序列克隆至pGADT7载体形成重组载体pGADT7-VvTGA,与重组诱饵载体pGBKT7-VvRR2共转化酵母,进行双杂交验证VvRR2与VvTGA的相互作用;将VvTGA的全长序列克隆至pSPYNE（R）173载体,形成重组载体pSPYNE-VvTGA,将VvRR2的全长序列克隆至pSPYCE（M）载体,形成重组载体pSPYCE-VvRR2,然后将两个重组载体共转化拟南芥原生质体,利用双分子荧光互补技术验证VvRR2与VvTGA的相互作用。【结果】葡萄接种白粉病菌后,细胞分裂素响应调节因子VvRR2呈现受白粉病菌诱导表达模式。VvRR2定位在拟南芥原生质体的细胞核,转录激活试验结果表明VvRR2在酵母体内具有转录激活活性。在含有60 mmol·L^-1的3-AT培养基上可以抑制VvRR2诱饵载体的自激活活性,VvRR2诱饵载体对宿主酵母菌没有毒性。以VvRR2为诱饵,初步筛选到287个单克隆,在高严谨条件下进一步筛选获得23个有效序列,Blast分析显示这些基因参与蛋白质合成与降解、细胞分裂素信号传导、光反应和生物钟节律、生长发育和逆境响应。酵母回复双杂交试验结果显示含有空载体（pGADT7或pGBKT7）酵母在四缺培养基（含3-AT）上不能生长,含有两种重组质粒的酵母在四缺培养基（含3-AT）上能够生长,并在含有X-α-Gal的四缺培养基上能够显色。双分子荧光互补试验结果显示共转化pSPYCE-VvRR2与pSPYNE（R）173、pSPYNE-VvTGA与pSPYCE（M）的原生质体没有黄色荧光,而共转化pSPYCE-VvRR2与pSPYNE-VvTGA的原生质体显示黄色荧光。VvTGA的表达类似于VvRR2,呈现受白粉病菌诱导表达模式。【结论】葡萄细胞分裂素响应调节因子VvRR2是一个受白粉病菌诱导表达的转录因子,能够与VvTGA相互作用,并且VvTGA受白粉病菌诱导表达。     

致病疫霉酵母双杂交cDNA文库的构建及鉴定

致病疫霉是引起马铃薯晚疫病的重要病原菌,在全世界范围内造成了严重的经济损失。以2种不同致病力的致病疫霉菌株侵染马铃薯叶片5个时间点的混合菌丝样品作为cDNA文库的材料来源,利用Gateway法分别构建了初级文库与次级文库,初级文库与次级文库的库容量分别为1.60×10⁷、1.52×10⁷ CFU,插入片段长度大多在1 000～2 000 bp之间,重组率均达到100%。次级文库质粒转化酵母菌构建酵母文库,所得酵母文库滴度为1.00×10⁸ CFU/mL,转化效率为6×10⁸ CFU/μg。结果表明,本研究构建的酵母双杂交cDNA文库质量较高,完全可以满足互作蛋白高质量、高效率筛选的要求。该文库为后续深入解析致病疫霉的致病机制奠定了基础。     

香水柠檬RHF2A的克隆与互作蛋白的筛选

【目的】以香水柠檬（Citrus limon (L.) Burm. F.）为研究对象,分析两个RHF2A的时空表达规律,利用酵母双杂交技术和双分子荧光互补试验（BiFC）筛选、验证其互作蛋白,为深入研究RHF2A在香水柠檬自交不亲和过程中的分子作用机制奠定基础。【方法】从前期转录组和泛素修饰组（未公开）筛选获得2个E3泛素连接酶RHF2A（RING-H2 Zinc Finger2A）基因RHF2A-1、RHF2A-2,并克隆其全长序列,通过生物信息学分析2个RHF2A的序列和蛋白质结构,预测其启动子顺式作用元件,构建35S-RHF2A-GFP融合蛋白表达载体用于亚细胞定位分析,采用实时荧光定量PCR分析两个RHF2A的时空表达模式,构建酵母双杂诱饵载体从香水柠檬酵母文库筛选互作蛋白。构建BiFC载体,在洋葱活体细胞内对目标蛋白进行互作验证。【结果】从香水柠檬克隆获得RHF2A-1、RHF2A-2,ORF全长分别为1 161和1 134 bp;NCBI结构域预测发现其具有Ring/U-box结构域。启动子分析发现其具有花粉特异性表达相关元件POLLEN1LELAT52、GTGANTG10。组织表达分析发现RHF2A-1在花粉特异性表达,RHF2A-2在叶中特异性表达;时空表达分析结果显示,RHF2A-1在自交柱头表达量从第1天开始升高,第3天达到峰值,是杂交柱头表达量的5倍以上。亚细胞定位显示RHF2A-1和RHF2A-2定位在细胞核。经过Uniprot网站预测其互作蛋白显示RHF2A能与KRP6、AT3G57370、UBA1、FBL17、SK11蛋白相互作用,推测其参与自交不亲和泛素化反应途径、配子体发育调控、花粉的生长发育等生物学过程。通过酵母双杂交技术筛选出72个克隆,对其测序并进行Blast比对后排除重复克隆,最终得到ABCF3等20个候选互作蛋白。经过一对一互作验证、双分子荧光互补实验确定RHF2A-1与ABCF3-2存在互作关系。【结论】RHF2A-1的时空表达规律与自交不亲和过程中花粉在雌蕊上的萌发规律相吻合;筛选得到柠檬授粉过程中直接影响花粉生长发育的互作候选蛋白,初步证明RHF2A-1在自交不亲和过程中具有重要作用。     

不结球白菜Pol胞质雄性不育花酵母双杂交cDNA文库的构建及筛选

[目的]构建不结球白菜Pol胞质雄性不育花酵母双杂交cDNA文库,筛选与细胞色素C还原酶铁硫蛋白(BcRISP1)互作的蛋白.[方法]从不结球白菜Pol胞质雄性不育花中提取总RNA,通过长距离PCR,扩增双链cDNA(ds cDNA).采用SMART建库技术构建不结球白菜Pol胞质雄性不育花全长cDNA文库.利用BcRISP1基因的开放阅读框,构建诱饵表达载体pGBK T-7-BcRISP1转化AH109酵母菌,根据酵母双杂交技术筛选出与BcRISP1互作的片段,并进行质粒共转化验证.[结果]经检测,文库的转化率为每μg pGADT7-Rec 1.80× 106转化子,文库滴度为1.21×107 CFU·mL-1,重组率为94％,成功构建可以用于酵母双杂交的cDNA文库.酵母双杂交技术获得了与BcRISP1互作的阳性克隆,试验表明诱饵载体表达产物对酵母无毒性作用,质粒共转化试验初步验证了BcRISP1与CYP81G、PIP2蛋白的互作关系.[结论]cDNA文库的成功构建为后期互作蛋白的顺利筛选奠定了基础,利用酵母双杂交技术成功获得与BcRISPl互作的蛋白CYP81G和PIP2,为明确不结球白菜Pol胞质雄性不育相关基因的信号传递通路提供更多的依据,以期从分子水平上进一步阐明不结球白菜Pol胞质雄性不育的机制.     

酵母双杂交筛选与小鼠维生素D受体互作的蛋白

通过酵母双杂交实验技术筛选小鼠VDR相互作用的蛋白质,评价不同蛋白与VDR的结合活性,以期获得基于互作影响雄性生殖能力基因。扩增小鼠VDR完整CDS序列,克隆至诱铒表达载体pGBKT7,经菌落PCR、DNA测序鉴定,获得重组载体pGBKT7-VDR。随后将重组载体转化至酿酒酵母AH109,并进行毒性和自激活检测;然后与含小鼠cDNA文库的Y187酵母杂交,获得阳性克隆,经HindⅢ酶切,测序分析VDR互作候选蛋白的核酸序列,再检测β-半乳糖苷酶活性,评价候选蛋白与VDR作用力的强弱。结果表明,从小鼠cDNA文库中获得12个与VDR互作的候选蛋白。初步检测到12个蛋白可能与VDR互作,其中3个蛋白因子可能与VDR结合并调控蛋白激酶磷酸化或去磷酸化以影响精子形成、发育和精子活力。     

利用番茄cDNA酵母双杂交文库筛选Pti4互作蛋白

以番茄的根、叶、花及不同发育时期的果实提取RNA,构建酵母双杂交文库。经检测,文库容量为1.1×10~7 CFU,阳性率大于95%,插入片段平均长度大于1 000 bp,可用于互作蛋白的筛选。依据番茄抗病途径相关基因Pti4编码序列设计引物,构建重组诱饵载体并转化酵母菌,筛选与Pti4相互作用的蛋白质。经初步检测获得6个可能与Pti4互作的转录因子,为进一步研究番茄Pti基因的作用机制提供了基础。