猪血管内皮细胞中分子伴侣Jiv9O基因的克隆与原核表达

克隆到猪Jiv90基因,构建原核表达载体并在大肠埃希菌中表达.从猪血管内皮细胞中克隆到Jiv90基因,将其克隆到pET-32a载体上,构建出重组表达载体,经IPTG诱导表达.结果表明,本试验成功克隆了大小为693 bp的基因,重组质载体pET-32a-Jiv90所表达的蛋白在大肠埃希菌中以包涵体的形式存在,表达产物经S...     

鹅细小病毒NS2基因的原核表达及抗原性检测

为原核表达鹅细小病毒(GPV)NS2蛋白,本研究利用特异性引物扩增获得GPV的H1分离株NS2基因,将其克隆于pMD18-T载体后进行序列测定。并将NS2基因亚克隆于原核表达载体pGEX-6P-1中,获得重组质粒pGEX-NS2。该质粒转化于感受态菌BL21(DE3)plysS中,经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳分析,表达的重组蛋白约为75ku左右。经过亲和层析方法获得了纯化的重组NS2蛋白。Westernblot和Dot-ELISA鉴定结果表明,表达的重组NS2蛋白可以与GPV阳性血清发生特异性反应。     

鸡膜联蛋白A2的原核表达与纯化

试验旨在对鸡膜联蛋白A2(ANXA2)基因进行原核表达与纯化。利用鸡ANXA2基因特异性引物从鸡卵泡细胞cDNA中扩增ANXA2基因,亚克隆至原核表达载体p ET-32a(+)构建重组原核表达载体pET-32a-chANXA2。将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达,并分析重组蛋白的表达形式;利用含Ni2+琼脂球对重组蛋白进行纯化,并利用Western blot进行鉴定。结果显示:成功构建重组原核表达载体pET-32a-chANXA2,重组蛋白His-chANXA2在0.1 mmol/L IPTG、诱导表达5 h和30℃诱导温度条件下表达量高,其在上清和包涵体中均有表达,但主要以包涵体形式存在。利用含Ni2+琼脂球从诱导菌裂解物上清中得到了纯度较高的重组蛋白,Western blot检测到与预期大小相符的重组蛋白条带。研究结果为后续开展ANXA2调控鸡卵泡发育的分子机制研究奠定基础。     

迟缓爱德华菌菌毛蛋白原核表达及多抗血清制备

为研究迟缓爱德华菌菌毛蛋白PILI的功能和免疫原性,本研究利用PCR方法从迟缓爱德华菌基因组中克隆出pili基因,并将其构建到pET-32a原核表达载体上,重组载体转化BL21大肠杆菌诱导重组蛋白表达,通过SDSPAGE和Western blot方法验证重组蛋白表达。用亲和层析方法纯化蛋白,纯化的蛋白免疫小鼠,所得的多抗血清能够特异性识别迟缓爱德华菌PILI蛋白,为研究PILI蛋白奠定基础。     

单增李斯特菌内化素A分段表达及多克隆抗体的制备

为了研究单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)Inl A蛋白入侵细胞时各段相关功能,试验采用PCR技术扩增得到L.monocytogenes 08-5923株Inl A基因片段,测序后利用Gen Bank对Inl A氨基酸序列进行分段,分为2个基因片段,即Inl A1(1~1 488 bp)和Inl A2(1 315~2 403 bp),将其分别克隆至原核表达载体p GEX-6P-1中,并转化至宿主菌中诱导表达,表达的重组蛋白经Western-blot和间接ELISA法鉴定,用纯化的重组蛋白分别免疫家兔,并用ELISA法检测家兔多克隆抗体的特异性。结果表明:表达的2种重组蛋白分子质量分别约为79 ku和64 ku,以其制备的多克隆抗体均可与单增李斯特菌Inl A天然蛋白发生反应;2种重组蛋白均能有效诱导抗体反应,其中Inl A2(new flag)诱导产生的抗体效价较高,与单增李斯特菌Inl A天然蛋白结合能力较强。     

布鲁菌外膜蛋白OMP25的原核表达

为了克隆布鲁菌外膜蛋白OMP25基因并构建基因的原核表达系统,试验采用聚合酶链反应(PCR)扩增得到布鲁菌基因组OMP25基因片段,T-A克隆后测定核苷酸序列,将目的基因定向插入原核表达载体pET-32a,经双酶切和DNA测序,再将构建的重组质粒转化到E.coil DH5α、Rosetta,经IPTG诱导后用SDS-P...     

鹅IL-2成熟基因的表达及重组蛋白生物活性检测

从PHA活化的东北白鹅外周血淋巴细胞中分离提取总RNA,利用反转录PCR技术扩增获得鹅IL-2(GoIL-2)基因,连接至克隆载体后进行测序鉴定,结果与预期大小一致.将去除信号肽的成熟基因亚克隆至原核表达载体,构建原核重组表达质粒并转化至大肠杆菌中进行诱导表达,用表达纯化的融合蛋白制备多克隆抗血清.此外,体外淋巴细胞增殖实验结果显示,鹅GoIL-2重组蛋白具有促进淋巴细胞增殖的活性,这为进一步研究GoIL-2的功能奠定了基础.     

新城疫病毒F基因在大肠杆菌中的高效表达及其免疫原性分析

应用PCR技术,以含有新城疫病毒F48E8株全长融合蛋白(F)基因的真核表达质粒pVAX1-F为模板,扩增出594bp大小的F基因的部分片段.经克隆筛选和测序后,构建成重组原核表达质粒pGEX-6P-1-F.重组质粒转化表达菌BL21,获得重组菌BL21(pGEX-6P-1-F).经IPTG诱导和SDS-PAGE分析表明,F基因在原核表达体系中获得高效表达,表达量占菌体总蛋白的23%.Western blotting结果显示,在相对分子质量46 ku位置有特异性条带.动物实验结果表明,F蛋白免疫鸡产生的针对新城疫病毒F蛋白的血清抗体效价显著高于空白对照组(P＜0.05),说明原核表达系统表达的F蛋白具有良好的免疫原性.     

南阳牛BoLA-DRA基因的克隆及其在大肠埃希菌中的表达

为克隆南阳牛BoLA-DRA基因,构建原核表达载体并研究该基因在大肠埃希菌中的表达。从南阳牛脾脏组织中提取总RNA,利用RT-PCR方法扩增得到BoLA-DRA基因,将其克隆至pGEM-Teasy克隆载体上,转化感受态细胞DH5α,经测序鉴定后,进一步亚克隆至原核表达载体pGEX-4T-1中,构建出重组表达质粒,经IPTG诱导表达。结果表明,本试验成功克隆了大小为917 bp的BoLA-DRA基因,重组质粒pGEX-4T-DRA在大肠埃希菌中以包涵体形式表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blot鉴定大小为54.4 ku,与预期结果一致。为进一步研究该蛋白的功能及制备抗体奠定了基础。     

猪血管内皮细胞中分子伴侣Jiv90基因的克隆与原核表达

克隆到猪Jiv90基因,构建原核表达载体并在大肠埃希菌中表达。从猪血管内皮细胞中克隆到Jiv90基因,将其克隆到pET-32a载体上,构建出重组表达载体,经IPTG诱导表达。结果表明,本试验成功克隆了大小为693 bp的基因,重组质载体pET-32a-Jiv90所表达的蛋白在大肠埃希菌中以包涵体的形式存在,表达产物经SDS-PAGE和Western blot鉴定大小为46 ku,与预期结果一致。为进一步研究该蛋白的功能及制备抗体奠定了基础。     

番鸭GDF9基因克隆、生物信息学及组织表达分析

【目的】 对番鸭（Cairina moschata）生长分化因子9（growth differentiation factor 9,GDF9）基因进行克隆及结构和功能的预测,并检测其在就巢期和产蛋期番鸭各组织中的表达差异。【方法】 以番鸭卵巢组织cDNA为模板,利用快速扩增cDNA末端（rapid-amplification of cDNA ends,RACE）技术对GDF9基因进行扩增和克隆,利用生物信息学软件对GDF9基因的编码序列进行相似性分析和进化树构建,分析其基本理化性质和编码氨基酸序列的结构特征。利用实时荧光定量PCR技术检测就巢期番鸭和产蛋期番鸭各组织中GDF9基因的相对表达量。【结果】 GDF9基因CDS区全长1 380 bp,编码459个氨基酸;番鸭GDF9基因序列与GenBank已公布的凤头潜鸭、绿头鸭、天鹅、棕硬尾鸭、浙东白鹅、企鹅、鸡、牛、绵羊、猪和小鼠对应序列的相似性依次为98.8%、97.5%、96.4%、95.8%、94.4%、90.2%、87.5%、64.5%、64.2%、63.9%和60.6%。系统进化树结果显示,番鸭与凤头潜鸭和绿头鸭的亲缘关系较近,与小鼠的亲缘关系较远。GDF9蛋白分子质量为52.81 ku,是一种不稳定的碱性亲水膜外蛋白,有1个信号肽,含有45个磷酸化位点,8个O-糖基化位点,3个N-糖基化位点,存在1个转化生长因子-β（TGF-β）结构域;蛋白质的二级结构由无规则卷曲、α-螺旋、T-转角和β-折叠构成,所占比例分别为58.61%、22.22%、16.56%和2.61%。GDF9蛋白三级结构预测结果与二级结构一致。GDF9蛋白可能与BMP15、BMPR1B、BMPR2、TGFBR1、ACVR1B、POF1B、ZP2、ZAR1和MOS蛋白存在相互作用。实时荧光定量PCR结果显示,就巢期和产蛋期番鸭各组织中均有GDF9基因的表达,其中两个时期卵巢中的表达量均最高,且均极显著高于同一时期其他组织基因表达量（P<0.01）。同一组织不同时期相比,就巢期番鸭GDF9基因在脾脏、心脏和肾脏的表达量显著或极显著低于产蛋期（P<0.05;P<0.01）,在卵巢中的表达量极显著高于产蛋期（P<0.01）,其他组织中的表达量在两个时期间差异均不显著（P>0.05）。【结论】 本研究成功克隆番鸭GDF9基因,GDF9基因在番鸭各组织中均有表达,GDF9基因为番鸭产蛋期和就巢期卵巢、心脏、肾脏和脾脏的差异表达基因。该研究为进一步探索番鸭GDF9基因的功能提供了理论依据,也为研究GDF9基因在卵巢发育中的生物学功能及其分子机制奠定基础。     

番鸭细小病毒与鸭圆环病毒二重PCR方法的建立

根据基因库中鸭圆环病毒和番鸭细小病毒的基因序列,分别设计了两对特异性引物,通过对二重PCR扩增条件的优化,研究建立了可同时鉴别检测鸭圆环病毒和番鸭细小病毒的二重PCR方法。用该方法对同一样品中鸭圆环病毒和番鸭细小病毒的模板进行PCR扩增,结果均得到了与实验设计相符的351bp（鸭圆环病毒）和474bp（番鸭细小病毒）的扩增条带,而对鸭Ⅰ型肝炎病毒、鹅细小病毒、鸭副黏病毒、鸭瘟病毒和禽流感病毒等病原体的检测全为阴性。敏感性测定结果表明：该二重PCR技术最低能检出100fg的鸭圆环病毒和番鸭细小病毒DNA模板。研究建立的鸭圆环病毒和番鸭细小病毒的二重PCR方法,具有快速、敏感、特异、定量和重复性好等优点,可用于临床上鸭圆环病毒和番鸭细小病毒感染的检测。     

番鸭"花肝病"病原的研究

文章对番鸭"花肝病"病原进行了研究,证实病原为番鸭呼肠孤病毒。该病毒大小为50nm-70nm左右,圆形,无囊膜;雏番鸭人工感染该病毒后可出现和自然病例相同的临床症状和病理变化,并能回收到病毒,鸡、麻鸭人工感染不发病;该病毒不凝集鸡、鸭的红细胞,能够在鸡胚、番鸭胚成纤维细胞上增殖并出现明显的细胞病变;核酸类型为RNA,琼扩试验表明与禽呼肠孤病毒有血清学交叉反应。     

间接免疫荧光方法快速检测番鸭呼肠孤病毒病

本研究应用具有免疫荧光特性的抗番鸭呼肠孤病毒病单克隆抗体(MDRV 237-11)建立了检测番鸭呼肠孤病毒病抗原的间接免疫荧光(Mab-IFA)方法。结果显示人工感染MDRVMW9710株病毒后发病和死亡番鸭组织切片均可检出阳性病灶;且组织匀浆经尿囊腔途径接种12日龄番鸭胚,取死亡胚心制作冰冻切片进行IFA鉴定呈阳性结果。表明该方法特异性好、可用于快速检测番鸭呼肠孤病毒病。     

番鸭下丘脑组织的RNA-Seq特征分析

为筛选番鸭下丘脑组织中的基因组信息,本研究以NCBI数据库中已标注的绿头鸭基因组（登录号：BGI_duck_1.0）为参照,利用RNA-Seq技术对番鸭下丘脑组织基因表达水平,以及可变剪切事件、SNPs及InDel进行筛选。结果显示,共鉴定出14 619个基因表达（FPKM ≥ 1）,占筛选出总基因数的72.7%。共有5 034个基因发生了7 528次可变剪切,其中外显子跳跃占92.76%,第一个外显子可变剪切和内含子滞留所占比例最小,共占总数的0.027%。通过RNA-Seq技术,本研究还筛选到646 423个SNP位点和77 712个InDel位点。对SNPs和InDel所在的基因进行功能注释发现,这些基因主要参与分子功能、生物过程和细胞组成过程。通过KEGG通路分析发现,出现SNPs和InDel所在基因主要富集在内分泌调节和神经行为调节的相关通路上,表明下丘脑既可参与内分泌调节,又参与动物的神经行为调节。本研究筛选出的数据不仅丰富了番鸭的遗传信息,而且也建立了番鸭相关基因的SNPs和InDel的数据库,这为番鸭的遗传育种工作及相关功能基因的具体定位提供了可靠依据,同时也为以后番鸭行为的研究提供了一定的参考价值。     

不同羽色和性别番鸭屠宰性能及肌肉成分比较研究

研究旨在比较不同羽色及性别番鸭在屠宰性能及肌肉成分上的差别,为选育优良番鸭品种提供依据。试验选取1日龄黑羽番鸭、白羽番鸭及黑白花番鸭公、母共324羽,按羽色、性别分为6个处理,每处理设6个重复,每重复9只鸭,各处理饲喂相同日粮,试验期90d。结果表明：雄性黑羽番鸭屠宰率、全净膛率显著高于雄性白羽及黑白花羽番鸭（P〈0．05）,而雌性黑白花番鸭及白羽番鸭的胸肌率和瘦肉率相近且均显著高于雌性黑羽番鸭（P〈0．05）;各处理番鸭肌肉中汞、镉、砷、铅含量无显著差异（P〉0．05）,且均很微量;各同羽色雄性番鸭肌肉水分、无氮浸出物和粗蛋白质含量均基本略高于其同羽色雌性番鸭,而各处理雌性番鸭肌肉粗脂肪、粗灰分含量则高于其同羽色的雄性番鸭;雄性白羽番鸭和黑白花番鸭肌肉粗蛋白质含量相近且均显著高于雄性黑羽番鸭（P〈0．05）;各同羽色番鸭中基本上肌肉氨基酸含量均以雄性高于雌性,而同性别的番鸭比较,雄性白羽番鸭肌肉中多种氨基酸的含量显著高于雄性黑羽及雄性黑白花羽番鸭（P〉0．05）;同时雌性各羽色番鸭肌肉中多种氨基酸含量呈现出：黑白花番鸭〉黑羽番鸭〉白羽番鸭,但该趋势不显著（P〉0．05）。试验结果表明,雄性黑羽番鸭屠宰性能有一定优势,白羽番鸭肌肉养分和氨基酸含量优势明显。     

基于主成分分析法建立鸭一般抗病力的评估模型

研究对家鸭(金定鸭、樱桃谷鸭、苏牧麻鸭)、番鸭、半番鸭的白蛋白(X1)、球蛋白(X2)、总蛋白(X3)、IgA(X4)、IgM(X5)、IgG(X6)和AI抗体HI效价(X7)等7个免疫指标进行测定,并对这7个免疫指标进行主成分分析。结果表明:选取前2个特征值作为2个主成分(累计贡献率达到90.70%),基本上反映了原所有免疫指标包含的全部信息;通过建立主成分综合评价模型,比较5个群体主成分综合得分,金定鸭得分最高,其次分别为樱桃谷鸭、番鸭,苏牧麻鸭、半番鸭表现较低。     

不同杂交组合半番鸭生产性能的研究

以法国番鸭为父本 ,分别以樱桃谷鸭、金定鸭及樱桃谷鸭与金定鸭杂交后代为母本 ,组成 3个杂交组合。采用人工授精的方法生产半番鸭 ,观测各杂交组合半番鸭的生长速度、生活力、产肉效率和经济效益。发现番樱半番鸭 1 0周龄体重、料肉比、产肉效率、经济效益等指标明显优于其他 2个组合 ,番樱金半番鸭其次 ,番金半番鸭最差     

番鸭细小病毒病病原的血清学检测与PCR鉴定

为了解安徽省番鸭细小病毒病的流行情况,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)对该省内部分番鸭群进行鹅细小病毒的血清抗体检测,同时对疑似病鸭进行了病原的PCR检测。结果发现,在被检测的44份血清样本中鹅细小病毒血清抗体阳性率高达34.1%;PCR检测结果显示,所检测的样品中,有2份为鹅细小病毒阳性,1份为番鸭细小病毒阳性,且3份被检样品均来自雏番鸭。该研究结果表明,该省番鸭群中存在鹅细小病毒和番鸭细小病毒感染,应采取有效的预防控制措施。     

运用微卫星标记分析11个鸭种(群)的亲缘关系

利用9个微卫星标记对11个鸭种（群）的平均基因杂合度、多态信息含量以及群体间的亲缘关系进行分析.结果11个鸭种的平均基因杂合度为0.659 9;平均多态信息含量为0.596 6.其中,黑羽番鸭（白头）平均基因杂合度最高,为0.694 8,荆江麻鸭平均遗传杂合度最低,为0.575 7.平均多态信息含量也出现了类似的结果,说明黑羽番鸭（白头）遗传多样性最丰富.根据遗传距离构建NJ系统发生树,系统发生树分析结果表明：黑羽番鸭（纯黑）、黑羽番鸭（白头）、白羽番鸭聚为第1类群;山麻鸭、金定鸭、高邮鸭聚为第2类群;苏牧白羽鸭、苏牧黑羽鸭、龙白鸭、苏牧麻鸭、荆江麻鸭聚为第3类群.