番鸭GDF9基因克隆、生物信息学及组织表达分析

【目的】 对番鸭（Cairina moschata）生长分化因子9（growth differentiation factor 9,GDF9）基因进行克隆及结构和功能的预测,并检测其在就巢期和产蛋期番鸭各组织中的表达差异。【方法】 以番鸭卵巢组织cDNA为模板,利用快速扩增cDNA末端（rapid-amplification of cDNA ends,RACE）技术对GDF9基因进行扩增和克隆,利用生物信息学软件对GDF9基因的编码序列进行相似性分析和进化树构建,分析其基本理化性质和编码氨基酸序列的结构特征。利用实时荧光定量PCR技术检测就巢期番鸭和产蛋期番鸭各组织中GDF9基因的相对表达量。【结果】 GDF9基因CDS区全长1 380 bp,编码459个氨基酸;番鸭GDF9基因序列与GenBank已公布的凤头潜鸭、绿头鸭、天鹅、棕硬尾鸭、浙东白鹅、企鹅、鸡、牛、绵羊、猪和小鼠对应序列的相似性依次为98.8%、97.5%、96.4%、95.8%、94.4%、90.2%、87.5%、64.5%、64.2%、63.9%和60.6%。系统进化树结果显示,番鸭与凤头潜鸭和绿头鸭的亲缘关系较近,与小鼠的亲缘关系较远。GDF9蛋白分子质量为52.81 ku,是一种不稳定的碱性亲水膜外蛋白,有1个信号肽,含有45个磷酸化位点,8个O-糖基化位点,3个N-糖基化位点,存在1个转化生长因子-β（TGF-β）结构域;蛋白质的二级结构由无规则卷曲、α-螺旋、T-转角和β-折叠构成,所占比例分别为58.61%、22.22%、16.56%和2.61%。GDF9蛋白三级结构预测结果与二级结构一致。GDF9蛋白可能与BMP15、BMPR1B、BMPR2、TGFBR1、ACVR1B、POF1B、ZP2、ZAR1和MOS蛋白存在相互作用。实时荧光定量PCR结果显示,就巢期和产蛋期番鸭各组织中均有GDF9基因的表达,其中两个时期卵巢中的表达量均最高,且均极显著高于同一时期其他组织基因表达量（P<0.01）。同一组织不同时期相比,就巢期番鸭GDF9基因在脾脏、心脏和肾脏的表达量显著或极显著低于产蛋期（P<0.05;P<0.01）,在卵巢中的表达量极显著高于产蛋期（P<0.01）,其他组织中的表达量在两个时期间差异均不显著（P>0.05）。【结论】 本研究成功克隆番鸭GDF9基因,GDF9基因在番鸭各组织中均有表达,GDF9基因为番鸭产蛋期和就巢期卵巢、心脏、肾脏和脾脏的差异表达基因。该研究为进一步探索番鸭GDF9基因的功能提供了理论依据,也为研究GDF9基因在卵巢发育中的生物学功能及其分子机制奠定基础。