表达小鹅瘟病毒VP2蛋白重组鸭瘟病毒的构建及其生物学特性

【目的】鸭瘟和小鹅瘟是番鸭和鹅的两种重要传染病,鸭瘟最主要的防治措施是定期接种鸭瘟病毒减毒活疫苗。根据2012年国际病毒分类委员会（ICTV）的报告,DEV被归为疱疹病毒科的α疱疹病毒亚科马立克氏病毒属。疱疹病毒如伪狂犬病毒、马立克氏病毒、火鸡疱疹病毒等已广泛用于病毒活载体的研究,而近几年也有关于鸭瘟病毒（DEV）作为疫苗活载体的报道。为了为免疫防控鸭瘟和小鹅瘟提供新手段,本研究拟在鸭瘟病毒疫苗株感染性克隆的基础上,构建表达小鹅瘟病毒（GPV）主要免疫原蛋白VP2的重组病毒rDEV-VP2,并研究其生物学特性,进而探讨重组病毒rDEV-VP2作为防治DEV和GPV的二联重组活载体疫苗的可能性。【方法】将密码子优化的GPV VP2基因通过常规基因克隆的方法插入转移载体pEP-BGH-end,构建含有GPV VP2表达框pCMV-VP2-BGH-pA的重组表达质粒。在鸭瘟病毒（DEV）疫苗株细菌人工染色体克隆pDEV-EF1的基础上,通过“Red E/T”两步重组法将GPV VP2基因表达框插入到DEV US7和US8基因之间构建了突变体克隆pDEV-VP2。利用磷酸钙法转染鸡胚成纤维细胞（CEFs）拯救获得重组病毒rDEV-VP2和删除Bac质粒序列的rDEV-VP2-Cre,并对重组病毒细胞体外生长曲线、蚀斑大小和VP2蛋白表达情况进行测定。将rDEV-VP2接种番鸭,在不同时间采集血清,采用间接ELISA法检测血清中GPV VP2抗体产生情况。【结果】间接免疫荧光检测和Western blotting分析表明,外源蛋白VP2在CEFs细胞成功表达。病毒生长曲线和蚀斑大小测定结果显示,rDEV-VP2在CEFs细胞上的增殖滴度与亲本株相比无显著差异,表明外源基因VP2的插入不影响rDEV重组病毒的增殖。动物试验结果表明,7日龄雏番鸭接种rDEV-VP2可以诱导产生针对GPV VP2的抗体,免疫后3周抗体阳性率为50%（4/8）。【结论】本实验将小鹅瘟病毒的主要免疫原基因VP2插入到DEV疫苗株基因组的US7和US8基因间构建了表达该免疫原性基因的重组鸭瘟病毒细菌人工染色体,继而在鸡胚成纤维细胞（CEFs）上拯救获得了重组病毒rDEV-VP2,病毒细胞生长特性与亲本株基本一致,且能诱导鸭体产生GPV VP2特异性的抗体。该研究为研制DEV-GPV二联重组活载体疫苗奠定了基础。     

重组鸭瘟病毒载体中筛选高效表达鸭坦布苏病毒E蛋白启动子

【背景】鸭瘟和鸭坦布苏病毒是鸭的两种重要传染病,鸭瘟属于疱疹病毒科,具有开发成病毒载体的优势。为了优化鸭坦布苏病毒E基因在重组鸭瘟病毒载体中的表达,之前探讨了不同形式鸭坦布苏病毒E蛋白在重组鸭瘟病毒载体中的表达,发现以鸭为宿主进行密码子优化的E基因C端截短形式（E451-dk,简称为Es）表达量最高。【目的】探讨不同启动子对Es 在重组鸭瘟病毒载体中表达的影响,为鸭瘟病毒—坦布苏病毒二联苗的研制奠定基础。【方法】将pCAG、 pSV40、pRSV、p1.8k(MDV)和pgB(MDV)启动子通过常规基因克隆的方法替换转移载体pEP-BGH-Es中的pCMV启动子,构建不同启动子调控Es表达的重组表达框pro-Es-BGH-pA。在鸭瘟病毒（DEV）疫苗株细菌人工染色体克隆pDEV-EF1的基础上,将5个重组表达框分别通过“Red E/T两步重组”克隆至pDEV-EF1突变体的US7和US8基因之间,构建了携带不同启动子调控的Es突变体克隆pDEV-pro-Es。用磷酸钙法转染鸡胚成纤维细胞（CEFs）拯救获得相应重组病毒rDEV-pro-Es,并对重组病毒感染细胞蚀斑大小和Es蛋白表达情况进行测定。【结果】将重组突变体克隆转染细胞拯救获得了5株重组病毒rDEV-pro-Es。Western blotting分析表明外源蛋白Es在 pRSV调控下表达量最高,其表达量较rDEV-Es提高了169.12%。【结论】完成了Es在重组鸭瘟病毒载体中高效表达启动子的筛选,获得了一种调控Es高效表达的启动子pRSV。同时也获得了一株高效表达鸭坦布苏病毒外源基因Es的重组鸭瘟病毒rDEV-pRSV-Es。     

表达绿色荧光蛋白重组鸭肠炎病毒构建

【目的】鸭肠炎病毒(duck enteritis virus, DEV)不同毒株间存在明显差异,DEV疫苗株的UL2基因在195bp后连续缺失528bp,导致第65位氨基酸后连续缺失176aa^[1]。将绿色荧光蛋白（GFP）基因插入DEV UL2基因中,获得表达绿色荧光蛋白的重组病毒,以研究UL2基因对DEV生物特性的影响和探讨DEV作为载体表达外源基因的可行性。【方法】以实验室保存的DEV细胞适应株DNA为模板,利用PCR技术扩增出病毒UL2基因上下游序列并克隆入pMD-18T载体;以UL2基因作为外源基因插入靶点及同源重组臂,将CMV启动子控制的含有GFP-gpt基因表达盒克隆入DEV UL2基因中,构建含GFP基因的转移质粒载体pT-UL2-GFP-gpt;用脂质体将其与DEV细胞适应株共转染CEF细胞,待80%细胞出现病变后,冻融3次,接种到新鲜CEF细胞单层的6孔培养板中,用含5%血清、1%双抗、1%琼脂的M199培养液覆盖,在荧光显微镜下挑取单个有绿色荧光的蚀斑,再接到新的细胞上,重复蚀斑筛选、纯化表达绿色荧光蛋白的重组病毒;利用PCR、基因测序技术鉴定重组病毒;重组病毒接种CEF（moi=0.01）,每12h取出1瓶接毒细胞,分别收集上清和细胞,测量其病毒含量,绘制一步生长曲线;重组病毒在CEF中连续传代20次,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况,并用PCR检测GFP的传代稳定性;重组病毒免疫4周龄SPF鸭后14d,肌肉注射接种DEV强毒（CVCC AV1221）,观察免疫保护情况。【结果】经双酶切鉴定,成功构建了含绿色荧光蛋白报告基因的转移质粒载体pT-UL2-GFP-gpt,将其与DEV共转染CEF细胞后8h,即可见转染细胞中有带有绿色荧光的梭形细胞,经过8轮蚀斑筛选,获得纯化的重组病毒rDEV-△UL2-GFP-gpt;PCR鉴定及基因测序结果显示,GFP标记基因成功地插入到DEV基因组中,替换了DEV UL2基因的196-723位核苷酸;一步生长曲线结果显示,重组病毒在细胞和上清中的病毒含量分别在36h和72h达到峰值,为10^6.2TCID₅₀/0.1mL、10^5.5TCID₅₀/0.1mL,与亲本毒无明显差异;重组病毒在CEF中连续传代,1-5代可以稳定表达GFP基因,第6代起,开始出现少量没有荧光的细胞病变,15-20代中绝大部分细胞病变无绿色荧光,GFP在细胞连续传代过程中容易出现突变;重组病毒以10^3.0TCID₅₀/只免疫麻鸭,免疫后14d能完全抵抗DEV强毒株的攻击,与亲本毒免疫原性一致。【结论】成功构建了表达绿色荧光蛋白的DEV,首次证实UL2基因缺失不影响其在细胞中的复制,也不影响其免疫原性,为DEV UL2基因功能、活载体疫苗研究奠定了基础。     

Ⅰ型鸭肝炎病毒VP1基因重组鸭瘟病毒载体的构建

为了构建含有Ⅰ型鸭肝炎病毒VP1基因的重组鸭瘟病毒,将已建立的鸭瘟病毒TK基因缺失转移载体(pBlueSK-TK-EGFP)进行改造,在其绿色荧光表达盒内插入Ⅰ型鸭肝炎病毒VP1基因,将重组后的转移载体( pBlueSK-TK-EGFP-VP1)转染已感染鸭瘟病毒的鸭胚成纤维细胞.原始病毒液在鸭胚成纤维细胞上盲传3代后...     

表达鸭坦布苏病毒E蛋白的重组鸭瘟病毒的构建及其生物学特性

为开展鸭瘟病毒-鸭坦布苏病毒二联苗的研究,将密码子优化的鸭坦布苏病毒(DTMUV)E基因插入转移载体p EP-BGH-end构建了p EP-BGH-E重组表达质粒。在鸭瘟病毒疫苗株细菌人工染色体(p DEVvac)的基础上,首先通过Red E/T两步重组法构建了EF1启动子替换GFP基因CMV启动子的p DEV-EF1突变体克隆,并将p EP-BGH-E质粒上的重组表达框p CMV-E-BGH-p A再次通过两步重组克隆至p DEV-EF1突变体的US7和US8基因之间,构建了携带有外源基因DTMUV E的突变体克隆p DEV-E。用磷酸钙法转染鸡胚成纤维细胞(CEFs)获得了重组病毒r DEV-E。病毒蚀斑大小测定结果显示,r DEV-E在CEFs上的蚀斑面积较亲本株相比稍有减少。Western blotting分析表明,外源蛋白E在病毒感染的CEFs细胞中成功表达。     

表达H9亚型禽流感病毒HA基因重组鸭肠炎病毒的构建

【背景】H9亚型禽流感病毒（AIV）存在宿主范围扩大、毒力增强的趋势,并为其他亚型AIV重排提供基因,给养禽业和公共卫生造成极大威胁。水禽不仅是流感病毒的宿主,更是其天然储存库,在禽流感病毒的传播和变异中发挥着重要作用。因此有效控制水禽感染对养禽业健康发展、公共卫生安全具有重要意义。鸭肠炎病毒（DEV）属于疱疹病毒,能感染鸭、鹅等雁形目禽类,可引起产蛋下降及高死亡率。DEV基因组大,免疫原性好,具有开发成活疫苗载体的潜力。【目的】构建缺失gE基因、表达H9亚型AIV HA基因的重组病毒rDEV-△gE-HA,探讨重组病毒rDEV-△gE-HA作为防治DEV-AIV的二联重组活载体疫苗的可行性。【方法】以H9N2亚型禽流感病毒HA基因作为靶基因,构建含有HA基因表达盒的转移载体pT-gE-HA,将其与携带绿色荧光蛋白标记的重组rDEV-△gE-GFP共转染CEF细胞后,进行蚀斑筛选、纯化表达HA基因的重组病毒rDEV-△gE-HA;利用PCR、基因测序鉴定重组病毒;在CEF中连续传代重组病毒20次,测定外源基因传代稳定性。以10 ³ TCID₅₀免疫易感鸭,分析重组病毒rDEV-ΔgE-HA对致死性DEV强毒攻毒保护效果;将不同剂量（10 ³-10 ⁶TCID₅₀）rDEV-△gE-HA免疫鸭,免疫后14、21、28 d分别采集血清,测定H9血凝抑制（HI）抗体,并在免疫后28 d,以10 ⁸EID₅₀的剂量静脉注射H9N2 AIV（A/duck/GD/08）,攻毒后2 d,采集喉拭子,进行病毒分离试验。【结果】将构建的转移质粒载体pT-gE-HA与rDEV-△gE-GFP共转染CEF细胞,经过3轮蚀斑筛选,获得纯化的重组病毒rDEV-△gE-HA。PCR鉴定及基因测序结果显示,HA基因成功地插入到DEV基因组中,替换了绿色荧光蛋白。重组病毒在CEF中至少能稳定传代20代。重组病毒rDEV-ΔgE-HA以10 ³ TCID₅₀免疫易感鸭,能抵抗致死性DEV强毒攻击。重组病毒rDEV-ΔgE-HA免疫易感鸭后14 d,各剂量免疫组均能检测到H9 HI抗体效价;免疫后21日,各组抗体效价水平略有上升,10 ³TCID₅₀剂量免疫组HI抗体效价达到1:2 ⁴,而10 ⁴-10 ⁶TCID50剂量免疫组HI抗体效价在1:2 ^2.4-1:2 ³。免疫鸭后28 d,用H9N2 AIV进行攻毒,10 ³、10 ⁴、10 ⁶TCID₅₀免疫组均未从喉拭子分离到病毒H9N2,说明能完全保护,阻止喉头排毒,而10 ⁵TCID₅₀免疫组保护率为80%（4/5）,1/5病毒分离阳性。【结论】成功构建了稳定表达H9亚型AIV HA基因的重组DEV,该重组病毒保留了亲本毒的免疫原性,能抵抗致死性DEV强毒的攻击;免疫鸭后能诱导产生AIV HI抗体,尽管HI抗体滴度不高,但至少80%免疫鸭能阻止排毒。该研究为研制DEV-H9亚型AIV二联重组活载体疫苗奠定了基础。     

表达马立克氏病病毒gI基因的重组鸡痘病毒的构建

以马立克氏病病毒 (MDV) 648株基因组DNA为模板 ,用PCR方法扩增 gI基因 ,将其插入到鸡痘病毒转移载体pFG1 1 75 1 ,通过脂质体方法转染鸡痘病毒 (FPV)感染的鸡胚成纤维细胞 (CEF) ,用蓝斑筛选方法纯化 4次 ,得到重组FPV ,用PCR方法证实 gI已插入到FPV基因组中 ,以间接免疫荧光试验鉴定重组FPV在CEF中表达了 gI基因 ,重组FPV命名为rFPVMDV648gI。     

H9N2型禽流感病毒HA基因在昆虫/杆状病毒系统中的表达

采用异硫氰酸胍法提取禽流感病毒分离株的SPF鸡胚尿囊毒RNA,利用RT-PCR技术扩增出禽流感病毒HA基因的cDNA。将其克隆到pMD18-T中并测序。在去除编码HA信号肽的核苷酸序列后,亚克隆到杆状病毒转移载体pBlueBacHis,筛选到重组质粒,测序正确后与线性化的杆状病毒DNA(Bac-NBlueTMDNA)共转染Sf9昆虫细胞,挑取蓝色蚀斑,经三轮蚀斑纯化,获得数株重组杆状病毒rpBlueBacHisH9HA。提取重组病毒DNA,经PCR证明目的基因片段已插入到杆状病毒基因组中,血凝实验、SDS-PAGE实验结果表明HA基因在重组杆状病毒感染的Highfive细胞中获得了表达。     

鸡传染性喉气管炎病毒河南株gB基因真核表达载体的构建及表达

根据已发表的传染性喉气管炎病毒(ILTV)gB基因序列,设计并合成1对引物,以河南分离株(ILTV-HN)接种10日龄鸡胚,从含痘斑的绒毛尿囊膜中提取基因组DNA扩增gB基因,将扩增片段克隆入pGEM-T Easy载体后,经蓝白斑筛选,菌液PCR和酶切鉴定为阳性的重组菌进行测序,结果表明克隆到ILTV-HN株gB基因,全长为2 629 bp,包含一个完整的开放阅读框.然后将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建真核表达载体pcDNA3.1-gB,转染鸡胚成纤维细胞(CEF),通过RT-PCR检测,转染细胞中含gB基因的mRNA,间接免疫荧光检测,结果表明gB基因在CEF细胞中进行了瞬时表达.     

膜技术分离黄蘑多糖的工艺研究

介绍了膜技术分离、分级、纯化、浓缩黄蘑多糖的工艺;讨论了各个因素对膜分离状况的影响,并确定出较优工艺参数,得到了各级多糖的产品。     

邻苯二甲酸酯对小麦幼苗生理指标的影响

[目的]研究邻苯二甲酸酯对小麦幼苗生理指标的影响。[方法]在不同浓度和不同时间处理条件下研究邻苯二甲酸酯对小麦幼苗叶片的可溶性糖（WSS）、叶绿素、脯氨酸（Pro）和丙二醛（MDA）含量及过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）活性的影响。[结果]在邻苯二甲酸酯胁迫下,不同生理指标所表现出的抗性能力不同。当邻苯二甲酸酯浓度为96μg/kg时,POD、CAT活性及Pro、MDA含量都开始表现出显著抗性反应,抵抗环境胁迫;当邻苯二甲酸酯浓度为384μg/kg时,WSS含量略有下降,虽然不显著,但小麦幼苗细胞可能受到了严重伤害,并且影响到了细胞的正常生理代谢。[结论]该研究为进一步了解邻苯二甲酸酯对小麦幼苗危害的影响机制奠定了基础,为降低土壤邻苯二甲酸酯污染及保障粮食生产的安全性提供了理论依据。     

不同配比菜粕发酵的抗营养因子脱除效果比较

设置8个不同处理的菜粕固态发酵过程,经过72 h发酵,比较不同处理发酵产物的硫苷、异硫氰酸酯和噁唑烷硫酮等3种主要抗营养因子的含量,从而筛选一个最低抗营养因子含量和最高营养提升率的处理.结果表明,处理七(菜粕20 kg、菠萝汁7.5 kg、活化剂0.01 kg、菌种0.10 kg、水2.25 kg)的总脱除效果最好,硫苷、异硫氰酸酯和噁唑烷硫酮的脱除率分别为97.79％、100％和100％,而主要营养成分粗蛋白和小肽的含量相应提升了3.71％和195.16％.     

氮、磷、钾配施及其与铜、硼配施对大豆产量的影响

采用田间小区试验,研究浙春3号大立在不同的氮、磷、钾配施及其与铂或硼配施条件下产量构成因子的变化及各因子之间的相关性。结果表明,氮、磷、钾与硼或钼配施促进了大豆株高的增长,增加了大豆的百粒重、总英数和单株籽粒重,提高了大豆的产量;大豆产量与大豆植株的生物量、株高、单株籽粒重、百粒重和总英数达到显著的正相关,与经济系数及有效分枝数为负相关,氮、磷、钾与硼或钼配施主要通过大幅度提高生物学产量而最终提高籽粒产量;在试验土壤条件下,氮、磷、钾之间的配施比以2：l：l处理的大豆产量最高;氮、磷、钾对大豆产量影响大小的顺序为N＞K＞P。     

APS对感染CDV犬血常规及抗氧化能力的影响

[目的]探讨黄芪多糖（APS）对感染犬瘟热病毒（CDV）犬血常规及抗氧化能力的影响。[方法]选择45d健康、未接种犬瘟热疫苗的幼犬19只,随机分为5组,其中Ⅰ组为空白对照组,Ⅱ组为人工染毒阳性对照组,III组为APS治疗组,IV组为APS与常规治疗结合组,V组为常规治疗组。自人工染毒当日进行治疗,连续治疗5d。各组分别于人工感染前1d及感染后第3、6天于前臂头静脉采血,进行血常规、血清SOD活性和MDA含量测定。[结果]经CDV感染后,血液中RBC、WBC、GRA、Hb含量及SOD活性均降低,MDA含量增加,均显著低于对照组（P〈0.05）。经治疗的各组中,APS和常规治疗对RBC、WBC、GRA、Hb含量及SOD活性均有不同程度的改善,但以APS和常规治疗相结合效果最明显,但与空白对照组仍存在显著差异（P〈0.05）。[结论]APS和常规治疗均可提高人工感染CDV犬的抗氧化能力,但以中西药结合效果较好。     

南通市郊基地农产品铅·镉·砷·汞含量特征与评价

[目的]了解南通市郊基地生产的蔬菜的重金属含量和安全状况。[方法]对南通市郊基地主要生产的豆类、瓜类、绿叶菜类、白菜类、甘蓝类和茄果类6种农产品进行砷、铅、镉、汞4种重金属含量检测,并采用单因子污染指数法及综合污染指数法对重金属污染等级及污染水平进行评价,判断其食用安全性。[结果]试验表明,南通市郊基地6类农产品中重金属铅、镉平均值最高的均为叶菜类,瓜类和豆类的重金属含量最低;农产品的重金属单因子污染指数和综合污染指数均未超过1,污染等级为"安全级",污染水平处于"清洁",食用安全性良好。[结论]研究可为此类基地农产品质量安全评价提供依据,也为深入研究重金属污染来源及富集、转移规律提供参考。     

镉对中间球海胆性腺脂质过氧化的影响

研究了不同浓度的镉离子对中间球海胆Strongylocentrotus intermedius性腺超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)的活性以及丙二醛(MDA)含量的影响.结果显示:低浓度的镉能激活海胆性腺SOD、CAT和GPx的活性,但随着镉离子浓度的增加和时间的延长,3种酶活性都受到不同程度的抑制;各试验组MDA的含量显著高于对照组.说明镉能引起海胆性腺脂质过氧化损伤.     

授粉对度尾文旦柚果皮相关酶活性的影响

研究了利用度柚6号、琯溪蜜柚授粉处理对度尾文旦柚果实发育后期果皮多聚半乳糖醛酸酶(PG)、纤维素酶(CX)及苯丙氨酸裂解酶(PAL)活性的影响。结果表明:授粉处理后,度尾文旦柚果实发育后期PG活性呈上升趋势;CX活性呈下降趋势;PAL活性呈先上升后下降的趋势。     

土壤汞污染胁迫对蚯蚓体内几种抗氧化酶活性的影响

汞是毒性较大的重金属,为了解土壤汞污染对蚯蚓抗氧化防御体系的影响,本文采用人工土壤法,研究了不同Hg暴露浓度水平下(1、2、4、8、16、24、32、50 mg/kg)赤子爱胜蚓(Eisenia foetida)的应激反应,分析了不同浓度Hg污染水平对蚯蚓体内3种抗氧化酶活性以及脂质过氧化最终产物丙二醛(MDA)含量的影响。结果表明,Hg暴露会对蚯蚓抗氧化防御系统产生较大影响。蚯蚓体内超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)和过氧化氢酶(CAT)在不同浓度的Hg暴露水平下,随时间变化呈现出不同的阶段性应激反应。总体上看,Hg暴露环境对赤子爱胜蚓SOD和GSH-PX活性有一定的抑制作用,但对CAT活性的影响无明显规律。Hg暴露对蚯蚓体内MDA含量有一定影响,在32和50 mg/kg的较高浓度水平下,赤子爱胜蚓体内MDA含量明显增加,可能是汞胁迫造成了蚯蚓机体细胞的氧化损伤。     

粘帚霉生防菌株发酵液对大豆幼苗中几种防御酶活性的影响

采用盆栽试验法研究了用粘帚霉生防菌株发酵液处理后的大豆叶片组织内苯丙氨酸解氨酶(PAL)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)的活性变化。结果表明:3个菌株的发酵液处理大豆叶片后,4种酶的活性在大豆叶片中都有明显提高,但不同菌株发酵液处理后的酶活性提高程度不同,酶活高峰出现的时间也不同。处理后第1 d,PAL活性达到高峰,处理后第4 d,PPO活性达到最大值,处理后第5 d,SOD活性和POD活性达到高峰,说明不同的酶在大豆体内发挥作用的时间不同。粘帚霉生防菌株可通过诱导植株防御酶系活性的提高增强植株的抗病性。